Studiare gli effetti dei ligandi paracrini setosecreti dal tumore sull'attivazione dei macrofagi utilizzando la co-cultura con i supporti membrana permeabili

Cancer Research

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Summary

Qui, presentiamo un metodo utilizzando supporti a membrana permeabili per facilitare lo studio della segnalazione paracrina senza contatto utilizzata dalle cellule tumorali per sopprimere la risposta immunitaria. Il sistema è suscettibile di studiare il ruolo dei fattori secreti sul tumore nell'smorzamento dell'attivazione dei macrofaci.

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Pittman, K., Earp, S., Ubil, E. Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports. J. Vis. Exp. (153), e60453, doi:10.3791/60453 (2019).

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Abstract

La segnalazione paracrina derivata dal tumore è una componente trascurata dell'immunosoppressione locale e può portare a un ambiente permissivo per la continua crescita del cancro e la metastasi. I segnali paracrini possono coinvolgere il contatto cellulare tra diversi tipi di cellule, come PD-L1 espresso sulla superficie dei tumori che interagiscono direttamente con PD-1 sulla superficie delle cellule T, o la secrezione di ligandi da una cellula tumorale per influenzare una cellula immunitaria. Qui descriviamo un metodo di co-cultura per interrogare gli effetti dei ligandi seminati dai tumori sull'attivazione delle cellule immunitarie (macrofago). Questa procedura semplice utilizza supporti permeabili a membrana di policarbonato disponibili in commercio da 0,4 m e piastre standard per la coltura dei tessuti. Nel processo descritto, i macrofagi sono coltivati nella camera superiore e nelle cellule tumorali nella camera inferiore. La presenza della barriera di 0,4 m consente lo studio della segnalazione intercellulare senza la variabile di confusione del contatto fisico, perché i due tipi di cellule condividono lo stesso mezzo e l'esposizione ai ligandi paracrini. Questo approccio può essere combinato con altri, come alterazioni genetiche del macrofago (ad esempio, l'isolamento dai topi genetici knock-out) o tumore (ad esempio, alterazioni mediate da CRISPR) per studiare il ruolo di specifici fattori e recettori secreti. L'approccio si presta anche ad analisi biologiche molecolari standard come la reazione a catena della polimerasi di trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) o l'analisi delle macchie occidentali, senza la necessità di smistamento del flusso per separare le due popolazioni cellulari. I saggi immunosorbena legati all'enzima (ELISA) possono essere utilizzati allo stesso modo per misurare i ligandi secreti per comprendere meglio l'interazione dinamica della segnalazione cellulare nel contesto del tipo di cella multipla. La durata della co-cultura può anche essere variata per lo studio di eventi regolati temporalmente. Questo metodo di co-cultura è uno strumento robusto che facilita lo studio dei segnali secreti da tumore nel contesto immunitario.

Introduction

Recenti studi si sono concentrati sulla capacità delle cellule tumorali di evitare il rilevamento da parte delle cellule immunitarie, sopprimere l'attivazione immunitaria locale o di produrre un ambiente tolerogenico permissivo-permissivo nel microambiente tumorale. Sono state descritte due ampie classi di interazioni tumorali e cellulari immunitarie che facilitano questi effetti: interazioni mediate dal contatto o ligando secreti da tumore. Uno dei meccanismi più studiati e clinicamente trattabili dell'inibizione immunitaria mediata dal contatto utilizzata dai tumori è l'espressione del PD-L1, che interagisce con pd-1 sulle cellule T per inibire la loro attivazione e funzione1,2. In risposta all'interferone-gamma (IFNz), che è espresso da un certo numero di cellule immunitarie attivate, le cellule tumorali possono aumentare l'espressione della PD-L1 per indurre l'esaurimento delle cellule T attivate PD-1, impedendo così loro di sradicare efficacemente le cellule tumorali3. L'uso di anticorpi per bloccare l'interazione tra PD-L1 e PD-1 è attualmente utilizzato per trattare più tipi di cancro negli esseri umani4. Alla luce di questo successo clinico e di altri, l'identificazione e il targeting di meccanismi immunosoppressivi derivati dal tumore ha ricevuto una crescente attenzione.

Oltre alla soppressione dell'immunità adattiva, i tumori sono noti anche per secernere fattori che sopprimono le risposte pro-infiammatorie delle cellule immunitarie innate. Le secrezioni di tumore o indotte dal tumore, tra cui IL-6, IL-10, VEGF, IL-23, e il fattore stimolante della colonia (CSF-1), hanno dimostrato di inibire le risposte antitumorali di cellule killer naturali (NK), granulociti e cellule dendritiche nel microambiente tumorale5,6,7. Le cellule tumorali possono anche secernere fattori che distorceno il reclutamento e la differenziazione delle cellule derivate da mieloidi nel microambiente tumorale per promuovere la soppressione dell'attivazione delle cellule T8,9.

Un tipo di cellula immunitaria innata che ha un profondo effetto sulla progressione del tumore è il macrofago. Per molti anni, la presenza di macrofagi associati al tumore (TAM) è stata utilizzata come prognostico negativo della sopravvivenza del paziente10. Il concetto che i TAM immunosoppressi smorzinano la clearance dei tumori mediata dalle cellule immunitarie è stato introdotto più di 40 anni fa11. Più recentemente, è stato dimostrato che la risposta pro-infiammatoria dei macrofafi può essere abbassata mentre un fenotipo pro-tumorale può essere indotto nel microambiente tumorale. Questi macrofagi immunosoppressivi possono contribuire a una risposta tolerogenica, spingendo la progressione del tumore e la resistenza alla chemio e all'immunoterapia12. Dato che i macrofagi sono spesso uno dei leucociti più abbondanti con il tumore, il ripristino della loro attività immunitaria specifica del tumore rappresenta un potenziale bersaglio per le terapie anticancer13.

Mentre le interazioni mediate dal contatto tra cellule tumorali e macrofagi possono essere modellate attraverso la cocultura diretta, l'uso di supporti a membrana permeabili può chiarire quali fattori sevetore sono immunomodulatori senza l'influenza potenzialmente confusa del contatto tra cellule tumorali e immuni. Utilizzando metodi in qualche modo simili, altri hanno dimostrato il potenziale di identificare i fattori secreti nelle interazioni microglia/neuronale14 così come le cellule tumorali con cellule mesoteliane15. Abbiamo anche utilizzato con successo questa tecnica di co-coltura per caratterizzare il ruolo di una proteina sepolmorale, Pros1, come soppressore dell'espressione genica pro-infiammatoria dopo la stimolazione dei macrofagi peritoneali con LPS e interferone-gamma16. Qui descriviamo una metodologia semplice che può essere utilizzata per interrogare il modo in cui i fattori secreti sul tumore possono influenzare l'attivazione dei macrofafi.

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Protocol

Tutte le procedure relative alla raccolta e all'uso di macrofagi murini peritoneali sono state condotte presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill (UNC) e sono state approvate dall'UNC Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Cultura dei Macrofafi

NOTA: questa procedura può utilizzare macrofagi peritoneali primari (descritti in dettaglio di seguito), macrofagi derivati dal midollo osseo o linee cellulari di macrofagi come J774 (ATCC) o RAW264 (ATCC).

  1. Raccogliere macrofagi peritoneali come descritto in precedenza16,17 e piastra direttamente nella camera superiore (s) di un 0,4 m di membrana di poliestere inserto co-cultura 6 bene (Figura 1A).
    NOTA: La resa approssimativa dei macrofagi da ogni isolamento è 1 x 106 celle in totale, quindi il numero medio di celle per pozzo è di 1,5–1,6 x 105 celle in un 6 pozzetti.
  2. Cultura dei macrofagi raccolti nel Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)/F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 1x penicillin/streptomycin, 20 ng/mL macrophage colonia stimolante fattore stimolante (M-CSF) per 3 giorni a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
    NOTA: La camera superiore contiene 1 mL di mezzo di coltura mentre la camera inferiore è riempita con 1,5 mL. Il mezzo deve essere aggiunto ad ogni camera.

2. Cocoltura di cellule tumorali con macrofagi

  1. Prima dell'uso, coltura cellule tumorali disponibili in commercio nel loro rispettivo mezzo seguendo i metodi di coltura dei tessuti ATCC-raccomandato.
  2. Lavare le cellule tumorali aderenti una volta con la salina tamponata da fosfato (PBS), aggiungere 0,05% trypsin - acido etileneaminetracetraacetico (EDTA), e incubare a 37 s fino a quando le cellule si staccano. Risospendere le cellule in FBS contenenti mezzo, quantizzare il numero totale di cellule utilizzando un emocitometro o un contatore cellulare, quindi centrifugare per 5 min a 220 x g al pellet.
  3. Durante la centrifugazione, aspirare il mezzo dalle camere superiore e inferiore delle piastre di supporto permeabili contenenti membrana contenente macrofaci e sostituire con un mezzo fresco.
    1. Per le camere inferiori in cui saranno placcate le cellule tumorali, riempire con 1 mL di mezzo invece di 1,5 mL per consentire un volume sufficiente per l'aggiunta di cellule.
  4. Mezzo aspirato dalle cellule tumorali pelletate e resospendono le cellule in DMEM/F12 con 10% FBS, 1x penicillina / streptomiacina, e 20 ng/mL M-CSF ad una concentrazione di 3 x 105 cellule / mL.
  5. Aggiungere 0,5 mL di 3 x 105 cellule /mL delle cellule tumorali alla camera inferiore dei pozzi desiderati (Figura 1B).
    NOTA: Le celle possono essere trattate immediatamente.

3. Trattamento delle cellule cocoltivate

  1. Per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria dei macrofagi, trattare i macrofagi coscienti o co-coltivati aggiungendo 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.
    1. Variare la durata dei tempi di trattamento in base alle esigenze. L'attivazione del macrofago avviene entro 2 h e una soppressione mediata dal tumore si verifica di 8 h. La co-cultura per 24 h produce una soppressione robusta e coerente derivata dal tumore.
      NOTA: In alternativa, i macrofagi possono essere indotti ad adottare un fenotipo curativo pro-ferito attraverso l'aggiunta di fattori come l'interleucina-10 (IL10) e l'effetto del ligando secreto tumorato valutato.
  2. Come controllo negativo, i macrofagi di coltura sorreggono singly e lasciano non trattati. Come controllo positivo, trattare i macrofagi coltivati in modo runzale con 100 ng/mL IFN e 50 ng/mL LPS.

4. Analisi a valle delle cellule cocoltivate

  1. Dopo che il tempo di incubazione desiderato è trascorso, isolare il mezzo di coltura lisiate o condizionata cellulare come desiderato, a seconda delle esigenze di test.
  2. Per isolare il lisato cellulare per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR), aspirare i media da entrambe le camere del pozzo e lavare una volta con 2 mL di PBS. Applicare il buffer di lisi RNA alla camera superiore contenente i macrofagi. Raschiare delicatamente la membrana per rilasciare il lisato cellulare e trasferirlo in un tubo di raccolta per un'ulteriore elaborazione secondo il protocollo del produttore del kit di isolamento dell'RNA.

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Representative Results

Per determinare l'effetto dei ligandi setosecreti dal tumore sulla polarizzazione dei macrofagi, è stata utilizzata la procedura descritta. I macrofagi peritoneali coltivati in assenza di cellule tumorali sono stati utilizzati come controlli negativi (non trattati e a estrema sinistra) e positivi (IFN e LPS stimolati al2nd da sinistra)(Figura 2A). In alternativa, i macrofagi peritoneali sono stati co-coltivati con cellule tumorali del melanoma B16F10 (ATCC) (Figura 1A). Subito dopo la placcatura, le cellule sono state trattate con IFN e LPS o non trattate. Dopo 24 h di coltura, sono stati raccolti i macrofagi, sono stati preparati l'RNA e qRT-PCR per misurare l'espressione dei geni pro-infiammatori. Utilizzando il sistema di co-cultura descritto qui, mostriamo che i macrofagi peritoneali co-coltivati in presenza di cellule tumorali B16F10, ma senza stimoli di attivazione (LPS , IFN), non hanno aumentato l'espressione di geni filo-infiammatori associati (Figura 2A, B16F10 membrana/non trattata). Ciò implica che i ligandi setosecreti di tumore sono 1) non sono sufficienti da soli per indurre l'espressione genica pro-infiammatoria o 2) se c'è l'attivazione immunitaria da secrezioni tumorali, i ligandi paracrini sono sufficienti per sopprimerlo a livelli ingenui. Questo metodo di co-cultura illustra che quando i macrofagi polarizzati da IFN e LPS sono coltivati in presenza di cellule tumorali, la soppressione dell'espressione genica associata all'infiammazione è stata ridotta di ben il 60%(Figura 2A, B16F10 Membrana) Un livello comparabile di soppressione genica pro-infiammatoria dei macrofagi è stato osservato quando la linea cellulare murina di macrofagi J774 è stata sostituita da macrofagi peritoneali (Figura 2B).

Il nostro lavoro precedente ha identificato Pros1 come un fattore secreto da tumore che può inibire l'attivazione dei macrofafi16. Utilizzando il modello di co-cultura di supporto a membrana permeabile in collaborazione con ELISA, abbiamo modellato la concentrazione di Pros1 in mezzo condizionato dopo 24 h. Abbiamo osservato che in mezzo condizionato da IFN e LPS trattati B16F10 melanoma cellule Pros1 è stato espresso a 475 ng/mL - 120 ng/mL (Figura 3). Macrofagi peritoneali trattati nelle stesse condizioni espressi Pros1 a 61 ng/mL - 5 ng/mL (Figura 3). È interessante notare che, quando co-cultura, il Pros1 all'interno del IFN e LPS trattati bene era 86 ng/mL - 15 ng/mL. Ciò suggerisce che 1) i macrofagi consumano Pros1 o 2 secernoni tumorali) la quantità di Pros1 secreta dalle cellule B16F10 è sostanzialmente diminuita quando in presenza di macrofagi. I risultati di Figura 2 e Figura 3 evidenziano profondi cambiamenti dell'attivazione dei macrofagi e della segnalazione paracrina quando i macrofagi sono co-coltivati con le cellule tumorali.

Figure 1
come illustrato nella Figura 1. Schematica per membrana permeabile supporta la co-coltura delle cellule tumorali con macrofagi. I controlli di trattamento positivi e negativi possono essere applicati ai pozzi di macrofaglia coltivati a singly (A). Per determinare gli effetti dei segnali seminati tumorale sull'attivazione dei macrofagi, i macrofagi sono coltivati nella camera superiore di membrana permeabile supportano piastre di cocoltura e cellule tumorali coltivate nella camera inferiore (B). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
come illustrato nella Figura 2. I segnali paracrini tumorali sopprimono la polarizzazione pro-infiammatoria dei macrofafi. L'espressione dei macrofagi dei geni associati all'infiammazione è stata analizzata da qRT-PCR in macrofagi non trattati o IFN e LPS stimolati in presenza o assenza di cellule tumorali. L'espressione di geni pro-infiammatori è diminuita nei macrofagi peritoneali (A) o nella linea cellulare dei macrofagi J774 (B) quando coltivati in presenza di cellule tumorali separate da un supporto di membrana permeabile in modo che l'effetto fosse trasmesso da un ligando solubile paracrino. -p < 0,05 rispetto a non trattato,p < 0,05 rispetto a IFN e LPS stimolati. I dati sono meschinamente SEM; p valori calcolati dal test t di Student a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
come illustrato nella figura 3. La cocoltura delle cellule tumorali e dei macrofagi porta a cambiamenti nella quantità di ligandi paracrini setoforati dai tumori trovati nel mezzo condizionato. ELISA è stato utilizzato per determinare la concentrazione di Pros1 solo nel tumore, macrofago, o co-coltivato mezzo condizionato dopo 24 h. Co-cultura porta ad una diminuzione della quantità di Pros1 rispetto ai controlli solo delle cellule tumorali. :p < 0,05 rispetto a non trattato. p valori calcolati dal test t di Student a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il saggio di co-cultura qui presentato è una modifica dei saggi stabiliti in precedenza che consente lo studio dei fattori secreti dal tumore sull'attivazione delle cellule immunitarie. Mentre il contatto cellulare è noto per indurre cambiamenti nell'attività immunitaria, la capacità dei ligandi seminati dai tumori di modulare l'attivazione immunitaria è meno ben compresa. Descriviamo un metodo che, a differenza della cocoltura diretta, può essere usato per interrogare come i fattori secreti derivati dai tumori influiscono sull'attivazione delle cellule immunitarie senza la natura confusa della segnalazione mediata dal contatto. Data la potenziale importanza clinica dei ligandi secreti tumorali nell'immunosoppressione, questo metodo offre uno strumento facile da usare per studiare questi meccanismi in modi non affrontati dalla co-cultura diretta.

Essenzialmente, il metodo di co-cultura qui descritto coinvolge la coltura dei macrofagi (cellule primarie: residenti, derivate dal midollo osseo o una linea cellulare dei macrofagi) con cellule tumorali (linea cellulare o cellule primarie) senza contatto fisico. È fondamentale che i macrofagi siano coltivati su un inserto a membrana in poliestere di dimensione dei pori di 0,4 m per consentire la permeabilità libera dei ligandi secreti da tumore, impedendo una possibile migrazione delle cellule macrofaghe attraverso il filtro. È anche importante aggiungere la quantità descritta di mezzo di coltura alle camere superiore e inferiore per garantire una corretta copertura cellulare. La progettazione sperimentale, ad esempio l'inclusione di un solo tipo di cella controlla, è un altro fattore chiave nella pianificazione di esperimenti di cocoltura. Diversi altri fattori, descritti più in dettaglio più avanti, possono anche avere effetti sui risultati del saggio ed è importante tenere ciascuno in mente durante la progettazione dello studio.

Due utili modifiche al protocollo delineato da considerare sono la durata della co-coltura o il relativo rapporto tra le cellule tumorali e i macrofagi. Nel metodo descritto, i macrofagi e le cellule tumorali sono placcati a concentrazioni approssimativamente uguali. Un punto importante da considerare è la proporzione relativa dei macrofagi alle cellule tumorali che si verifica naturalmente nel microambiente tumorale. Per imitare meglio il microambiente tumorale, la proporzione relativa dei macrofagi potrebbe essere alterata per rispecchiare ciò che si trova all'interno del tumore in vivo, anche se il lavoro preliminare può essere necessario per stabilire il rapporto corretto.

Un altro punto critico, e la possibile limitazione del sistema, è che i trattamenti applicati per stimolare un tipo di cellula nel saggio possono avere effetti imprevisti o indesiderati sull'altro tipo di cellula. Come descritto qui, l'aggiunta di LPS e IFN è destinata a stimolare l'espressione genica pro-infiammatoria nei macrofagi. Tuttavia, in Ubil et al. abbiamo dimostrato che IFN, induce anche l'espressione e la secrezione di Pros116immunosoppressivi, e altri hanno mostrato gli effetti dell'LPS sulle cellule tumorali18. È quindi essenziale includere i controlli appropriati per monitorare i potenziali effetti fuori bersaglio o indesiderati sull'altro tipo di cellula per verificare i risultati sperimentali. Un metodo con cui questo può essere raggiunto è trattando i singoli tipi di cellule con gli agenti di interesse e monitorando gli effetti utilizzando analisi di biologia molecolare standard.

Quando si progettano esperimenti di supporto a membrana permeabili, è anche importante considerare possibili gradienti di diffusione di ligandi secreti. Il tasso relativo di secrezione di ligando, la durata della co-cultura e se la piastra di coltura è mantenuta in una posizione stazionaria possono tutti avere effetti sui risultati. Inoltre, è possibile che alcuni ligandanti secreti aderiscano alla superficie delle piastre di coltura.

Mentre i risultati rappresentativi mostrati sono caratteristici di questo sistema, il grado di soppressione genica pro-infiammatoria osservato durante la co-coltura di altre linee tumorali può variare notevolmente. In Ubil et al., mostriamo che alcune linee tumorali umane possono quasi completamente sopprimere l'espressione genica pro-infiammatoria di una linea cellulare macrofacio umana16. Al contrario, altri tipi di cellule tumorali o linee cellulari possono variare sostanzialmente nelle loro capacità immunosoppressive. La causa di queste varianze non è chiara, ma è un'area per ulteriori studi.

La co-cultura del supporto alla membrana permeabile è una metodologia robusta che può essere facilmente modificata per rispondere a una varietà di domande e può essere adattata a una serie di letture di biologia molecolare, tra cui qRT-PCR, western blot ed ELISA. Il sistema può essere utilizzato per interrogare singole funzioni geniche, come legamenti o recettori, quando alterazioni genetiche come quelle provenienti da topi cancellati dal gene o modifiche CRISPR vengono apportate ai macrofagi o alle cellule tumorali. Il sistema è anche suscettibile allo studio di attivatori farmacologici o inibitori e dei loro effetti sulla segnalazione paracrina. Inoltre, anche se non discusso qui, il sistema può essere utilizzato per studiare gli effetti dell'attivazione immunitaria sull'espressione genica delle cellule tumorali.

Questo metodo è stato utilizzato con successo nella scoperta e nella caratterizzazione di una nuova funzione per un ligando immunosoppressivo secreto da tumori. Questo robusto strumento può essere utilizzato per interrogare il sottoinsieme molto più ampio di interazioni tumorali/immuni senza contatto nella speranza di scoprire nuovi bersagli terapeutici.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Eric Ubil è stato finanziato, in parte, dalla American Cancer Society Postdoctoral Fellowship (128770-PF-15-216-01-LIB). Il lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del NIH (R01-CA205398) e da un premio della Breast Cancer Research Foundation (BCRF-18-041) all'HSE.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B16-F10 ATCC ATCC CRL-6475
cDNA synthesis kit Promega A3500
DMEM/F12 media ThermoFisher Scientific- Gibco 11320033
Fetal Bovine Serum Millipore TMS-013-B
J774A.1 ATCC ATCC TIB-67
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L5293-2ML
Murine M-CSF Prospec CYT-439
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific- Gibco 15140122
Pros1 ELISA MyBioSource MBS2886720
RAW264.7 ATCC ATCC TIB-71
Recombinant Mouse IFNγ BioLegend 575302
Sensimix SYBR Low-ROX kit Bioline QT625-05
Transwell permeable supports Fisher Scientific 07-200-170
Trypsin-EDTA ThermoFisher Scientific- Gibco 25200056

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References

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