قياس ديناميات الأنابيب المجهرية بواسطة المجهر القرص الغزل في المغزل ميتوتيك القطب

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

نقدم هنا طريقه قويه ومفصله لتحليل ديناميات البولية المجهرية في الخلايا المتزامنة في طليعة باستخدام الخلية الحية الغزل القرص المجهري المجهر ومعالجه الصور المستندة إلى matlab.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Movsisyan, N., Pardo, L. A. Measurement of Microtubule Dynamics by Spinning Disk Microscopy in Monopolar Mitotic Spindles. J. Vis. Exp. (153), e60478, doi:10.3791/60478 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ونحن نقدم وصفا لتعديل طريقه محدده لتحديد ديناميات البولية الصغيرة في الخلايا الحية. ويستند البروتوكول علي التعبير عن علامة المشفرة وراثيا لغايات ايجابيه من الأنابيب الدقيقة (EB3 الموسومة مع بروتين الفلورسنت tdTomato) وعاليه السرعة, عاليه الدقة, التصوير الخلوي الحي باستخدام القرص الدوار المجهر المجهري. يتم تحقيق تزامن دوره الخلية وزيادة كثافة الأنابيب الدقيقة من خلال تثبيط الانفصال الوسطي في الخلايا المتصوقيه ، ويتم اجراء تحليل النمو باستخدام برنامج المسار المفتوح المصدر. ان استخدام بروتين فلوري مشرق واحمر اللون ، بالاشتراك مع طاقة الليزر المنخفضة ووقت التعرض المنخفض المطلوب لدوران القرص المجهري يقلل من السمية الضوئية واحتمال القطع الاثريه المستحثة ضوئيا. وهذا يسمح بتصوير عدد أكبر من الخلايا في نفس الاعداد مع الحفاظ علي الخلايا في وسط النمو في ظل ظروف الثقافة القياسية. ونظرا لان التحليل يتم بطريقه تلقائية خاضعه للاشراف ، فان النتائج قويه إحصائيا وقابله للتكرار.

Introduction

الأنابيب المجهرية (MTs) هي هياكل ديناميكية للغاية وجدت في جميع الخلايا الحقيقية النواة تقريبا وفي بعض البكتيريا1. مع [اكتين] وخيوط متوسطه, ينحت هم [ستوسيكلتون]2,3. تقسيم الخلية4، جزيء النقل5، الضرب الصواري6، والإحساس من البيئة المحيطة من خلال الابتدائية هدب7، السمع (kinocilium)8،9، الاجنه10،11،12، الغزو وورم خبيث13،14، وحتى تكوين الذاكرة15،16،17،18، والعديد من العمليات الأخرى تعتمد أساسا علي MTs. سيكون من المستحيل مشاركه الmts في جميع هذه الاحداث دون قدرتها الملحوظة علي التحول بسرعة بين النمو (البلمره) والانكماش (التحلل). وصفت هذه الخاصية بأنها عدم الاستقرار الديناميكي19. يتم تغيير MT ديناميستي في العديد من الحالات المرضية20،21،22. التالي ، فان تحديد طبيعة هذه الخاصية يمكن ان يساعد علي فهم أليات المرض وبعد ذلك معالجتها.

وقد وضعت قائمه طويلة من الأساليب لتحليل ديناميات MT, معظمها تستند إلى تقنيات التصوير23. في البداية ، تم استخدام المجاهر الضوئية واسعه المجال لمراقبه تشكيل أنابيب البوليمرات في المختبر24. الاكتشاف من [ند-كندينغ] ([ب])-بروتينات ان يجمع في [مت] [بلس-نهاي] والتطوير الطرق إلى فلوريسسينتلي تسميه بروتينات جعل هو يمكن ان يلاحظ التصرف ال [MTs] مباشره في [ليفينغ سل] مع مجال واسعه و [كونككلر] مجاهر مجهر25,26,27. واحده [آيب-بروتين] [ند-بيندينغ] بروتين 3 (EB3)28; من خلال التعبير المفرط وتتبع EB3 تنصهر إلى بروتين الفلورسنت ، يمكن تحديد معدلات التجميع MT plus-نهاية29،30.

وكثيرا ما يستخدم المجهر الضوئي الليزر البؤري المجهري (CLSM) لمتابعه ديناميات MT. ومع ذلك ، فان تقنيه التصوير هذه تشكل خطرا عاليا من السمية الضوئية والرشح الضوئي ، وهما عمليتان غير مرغوب فيهما للخلايا الحية وعينات التصوير الخافتة31. من أجل الحصول علي نسبه أفضل من الاشاره إلى الضوضاء ، يجب ان تكون قوه الليزر ومده التعرض عاليه بما يكفي في حين لا تضر العينات ، وهذا يتطلب التضحية بالقرار في مقابل السرعة. بديل مناسب ل CLSM هو الغزل القرص المجهر32. ويستند هذا الأسلوب التصوير علي استخدام القرص Nipkow33، والذي يتكون من قرص متحرك تحمل مجموعه من الثقوب ، ويعمل اي ما يعادل إلى العديد من المجاهر CLS التصوير نفس العينة في وقت واحد34. ولذلك ، فان الضوء من الليزر سوف تضيء عده مناطق في العينة في وقت واحد ولكن الحفاظ علي الطبيعة المحورية. التالي ، فان قرص Nipkow يسمح بالحصول علي صور مشابهه ل CLSM ولكن بشكل أسرع وباستخدام طاقة ليزر اقل. تم تحسين القرص Nipkow كذلك من قبل Yokogawa الكهربائية, التي أدخلت القرص الثاني مع مجموعه من العدسات الدقيقة علي ذلك ان الضوء المباشر بشكل فردي في ثقب الدبوس المعنية, مزيد من الحد من السمية الضوئية والتصوير الضوئي35. وهكذا, الغزل القرص الليزر المسح المجهري أصبحت طريقه الاختيار للتصوير الخلية الحية, ويجعل من الممكن الحصول علي الصور مع ارتفاع نسبه الاشاره إلى الضوضاء في سرعه عاليه31,36, وهو أمر حاسم لحل الإشارات مثل تلك من نهايات MT سريعة النمو.

ديناميات MT تختلف مؤقتا. علي سبيل المثال ، ميتيك MTs هي أكثر ديناميكية من تلك المرحلة البينية37،38. المثل ، لوحظت الاختلافات في معدل النمو والانكماش حتى داخل نفس مرحله دوره الخلية ، مثل انقسام39،40. لذلك ، لتجنب جمع البيانات الزائفة ، يجب ان يقتصر قياس ديناميات MT علي اطار زمني ضيق اثناء دوره الخلية. علي سبيل المثال ، يمكن تحقيق قياس ديناميات MT في طليعة عن طريق علاج الخلايا مع dimethylenastron (DME) ، وهو التناظرية monastrol الذي يمنع المحرك كينيسن Eg541 ويمنع تشكيل المغزل القطبين القطبية42. تثبيط الخلايا في طليعة مع مثبطات Eg5 DME وغيرها من المشتقات monastrol لا يؤثر علي mt ديناميات43،44،45، مما يجعل من DME أداه مفيده لدراسة ديناميات mt علي حد سواء في الخلايا الثابتة والحية44.

هنا نحن الجمع بين طريقه تحليل ديناميات MT في الخلايا بروتافاز الموصوفة من قبل Ertych وآخرون44 مع التصوير المزدوج القرص الغزل. يسمح هذا الأسلوب قياس ديناميات MT في الخلايا prometase التي تم جمعها من المستوي البؤري واحد مع معدل التصوير اعلي ، ولكن دون الرشح الضوئي والحد الأدنى من السمية الضوئية. وعلاوة علي ذلك ، وكمراسل الفلورسنت ، ونحن نستخدم البروتينات الفلورية ديمر الطماطم (tdtomato) التي تحسنت السطوع والاستقرار الضوئي بالمقارنة مع البروتين الفلوري الأخضر (egfp) ومتحمس مع انخفاض الطاقة الخفيفة46. لذلك ، يتطلب tdTomato طاقة ليزر اقل للاثاره واقل سميه ضوئيه. الإجمال ، فاننا نقوم بتحسين الطريقة من خلال الحد من السمية الضوئية وتحسين الدقة والمعالجة اللاحقة المطلوبة لتحليل ديناميات MT. بالاضافه إلى ذلك ، نقوم بإنشاء أساس للتعديلات المستقبلية للأسلوب عن طريق الجمع بينها وبين تقنيات التزامن الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. بذر الخلايا هيلا

  1. اعداد 2 مل من 5 ميكروغرام/مل الفيبرونكتين جنيني الحل في الفوسفات مخزنه المالحة (التلفزيونية) وأضافه 450 μl منه في كل بئر من 4 بشكل جيد مكفرشفه (#1.5). احتضان الشريحة لمده 15 دقيقه في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  2. شطف خلايا هيلا المتنامية بشكل غير متزامن مع الفوسفات المخزن في دولبيكو المالحة (DPBS) واحتضان مع تريبسين-أدتا (0.05 ٪: 0.02 ٪ ؛ w:v) لمده 5 دقائق في 37 درجه مئوية. وقف رد الفعل الانزيمي باضافه معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تستكمل مع 10% الحرارة المعطلة الجنين الساق المصل (FCS) في 3:1 (v:v) نسبه المضافة التريبسين-أدتا.
    ملاحظه: تم الحفاظ علي الخلايا هيلا في RPMI 1640 المتوسطة تستكمل مع 10 ٪ FCS الحرارة المعطلة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2 وكانت تمر بشكل روتيني مره واحده وصلوا 80-90 ٪ كونفلوينسي كما هو موضح أعلاه.
  3. تحديد تركيز الخلية باستخدام غرفه نيوبوير. اخلط 50 μL الخاصة بتعليق الخلية باللون الأزرق التريبين عند 1:1 (v:v) نسبه ، أعاده التعليق ، ونقل 10 μL من التعليق إلى الغرفة. احسب فقط الخلايا السالبة الزرقاء الموجودة داخل المربعات الاربعه الكبيرة (للاطلاع علي التفاصيل ، انظر Phelan et al.47). اشتقاق تركيز الخلية من رقم الخلية المحسوب باستخدام الصيغة التالية:
    Equation 1
  4. بيليه الخلايا بواسطة طرد في 300 x g لمده 2 دقيقه. أعاده التعليق مع rpmi 1640 الطازجة من أجل الحصول علي 1 × 106 خلايا/مل.
  5. قم بازاله الفيبروكتين من المشبك الذي تم تنظيفه ، واغسل الآبار مرتين باستخدام DPBS ، والبذور 50,000 خلايا لكل بئر.
  6. العودة المشتركة في الزنزانات مع الخلايا إلى الحاضنة وتنمو لهم ل 24 ح في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.

2. التعبير عن pEB3-tdTomato في الخلايا هيلا

  1. اعداد أنبوب الطرد المركزي الصغير 1.5 mL. لكل أنبوب ، تمييع 2 ميكروغرام من pEB3-tdTomato48 مع العازلة ترانسفيكشن (المنتج الاصطناعية في محلول مائي) إلى حجم النهائي من 396 μl.
  2. أضافه 4 μL من الكاشف المتحول (غير الدهون ، التي تحتوي علي بوليثيلينمين) إلى الأنبوب الأول ، ودوامه الخليط علي الفور لمده 10 ليالي بالبالضبط.
  3. تدور لفتره وجيزة أسفل الأنبوب مع الطرد المركزي الصغير واحتضان في درجه حرارة الغرفة (RT) لمده 10 دقيقه.
  4. أزاله الخلايا هيلا من الحاضنة. القطرات ، أضافه 100 μL من خليط التحويل إلى كل بئر من 4 بالاضافه إلى ذلك ، وأعاده الخلايا إلى الحاضنة.
  5. بعد 4 ح من الحضانة في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، تكمله الخلايا مع النمو الطازج المتوسطة واحتضان لمده 24 ساعة علي الأقل في 37 درجه مئوية و 5 ٪ co2.
    ملاحظه: من الضروري تحسين ظروف التحويل لكل نوع من أنواع الخلايا. يجب ان تكون مستويات التعبير منخفضه بما يكفي للسماح بتحديد نهايات النامية MT واحد. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام خط الخلية التعبير بثبات EB3-tdTomato في التجارب. هذا من شانه ان يقلل من التباين في مستويات التعبير من EB3 بين الاستعدادات وبين الخلايا من نفس الاعداد49.

3. التزامن والتصوير الخلوي الحي لpEB3-التعبير عن الخلايا هيلا

  1. اعداد محلول 2.5 μM من ديميثيلسيناستراو (DME) في الفينول الأحمر الحرة دولبيكو النسر المعدلة المتوسطة (DMEM) تكمله مع 10 ٪ FCS و 2 مم L-الجلوتامين أو العرض الجلوتامين البديلة.
  2. استبدال المتوسطة النمو في الكوفيرسليب مع 500 μl من متوسط النمو التي تحتوي علي 2.5 μM DME واحتضان الخلايا في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2.
  3. بعد 3.5 h من الحضانة مع DME ، نقل الخلايا إلى المجهر ، وجبل كوفيرسليب حجره في غرفه البيئية مع لوحات الظلام للتصوير في 37 درجه مئوية و 5 ٪ CO2، ومزيد من احتضان حتى وقت الحضانة الإجمالي هو 4 ساعة.
    ملاحظه: الحفاظ علي درجه الحرارة عند 37 درجه مئوية بدون تذبذب أمر حاسم بالنسبة للتجربة.
  4. أداء التصوير الفاصل الزمني علي المجهر المقلوب مجهزه 100x 1.49 N.A. الغمر النفط الهدف ، والمزدوج الغزل القرص الدوار النظام ، ونظام التركيز البؤري التلقائي موثوق بها للصيانة المستمرة للمستوي البؤري. تحديد معلمات التصوير كما يلي.
    ملاحظه: نحن نستخدم الكترون ضرب الجهاز بالاضافه إلى اله الكاميرا (EM-CCD).
    1. ل EB3 الاثاره ، واستخدام خط ليزر 561 nm مع الوقت التعرض 200 ms. جمع الضوء المنبعث من خلال تمريره رباعيه (405 ، 488 ، 561 ، 640 nm) مراه ديشروريك ومرشح الانبعاثات 600/52 nm.
      ملاحظه: ويمكن تعديل قوه الليزر لكل خليه العمر لمنع تشبع الصورة. في جميع الأفلام الفاصلة الزمنيه المعطية هنا تم تعيين طاقة الليزر إلى 5.3 ميغاواط.
    2. العثور علي خليه في طور والتركيز في Z-الطائرة المقابلة لمركز المغزل القطب الدوار. الحصول علي الصور كل 0.5 s علي ما مجموعه 1 دقيقه مع عدم التسلق ولا الاضاءه بين التعرض.

4. تحليل ديناميات MT باستخدام U-المسار الخامس 2.2.0

  1. لتحليل ديناميات MT البرمجيات الرقمية بيئة الحوسبة مطلوب (علي سبيل المثال ، MATLAB).
    ملاحظه: الفهم الأساسي للبرمجيات كافيه للتحليل. مواد المساعدة الشاملة والدروس المتاحة علي موقع المطور (https://uk.mathworks.com/products/matlab/getting-started.html).
  2. تحميل (https://github.com/DanuserLab/u-track) وتثبيت البرنامج المفتوح المصدر u-المسار الخامس 2.2.0 البرمجيات بعد التعليمات المفصلة الواردة في ملف "Readme_u-المسار. pdf"50,51,52.
  3. بدء تشغيل برنامج التحليل العددي وأضافه مجلد 2.2.0 v المسار مع الملفات الفرعية في مسار البحث عن البرامج.
  4. من اطار الأوامر المكالمة "Movieselectorgui". وهذا يفتح نافذه الحوار التي يمكن من خلالها استيراد الملفات الخام التي تم إنشاؤها بواسطة برنامج الحصول علي الصور في المجهر (الشكل التكميلي 1، الشكل 2، الشكل 3، الشكل 4).
    ملاحظه: يتوافق برنامج U-Track مع تنسيقات بيانات الصور الأخرى. ويستخدم الاشكال الحيوية ، والتي تعترف مختلف اشكال البيانات العلوم الحياة53.
  5. يتم قراءه حجم كل صوره من بيانات التعريف تلقائيا. ادخل الفتحة العددية للهدف (في هذه الحالة 1.49) والفترة الزمنيه (0.5 s) المستخدمة في التصوير يدويا (الشكل التكميلي 1B). بالاضافه إلى ذلك ، يمكن أيضا توفير معلومات عن الطول الموجي للاثاره ، والفلوريد ، ووقت التعرض ، ولكنها ليست حاسمه لمزيد من التحليل.
  6. بمجرد تحميل جميع الصور ، احفظ سلسله الفواصل الزمنيه التي تم إدخالها كقائمه أفلام عن طريق تحديد "حفظ باسم قائمه الأفلام". علي الجانب الأيمن من نافذه الحوار حدد الخيار "U-المسار" واضغط علي "مواصله" (الشكل التكميلي 1c).
    ملاحظه: يتم تحسين القيم للخلايا هيلا. في حاله التبديل إلى خط خليه مختلف ، يجب تعريف القيم مره أخرى. بدلا من ذلك ، استخدم الإعدادات الموصي بها من قبل مطوري البرامج. ويمكن الاطلاع علي شرح مفصل لكل من المعلمات وكيفيه تعريفها في التقرير الفني المقدمة مع الإصدار السابق من البرنامج ، plusTipTracker50.
  7. من النافذة المنبثقة حدد "ميكروتوبولي زائد نهايات" واضغط علي "Ok" (الشكل التكميلي 1c). وتتيح نافذه الحوار الجديدة تحديد بارامترات الخطوات الثلاث للتحليل (الشكل التكميلي 1 د) ، وهي الكشف والتتبع وتحليل المسار.
  8. في الخطوة 1 اختر "إعدادات" ومن القائمة المنسدلة حدد "الكشف عن المذنب" كطريقه الكشف (الشكل التكميلي 2B).
    1. من نافذه الحوار الجديدة تحديد المعلمات للفرق من فلتر Gaussians وتقسيم مستجمعات المياه علي النحو التالي (الشكل التكميلي 2C): عمليه قناع لاستخدامها للكشف = لا شيء ؛ انخفاض تمرير الانحراف المعياري غوسيه = 1 بكسل; عاليه تمريره غوسيه الانحراف المعياري = 3 بكسل; عتبه الحد الأدنى = 3 الانحرافات القياسية; عتبه حجم الخطوة = 0.25 الانحرافات القياسية. حدد "تطبيق الإعدادات علي كل الأفلام" و "تطبيق".
  9. في الخطوة 2 ، يتم تعريف المعلمات للربط ، وإغلاق الفجوة ، ودمج وتقسيم ، ووظائف التصفية كالمان في ثلاث خطوات كما هو موضح في الوردي والأخضر والأزرق ، وفقا لذلك (الشكل التكميلي 3B). لهذه الخطوات ، حدد "ميكروتوبولي بلس-النهاية ديناميات" ومن الخيار "اعداد" تعريف القيم كما هو موضح في الشكل التكميلي 3C-E، علي التوالي.
    1. بالنسبة للمشكلات المتعلقة بالابعاد ، اختر "2" من القائمة المنسدلة. استخدام الحد الأقصى للفجوة لإغلاق = 5 إطارات; الحد الأدنى لطول مقاطع المسار من الخطوة الاولي = 3 إطارات. كما كان من قبل ، حدد "تطبيق الإعدادات علي جميع الأفلام" وانقر علي "تطبيق".
  10. في الخطوة 3 من التحليل ، يتم تصنيف مسارات MT المكتشفة (الشكل التكميلي 4). وكطريقه لتحليل المسارات ، اختر "تصنيف ديناميات الميكروبوليه" وحدد المعلمات من خلال زر "الاعداد" كما هو مبين في الشكل التكميلي 4 ب ، ج. بعد ذلك ، اختر مربع "تطبيق الإعدادات علي جميع الأفلام" وانقر علي "تطبيق".
  11. مره واحده يتم تعريف جميع المعلمات ، من "لوحه التحكم-U-المسار" نافذه (الشكل التكميلي 1d) حدد "تطبيق الاختيار/إلغاء التاشير علي جميع الأفلام" و "تشغيل جميع الأفلام" مربعات واضغط علي "تشغيل". سيبدا هذا التحليل الخاص بسلسلة الفواصل الزمنيه.
  12. بمجرد اكتمال معالجه الفيلم ، يتم عرض رسالة "تمت معالجه الفيلم (الأفلام) الخاصة بك بنجاح". اضغط علي "Ok" ، ثم "حفظ".
  13. الآن فمن الأمن لإنهاء برنامج التحليل العددي. يتم تخزين النتائج من معالجه الفيلم في بنيه المجلدات الفرعية كملفات m في المجلد حيث يتم تخزين الملفات الاوليه.

5. التحليل الإحصائي لديناميات MT

  1. استيراد الملفات m إلى برنامج تحليل إحصائي المفضل.
    ملاحظه: في حالتنا ، نقوم أولا باستيراد الملفات في جدول بيانات قياسي لجعلها قابله للقراءة. تحتوي الملفات m علي المعلومات الاحصائيه (المتوسط والمتوسط والانحراف المعياري) علي معلمات مختلفه (علي سبيل المثال ، سرعه النمو ، دينامسيتي MT). وترد قائمه مفصله من المعلمات في التقرير الفني المقدمة مع النسخة السابقة من البرنامج ، plustiptracker50،52. يمكن أيضا استيراد ملفات m التي تم إنشاؤها إلى برامج معالجه البيانات الأخرى.
  2. اختر المعلمة "متوسط سرعه النمو" واستيرادها إلى جدول للإحصاءات والعرض. ادخل المعلومات الخاصة بالمعلمات الأخرى ، (علي سبيل المثال ، "ديناميستي") اما في جدول جديد أو في عمود جديد من نفس الجدول والمؤامرة المجمعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وبعد البروتوكول المحدد المبين في الشكل 1A، تم التعبير عن pEB3 في خلايا هيلا المتنامية بصوره غير متزامنة. تمت مزامنة الخلايا 48 h بعد التحويل في طليعة من خلال العلاج DME (الشكل 1b). وكفلت هذه الخطوة ان يكون قياس ديناميات MT دائما في نفس المرحلة من دوره الخلية. وتمت معالجه وتحليل الأفلام ذات الفواصل الزمنيه بالاضافه إلى المسار الخامس 2.2.0 علي النحو المبين في الوثائق التكميلية50،51،52. علي الرغم من ان البروتينات ربط نهاية الزائد تتبع فقط مراحل النمو MT, 2.2.0 v المسار استقراء المعلومات علي وقفه وانكماش الاحداث من خلال ربط مراحل النمو المتسلسل وأعاده بناء مسارات كامله26,50. وتستند الخوارزميه إلى اطار التتبع العالمي المكاني والوقتي الذي وصفه السيد جاقمان وآخرون51.

ومن المهم ملاحظه ان حساسية التحليل ودقته يعتمدان بشده علي عده بارامترات للتحليل. ثم تم تعديل المعلمات الموصوفة للتاثير بشكل كبير علي تحليل50، مثل "الحد الأقصى لطول الفجوة" و "عامل الانكماش الأقصى" لنفس المجموعة من الأفلام الفاصلة الزمنيه (الفيديو 3 و 4 ، علي التوالي). وترد القيم المناظرة لسرعه النمو والدينامية في الشكل 1E و F كمربعات حمراء ومثلثات زرقاء علي التوالي. ولم تتاثر سرعه النمو الناتجة تاثرا شديدا. ومع ذلك ، كانت القيم التي تم الحصول عليها لديناميكية مختلفه بشكل كبير عندما تم تعديل "الحد الأقصى لطول الفجوة" ، في حين انه بقي دون تغيير عند تغيير "عامل الانكماش الأقصى". وكما هو مبين في الشكل 1 دال، كان الكشف عن المسارات الفرعية لMT قويا بالمثل في الحالات الثلاث جميعها. ومع ذلك ، فان أعاده بناء مسارات MT الكاملة تاثرت في معظم الأحيان عندما تم تعيين "الحد الأقصى لطول الفجوة" إلى 15 (الشكل 1D، الصور الملحقة). علاوة علي ذلك ، من أجل تقييم ما إذا كانت ظروف التصوير تتداخل مع سلوك MT ، تم تحليل الاولي (1-61 اطارا) والثانية (61-121 اطارا) من سلسله الفاصل الزمني بشكل منفصل ومقارنه سرعه النمو المقابلة وقيم الديناميكية (الشكل 1G ، H، علي التوالي). وكما كان متوقعا ، لم تكتشف اي اختلافات كبيره بين جزاي سلسله الفواصل الزمنيه. في أشرطه الفيديو 1 – 8 صور الفاصل الزمني للخلية الانقسام متزامنة في طور والتعبير عن EB3 وتعطي (المدة = 1 دقيقه; الفاصل = 0.5 s).

Figure 1
الشكل 1: تحليل ديناميات MT في الخلايا هيلا متزامنة في البروتافاز. (ا) موجز للخطوات التي اتخذها البروتوكول. (ب) التمثيل التخطيطي لليه بورصة دبي للطاقة بوساطة تشكيل مغزل أحادي القطب. (ج) مونتاج للإطارات العشرة الاولي من فيلم الفاصل الزمني الذي تمت معالجته باستخدام برنامج المسار الثاني مع كل اطار ثان يظهر. وتتميز المسارات المكتشفة لنمو MT باللون الأحمر. (د) عرض السلسلة الزمنيه لملف الصورة الخام وبعد تتبع الطن المتري باستخدام الإعدادات الموصوفة في البروتوكول ("الأمثل") ، وعند تغيير اما "الحد الأقصى لطول الفجوة" أو "عامل الانكماش الأقصى". وتمثل المجموعات مسارات MT الكاملة ، التي تتكون من النمو (الأحمر) ، وقفه (الضوء الأزرق) ، انكماش (الأصفر) ، وأعاده تصنيف fgap كما النمو (الأخضر) و bgap أعاده تصنيفها كوقفه (الأزرق الداكن) الاحداث. وتعني سرعه النمو (E) وتظهر القيم ديناميستي (F) ، والنتائج باستخدام اي من المعايير المثلي المقترحة (الدوائر السوداء) ، وطول الفجوة القصوى تعيين إلى 15 (المربعات الحمراء) ، أو عامل انكماش القصوى تعيين إلى 1.0 (المثلثات الزرقاء) يتم رسمها (ن = 45 الخلايا ؛ يعني ± SEM ؛ تحليل ANOVA في اتجاه واحد مع tukey اختبار مخصص للمقارنة متعددة). وتعني سرعه النمو (G) وتظهر قيم ديناميستي (H) لأول (1-61 اطارا) والثانية (61-121 إطارات) نصف الأفلام الفاصلة الزمنيه (ن = 45 خلايا; يعني ± SEM; غير المقترنة اختبار t مع تصحيح ويلش). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

الفيديو 1: الصورة الاوليه الفاصلة الزمنيه التمثيلية لخليه بروتافاز قبل التحليل. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 2: الكشف عن وتتبع MTs في خليه في الفيديو 1 باستخدام الإعدادات المقترحة لبرنامج المسار U. نفس الصورة الفاصلة الزمنيه في الفيديو 1 معالجتها مع المسار الخامس 2.2.0 البرمجيات باستخدام الإعدادات الموصوفة ، ويتم وضع علامة علي مسارات النمو المكتشفة باللون الأحمر. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 3: الكشف عن وتتبع MTs في خليه في الفيديو 1 باستخدام قيمه غير مثاليه ل "الحد الأقصى لطول الفجوة". نفس الصورة الفاصلة الزمنيه في الفيديو 1 معالجتها مع U-المسار الخامس 2.2.0 البرمجيات باستخدام نفس الإعدادات كما كان من قبل ، ولكن مع "الحد الأقصى لطول الفجوة" تعيين إلى 15. لم يتم تغيير بقية المعلمات. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 4: الكشف عن وتتبع MTs في خليه في الفيديو 1 باستخدام قيمه غير مثاليه ل "عامل الانكماش الأقصى". نفس الصورة الفاصلة الزمنيه في الفيديو 1 معالجتها مع U-المسار الخامس 2.2.0 البرمجيات باستخدام نفس الإعدادات كما كان من قبل ، ولكن مع "عامل الانكماش الأقصى" تعيين إلى 1. لم يتم تغيير بقية المعلمات. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 5: مثال علي سلسله الفاصل الزمني للخلية التي تحتوي علي حطام الخلية. وبعد التحليل ، اكتشفت البرمجيات أيضا بعض الحطام الخلوي اثناء تتبع التتابع المتري. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 6: البيانات الاوليه المقابلة للفيديو 5. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 7: مثال علي سلسله الفاصل الزمني للخلية مع تعبير عاليه من EB3-tdTomato مما ادي إلى ضعف تعريف النصائح المتزايدة. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

الفيديو 8: البيانات الخام المقابلة للفيديو 7. يرجى النقر هنا لمشاهده هذا الفيديو. (انقر بزر الماوس الأيمن للتحميل.)

Supplementary Figure 1
الشكل التكميلي 1: سير العمل في التحليل باستخدام برمجيات المسار السريع. (ا) تخطيطي للخطوات التي يستخدمها البرنامج. (ب) لقطه شاشه من المستورد الاشكال الحيوية تبين كيفيه استيراد ملفات الفاصل الزمني. (ج) بعد تحميل الملفات ، يتم تحديد U-المسار مع وحده MT بالاضافه إلى نهايات. (د) لقطه شاشه من لوحه التحكم من المسار U حيث يتم تحديد إعدادات الكشف عن المذنب ، وتتبع ، وتحليل المسار. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 2
الشكل التكميلي 2: وصف الخطوة الاولي من التحليل ، كشف المذنب. (ا) لمحه عامه عن الاحداث الرئيسية التي قامت بها الخوارزميه. (ب، ج) يتم إعطاء لقطات من البرنامج مع القيم المثلي المشار اليها. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 3
الشكل التكميلي 3: وصف الخطوة الثانية من التحليل ، تتبع المذنب. (ا) الخطوات الرئيسية التي تقوم بها الخوارزميه مبينه. (ب) يتم إعطاء لقطه شاشه للوحه "التتبع". يتوافق الحد الأقصى لإغلاق الفجوة مع الحد الأقصى لطول الفجوة ويتم تعيينه إلى 5. تتبع ثلاث خطوات فرعيه تم تمييزها بالمستطيلات الحمراء والخضراء والزرقاء. (جيم،دال،هاء) يتم إدخال القيم العددية الضرورية لكل خطوه فرعيه هنا. يتم تعيين عامل الانكماش الأقصى إلى 1.5 علي النحو المبين في (د). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Supplementary Figure 4
الشكل التكميلي 4: وصف الخطوة الاخيره من التحليل ، تتبع التحليل. (ا) يتم خلال هذه الخطوة تصنيف المسارات المركبة وأعاده تصنيفها في ديناميات MT. (ب ، ج) وتظهر لقطات من تحليل المسار والإعدادات المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هنا ، ونحن وصف تعديلا للأسلوب الذي انشاته Ertych وآخرون44. مع العديد من التعديلات الأخرى ، ونحن الجمع بين هذه التقنية من تحليل ديناميات MT مع المزدوج الغزل القرص التصوير البؤري. استخدام القرص الدوار المزدوج يحسن دقه النامية MTs مع الحد من السمية الضوئية36. كما نقوم بتقليل التلف الضوئي والليزر الناجم عن ضوء الخلايا عن طريق التحول إلى مراسل فلوري طويل الطول. بروتين الفلورسنت tdTomato لديه معامل اعلي من الثبات الضوئي والسطوع بالمقارنة مع46egfp. وأخيرا ، يقتصر قياس ديناميات MT علي طائره Z واحده فقط بسبب قيود تحليل المتابعة مع المسار U. تم تصميم البرنامج المسار U للكشف عن فلوريسسينتلي الموسومة MT نصائح في محور XYZ50،51. لذلك ، أخذ سلسله الفاصل الزمني Z-مكدس وإنشاء الإسقاط الأقصى سلسله الفاصل الزمني عرضه لتوليد نتائج خاطئه. الإشارات المكتشفة في مختلف الطائرات Z وعدم الانتماء إلى نفس النمو MT يتم جمعها معا في الإسقاط القصوى ، التالي خلق مسار زائف للنمو MT.

بروتوكول التزامن المستخدم هنا يؤدي إلى كثافة عاليه من MTs عن طريق تقييد المغزل ميتوتيك إلى بنيه أحادي القطب. ال [ميتيك] [MTs] هياكل شديد الديناميكية مع مراحل النمو وانكماش, مع وقفه في الانتقال بين هم19,54,55. نظرا لكثافة عاليه من MTs المتزايدة ، والكشف عن الاحداث وقفه متبوعا اما انكماش أو النمو عرضه لنتائج خاطئه إذا تم تعيين معلمات التتبع بشكل غير صحيح. وحدات تتبع البرمجيات U-المسار الكشف عن ما يسمي المسارات الفرعية (حلقات من النمو المستمر) ومن ثم يصنف لهم المسارات المركبة مع الاحداث وقفه تسمي "الثغرات". ابلغيت وآخرون مناقشه اثنين من المعلمات الهامه للتتبع والمسار الفرعي ربط50. هذه هي "الحد الأقصى لطول الفجوة" و "عامل الانكماش الأقصى". إذا كان المسار الفرعي يجري يتبع يظهر في الاتجاه المتزايد لل MT في الخطوات الزمنيه اللاحقة ، ثم تصنف علي انها الفجوة إلى الامام. من ناحية أخرى ، إذا كان المسار الفرعي يظهر عكس اتجاه النمو ، وسوف تصنف علي انها الفجوة المتخلفة. يحدد الطول الأقصى للفجوة عدد الإطارات التي سيتم البحث عنها للثغرات الاماميه والخلفية. وكما ذكرنا ، فان الكثافة العالية والديناميكية العالية للطبيعة لل MTs المترية تحدد الحد ، وينبغي تعريف القيم الأصغر. وكما هو مبين في الشكل 1 هاء ، يتاثر الديناميت أكثر من غيرها. وتحسب الدينامية علي انها التشريد الجماعي لجميع المسارات التي تحتوي علي ثغرات علي مدي العمر العالمي. اما المعلمة الثانية ، وهي عامل الانكماش الأقصى ، فليس لها تاثير يذكر علي الديناميكية أو سرعه النمو (الشكل 1د ، ه).

بشكل عام ، عند دراسة خصائص النمو MT ، ينبغي إيلاء اهتمام دقيق لظروف التصوير. أولا ، ال MTs حساسة جدا لدرجه الحرارة والديبوليميريزي عندما تتعرض للنمو البارد المتوسطة56،57،58،59. لذلك ، لتجنب جمع النتائج الزائفة ، يجب التحكم في درجه الحرارة بدقه طوال التجربة بأكملها. ثانيا ، يمكن ان تؤثر علي تكوين الايونيه من المتوسطة المستخدمة اثناء التجارب MT النمو58،60. علي سبيل المثال ، يؤثر التعرض لأيونات الكالسيوم علي ديناميات MT بطرق مختلفه61،62. التالي ، ينبغي ان يكون تكوين متوسط النمو المستخدمة في جميع التجارب نفسه. المثل ، ينبغي تحديد بارامترات التحليل مره واحده والحفاظ عليها ثابته لجميع حالات التكرار.

في الاونه الاخيره ، فان الجمع بين شعريه المجهر الضوئي ورقه من مغزل ميتوتيك في فترات فرعيه ، جنبا إلى جنب مع معالجه الصور المتطورة يسمح تحليل معدلات الجمعية MT في ثلاثه ابعاد63،64. وهذا له مزايا واضحة علي clsm ، ولكن ستكون هناك حاجه إلى مزيد من التحسينات قبل ان يصبح الأسلوب من الاستخدام العام ، مثل توسيع الاستراتيجيات المستخدمة في المسار U إلى البعد الثالث26،50،63.

بروتوكول الكشف عن ديناميات MT وصفنا هنا يمكن ان يكون طريقه الاختيار للكشف عن المخدرات. الأسلوب قوي ، وهو يزيل بنجاح التحيز البشري مقارنه بالتحليل الذي يتم اجراؤه يدويا. الاتمته من الفيلم معالجه يسمح تحليل آلاف من المسارات MT داخل كل خليه ، التالي زيادة القوه الاحصائيه للتحليل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تعديل الأسلوب عن طريق تغيير ، علي سبيل المثال ، بروتوكول المزامنة والحصول علي خلايا من مراحل مختلفه من دوره الخلية. وهذا يمكن ، علي سبيل المثال ، ان يكون أداه مفيده لفحص الادويه الكيميائية التي تستهدف العقاقير العلاجية الكيميائية عندما ينبغي تمييز التاثير علي الخلايا البينية والفاصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء مرفق المجهر الضوئي ، معهد ماكس بلانك للطب التجريبي ، علي مشورتهم المتخصصة ودعمهم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dimethylenastron Merck 324622
DMEM w/o phenol red Gibco 31053-28
DPBS Gibco 14190-094
Fetal bovine serum Biochrom S0415
Fibronectin Bovine Plasma Merck F4759 Sterile powder
GlutaMAX Gibco 35050-038 Stable glutamine substitutive
jetPRIME Polyplus 114-15
EB3-TdTomato Addgene plasmid #50708
RPMI 1640 Gibco 61870-010
Trypan Blue Merck T8154-20ML
Trypsin/EDTA solution Biochrom L2143 0.05%/0.02 % w/o calcium and magnesium
µ-slide Ibidi 80426 4-well slide with #1.5 coverslip
Eclipse Ti Inverted microscope Nikon NA
Objective Nikon MRD01991 CFI Apo TIRF 100xC Oil
ACAL Laser Excahnger Nikon Laser box. 405, 458, 488, 514, 561 and 647 nm
Spinning disk module Andor CSU-W
Camera Andor iXon Ultra 888
Environmental Chamber Okolab Dark chamber equipped with CO2 supply, temperature control and humidifier
HeLa Cells DSMZ ACC-57
NIS Elements v4 Nikon Spinning disk microscope. Acquisition Software
MATLAB Mathworks Computing environment
Prism 8 GraphPad Statistical analysis and display software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erickson, H. P. Evolution of the cytoskeleton. Bioessays. 29, (7), 668-677 (2007).
  2. Pollard, T. D., Goldman, R. D. Overview of the Cytoskeleton from an Evolutionary Perspective. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10, (7), (2018).
  3. Wade, R. H. On and around microtubules: an overview. Molecular Biotechnology. 43, (2), 177-191 (2009).
  4. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216, (6), 1525-1531 (2017).
  5. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cell Science. 126, Pt 11 2319-2329 (2013).
  6. Lindemann, C. B., Lesich, K. A. Flagellar and ciliary beating: the proven and the possible. Journal of Cell Science. 123, Pt 4 519-528 (2010).
  7. Wheway, G., Nazlamova, L., Hancock, J. T. Signaling through the Primary Cilium. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 8 (2018).
  8. Falk, N., Losl, M., Schroder, N., Giessl, A. Specialized Cilia in Mammalian Sensory Systems. Cells. 4, (3), 500-519 (2015).
  9. Spoon, C., Grant, W. Biomechanical measurement of kinocilium. Methods in Enzymology. 525, 21-43 (2013).
  10. Zenker, J., et al. A microtubule-organizing center directing intracellular transport in the early mouse embryo. Science. 357, (6354), 925-928 (2017).
  11. Goldstein, B. Embryonic polarity: a role for microtubules. Current Biology. 10, (22), 820-822 (2000).
  12. Uchida, S., Shumyatsky, G. P. Deceivingly dynamic: Learning-dependent changes in stathmin and microtubules. Neurobiology of Learning and Memory. 124, 52-61 (2015).
  13. Fife, C. M., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Movers and shakers: cell cytoskeleton in cancer metastasis. British Journal of Pharmacology. 171, (24), 5507-5523 (2014).
  14. Bouchet, B. P., Akhmanova, A. Microtubules in 3D cell motility. Journal of Cell Science. 130, (1), 39-50 (2017).
  15. Dent, E. W. Of microtubules and memory: implications for microtubule dynamics in dendrites and spines. Molecular Biology of the Cell. 28, (1), 1-8 (2017).
  16. Craddock, T. J., Tuszynski, J. A., Hameroff, S. Cytoskeletal signaling: is memory encoded in microtubule lattices by CaMKII phosphorylation. PLOS Computational Biology. 8, (3), (2012).
  17. Smythies, J. Off the beaten track: the molecular structure of long-term memory: three novel hypotheses-electrical, chemical and anatomical (allosteric). Frontiers in Integrative Neuroscience. 9, 4 (2015).
  18. Kaganovsky, K., Wang, C. Y. How Do Microtubule Dynamics Relate to the Hallmarks of Learning and Memory. Journal of Neuroscience. 36, (22), 5911-5913 (2016).
  19. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, (5991), 237-242 (1984).
  20. Dubey, J., Ratnakaran, N., Koushika, S. P. Neurodegeneration and microtubule dynamics: death by a thousand cuts. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 343 (2015).
  21. Parker, A. L., Kavallaris, M., McCarroll, J. A. Microtubules and their role in cellular stress in cancer. Frontiers in Oncology. 4, 153 (2014).
  22. Honore, S., Pasquier, E., Braguer, D. Understanding microtubule dynamics for improved cancer therapy. Cell and Molecular Life Sciences. 62, (24), 3039-3056 (2005).
  23. Straube, A. Methods in Molecular Biology. Humana Press. Totowa, NJ. (2011).
  24. Budde, P. P., Desai, A., Heald, R. Analysis of microtubule polymerization in vitro and during the cell cycle in Xenopus egg extracts. Methods. 38, (1), 29-34 (2006).
  25. Gierke, S., Kumar, P., Wittmann, T. Analysis of microtubule polymerization dynamics in live cells. Methods in Cell Biology. 97, 15-33 (2010).
  26. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nature Methods. 7, (9), 761-768 (2010).
  27. Bailey, M., Conway, L., Gramlich, M. W., Hawkins, T. L., Ross, J. L. Modern methods to interrogate microtubule dynamics. Integrative Biology (Camb). 5, (11), 1324-1333 (2013).
  28. Galjart, N. Plus-end-tracking proteins and their interactions at microtubule ends. Current Biology. 20, (12), 528-537 (2010).
  29. Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23, (7), 2655-2664 (2003).
  30. Zwetsloot, A. J., Tut, G., Straube, A. Measuring microtubule dynamics. Essays in Biochemistry. 62, (6), 725-735 (2018).
  31. Bayguinov, P. O., et al. Modern Laser Scanning Confocal Microscopy. Current Protocols in Cytometry. 85, (1), 39 (2018).
  32. Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy -- a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell Structure and Function. 27, (5), 349-355 (2002).
  33. Elektrisches teleskop. Germany patent. Nipkow, P. (1884).
  34. Yin, S., Lu, G., Zhang, J., Yu, F. T., Mait, J. N. Kinoform-based Nipkow disk for a confocal microscope. Applied Optics. 34, (25), 5695-5698 (1995).
  35. Nipkow disk for confocal optical scanner. European patent application. Tanaami, T., Kenta, M. EP92114750A (1992).
  36. Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends. Methods in Cell Biology. 123, 153-175 (2014).
  37. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. M., Wadsworth, P. Cell cycle-dependent changes in microtubule dynamics in living cells expressing green fluorescent protein-alpha tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 971-980 (2001).
  38. Rusan, N. M., Fagerstrom, C. J., Yvon, A. -M. C., Wadsworth, P. Cell Cycle-Dependent Changes in Microtubule Dynamics in Living Cells Expressing Green Fluorescent Protein-α Tubulin. Molecular Biology of the Cell. 12, (4), 971-980 (2001).
  39. Liu, D., Davydenko, O., Lampson, M. A. Polo-like kinase-1 regulates kinetochore-microtubule dynamics and spindle checkpoint silencing. Journal of Cell Biology. 198, (4), 491-499 (2012).
  40. Maiato, H., Sunkel, C. E. Kinetochore-microtubule interactions during cell division. Chromosome Research. 12, (6), 585-597 (2004).
  41. Muller, C., et al. Inhibitors of kinesin Eg5: antiproliferative activity of monastrol analogues against human glioblastoma cells. Cancer Chemotherrapy and Pharmacology. 59, (2), 157-164 (2007).
  42. Mayer, T. U., et al. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen. Science. 286, (5441), 971-974 (1999).
  43. Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin Eg5. The Journal of Cell Biology. 150, (5), 975-988 (2000).
  44. Ertych, N., et al. Increased microtubule assembly rates influence chromosomal instability in colorectal cancer cells. Nature Cell Biology. 16, (8), 779-791 (2014).
  45. Brito, D. A., Yang, Z., Rieder, C. L. Microtubules do not promote mitotic slippage when the spindle assembly checkpoint cannot be satisfied. The Journal of Cell Biology. 182, (4), 623-629 (2008).
  46. Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. Advances in fluorescent protein technology. Journal of Cell Science. 120, (24), 4247-4260 (2007).
  47. Phelan, M. C., Lawler, G. Cell Counting. Current Protocols in Cytometry. 00, (1), 3 (1997).
  48. Merriam, E. B., et al. Synaptic regulation of microtubule dynamics in dendritic spines by calcium, F-actin, and drebrin. Journal of Neuroscience. 33, (42), 16471-16482 (2013).
  49. Samora, C. P., et al. MAP4 and CLASP1 operate as a safety mechanism to maintain a stable spindle position in mitosis. Nature Cell Biology. 13, (9), 1040-1050 (2011).
  50. Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176, (2), 168-184 (2011).
  51. Jaqaman, K., et al. Robust single-particle tracking in live-cell time-lapse sequences. Nature Methods. 5, (8), 695-702 (2008).
  52. Stout, A., D'Amico, S., Enzenbacher, T., Ebbert, P., Lowery, L. A. Using plusTipTracker Software to Measure Microtubule Dynamics in Xenopus laevis Growth Cones. Journal of Visualized Experiments. e52138 (2014).
  53. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of Cell Biology. 189, (5), 777-782 (2010).
  54. Brouhard, G. J. Dynamic instability 30 years later: complexities in microtubule growth and catastrophe. Molecular Biology of the Cell. 26, (7), 1207-1210 (2015).
  55. Burbank, K. S., Mitchison, T. J. Microtubule dynamic instability. Current Biology : CB. 16, (14), 516-517 (2006).
  56. Caplow, M., Shanks, J., Ruhlen, R. L. Temperature-jump studies of microtubule dynamic instability. Journal of Biological Chemistry. 263, (21), 10344-10352 (1988).
  57. Prasad, V., Jordan, M. A., Luduena, R. F. Temperature sensitivity of vinblastine-induced tubulin polymerization in the presence of microtubule-associated proteins. Journal of Protein Chemistry. 11, (5), 509-515 (1992).
  58. Wasteneys, G. O. Microtubules Show their Sensitive Nature. Plant and Cell Physiology. 44, (7), 653-654 (2003).
  59. Turi, A., Lu, R. C., Lin, P. -S. Effect of heat on the microtubule disassembly and its relationship to body temperatures. Biochemical and Biophysical Research Communications. 100, (2), 584-590 (1981).
  60. Safinya, C. R., et al. The effect of multivalent cations and Tau on paclitaxel-stabilized microtubule assembly, disassembly, and structure. Advances in Colloid and Interface Science. 232, 9-16 (2016).
  61. Sandoval, I. V., Weber, K. Calcium-Induced Inactivation of Microtubule Formation in Brain Extracts. European Journal of Biochemistry. 92, (2), 463-470 (1978).
  62. Vater, W., Böhm, K. J., Unger, E. Tubulin assembly in the presence of calcium ions and taxol: Microtubule bundling and formation of macrotubule-ring complexes. Cell Motility. 36, (1), 76-83 (1997).
  63. Yamashita, N., et al. Three-dimensional tracking of plus-tips by lattice light-sheet microscopy permits the quantification of microtubule growth trajectories within the mitotic apparatus. Journal of Biomedical Optics. 20, (10), 1-18 (2015).
  64. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218, (8), 2529-2544 (2019).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics