चूहों में इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन का मात्रात्मक माप

Neuroscience

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Summary

ऊंचा रीढ़ की हड्डी तरल पदार्थ प्रोटीन का स्तर या तो एक बदल रक्त मस्तिष्क बाधा या इंट्राथेकल संश्लेषण भर में प्लाज्मा प्रोटीन के प्रसार का परिणाम हो सकता है । इस लेख में एक अनुकूलित परीक्षण प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है जो दोनों मामलों को भेदभाव करने में मदद करता है और इंट्राथेकैली संश्लेषित प्रोटीन के मात्रात्मक माप प्रदान करता है।

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Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

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Abstract

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में पाया जाने वाला तरल पदार्थ सेरेब्रोस्पाइनल फ्लूइड (सीएसएफ) बुनियादी और नैदानिक विज्ञान दोनों के लिए बहुत महत्वरखपूर्ण है। सीएसएफ प्रोटीन संरचना का विश्लेषण बुनियादी तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान के साथ-साथ न्यूरोलॉजिकल रोगों में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान करता है। एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा गया प्रोटीन सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और ट्रांस्युरेशन दोनों से प्राप्त हो सकता है, और सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। रक्त और इंट्राथेकैली से प्रोटीन ट्रांसुएशन के बीच भेदभाव करने के लिए पशु मॉडल ों के साथ-साथ मनुष्यों में प्रोटीन का उत्पादन किया जाता है, पारंपरिक प्रोटीन विश्लेषण उपकरणों का उपयोग करके सीएसएफ प्रोटीन प्रोफाइलिंग मापमें एल्बुमिन सीएसएफ/सीरम भागफल (क्यूएल्बुमिन),रक्त-मस्तिष्क इंटरफेस (बीबीआई) की अखंडता का एक मार्कर, और प्रोटीन इंडेक्स (क्यूप्रोटीन/क्यूएल्बुमिन),इंट्राथेलिन प्रोटीन का अनुमान शामिल होना चाहिए । यह प्रोटोकॉल न्यूरोलॉजिकल विकारों के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण और बीबीआई हानि के मात्रात्मक माप के लिए सीएसएफ और रक्त संग्रह से लेकर भागफल और सूचकांकों की गणना तक पूरी प्रक्रिया को दर्शाता है।

Introduction

मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के आसपास एक स्पष्ट और बेरंग तरल सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ (सीएसएफ) महान नैदानिक और बुनियादी वैज्ञानिक महत्व रखता है। सीएसएफ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के इलेक्ट्रोलाइटिक वातावरण को बरकरार रखता है, प्रणालीगत एसिड-आधार स्थिति को संतुलित करता है, न्यूरोनल और ग्लियल कोशिकाओं को पोषक तत्वों की आपूर्ति करता है, सीएनएस के लिए एक लिम्फेटिक सिस्टम के रूप में कार्य करता है, और सीएनएस1में हार्मोन, न्यूरोट्रांसमीटर, साइटोकिन्स और अन्य न्यूरोपेप्टाइड्स का परिवहन करता है। इस प्रकार, चूंकि सीएसएफ संरचना सीएनएस की गतिविधि को दर्शाती है, यह तरल पदार्थ एक मूल्यवान प्रदान करता है, हालांकि अप्रत्यक्ष रूप से, सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य की विशेषता के लिए पहुंच।

सीएसएफ का उपयोग उन स्थितियों का निदान करने के लिए किया गया है जो सौ से अधिक वर्षों तक सीएनएस को प्रभावित करती हैं, और अधिकांश समय के लिए, इसका मुख्य रूप से चिकित्सकों द्वारा एक नैदानिक उपकरण के रूप में अध्ययन किया गया था। हालांकि, हाल के वर्षों में न्यूरोबायोलॉजिस्ट ने सीएनएस के रोगविज्ञान का अध्ययन करने के लिए सीएसएफ की क्षमता को पहचाना है। विशेष रूप से, सीएसएफ की प्रोटीन संरचना के विस्तृत अध्ययन की अनुमति देने वाले तंत्रिका विज्ञान दायरे में कई उच्च-थ्रूपुट प्रोटीन विश्लेषण उपकरण पेश किए गए हैं, इस उम्मीद के साथ कि यह विश्लेषण गतिशील परिवर्तनों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में मदद कर सकता है सीएनएस के भीतर होने वाली।

ल्यूमिनेक्स और सिमोआ टेक्नोलॉजीज2,3जैसी मल्टीप्लेक्स इम्यूनोसे तकनीकों में तकनीकी विकास आज शोधकर्ताओं को बहुत कम सांद्रता पर सैकड़ों प्रोटीन का पता लगाने की क्षमता प्रदान करते हैं। इसके अलावा, ये एक ही प्रौद्योगिकियां छोटे नमूना मात्रा के उपयोग की अनुमति देती हैं, जिससे चूहों सहित छोटे जानवरों में अध्ययन को बढ़ावा मिलता है, जिसमें सीएसएफ के सीमित नमूना मात्रा ने हाल ही में जब तक तरल पदार्थ के विस्तृत लक्षण ों को पहले से ही किया है।

फिर भी, एक चेतावनी यह है कि सीएसएफ में मापा प्रोटीन एक क्षतिग्रस्त रक्त मस्तिष्क इंटरफेस (BBI) के कारण सीरम से इंट्राथेकल संश्लेषण और/या ट्रांसड्यूेशन से प्राप्त हो सकता है । दुर्भाग्य से, अकेले सीएसएफ का प्रोटीन विश्लेषण केवल इन दो घटकों का योग निर्धारित कर सकता है। ट्रांसड्यूडेट और इंट्राथेकैली उत्पादित प्रोटीन के बीच भेदभाव करने के लिए, सीएसएफ प्रोटीन माप किसी भी उपलब्ध प्रोटीन विश्लेषण उपकरण का उपयोग करसीरम सांद्रता में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के साथ-साथ बाधा अखंडता के लिए समायोजित किया जाना चाहिए। हालांकि, हालांकि इस समायोजन का उपयोग आमतौर पर नैदानिक अभ्यास में किया जाता है, उदाहरण के लिए, सीएसएफ आईजीजी इंडेक्स, जिसमें इंट्राथेकल आईजीजी संश्लेषण4,5,6का पता लगाने के लिए उच्च संवेदनशीलता है, आज तक बहुत कम शोध अध्ययनों ने सीआरएफ प्रोटीन सांद्रता को सीरम एकाग्रता और बाधा अखंडता7,8के लिए सही किया है।

वर्तमान में, रेबर्गराम दृष्टिकोण प्रोटीन के बाधा समारोह और इंट्राथेकल संश्लेषण को निर्धारित करने का सबसे अच्छा तरीका है। यह सीएसएफ/सीरम भागफल आरेख में एक चित्रमय मूल्यांकन है जो एक एकीकृत तरीके से, बाधा (डीआईएस) कार्य और इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण दोनों का विश्लेषण करता है, जो विशेष रूप से रक्त-व्युत्पन्न प्रोटीन9,10का जिक्र करता है । अत्यधिक प्रचुर मात्रा में प्रोटीन एल्बुमिन आमतौर पर संदर्भ प्रोटीन के रूप में चुना जाता है क्योंकि यह केवल जिगर में उत्पादित होता है और क्योंकि इसका आकार, लगभग 70 केडीए, छोटे और बड़े प्रोटीन11के बीच मध्यवर्ती होता है। विश्लेषण आरेख को पहली बार 1 9 87 में रीबर और फेल्गेनहॉयर द्वारा इम्यूनोग्लोबुलिन (आईजीएस)11की प्रमुख कक्षाओं के लिए परिभाषित किया गया था, जो हजारों मानव नमूनोंकेविश्लेषण से प्राप्त परिणामों के आधार पर अनुभवजन्य रूप से 9। बाद में आणविक प्रसार/प्रवाह दर12के सिद्धांत में प्रसार के दो Fick कानूनों के आवेदन से इस दृष्टिकोण की पुष्टि की गई । इस तरह के सिद्धांत से यह दर्शाता है कि बाधा के माध्यम से प्रोटीन के प्रसार में हाइपरबोलिक वितरण होता है और यह सीएनएस9,13में प्रोटीन की गतिशीलता को मात्रात्मक रूप से समझा सकता है । कुल मिलाकर, इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण का प्रदर्शन करने के लिए रीबर्गराम का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह समवर्ती रूप से प्रोटीन अंश की पहचान करता है जो सीआरएफ से सीएसएफ में प्रवेश करता है और साथ ही स्थानीय उत्पादन के कारण सीएसएफ में पाए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा भी।

वर्तमान लेख और संबंधित प्रोटोकॉल पूरी प्रक्रिया का वर्णन, सीएसएफ और रक्त संग्रह से अंतिम गणना के लिए सीएसएफ प्रोटीन के स्तर को सही, तंत्रिका विज्ञान के माउस मॉडल में इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण के मात्रात्मक माप के लिए विकारों. यह प्रक्रिया एक आधार रेखा प्रदान करती है जिसके खिलाफ किसी भी सीएसएफ प्रोटीन की रोगविज्ञानी उत्पत्ति का आकलन (1) और बाधा अखंडता की स्थिरता और कार्यात्मक महत्व ( 2) प्रदान करता है। यह प्रक्रिया और प्रोटोकॉल न केवल माउस सीएसएफ नमूनों का आकलन करने के लिए उपयोगी हैं बल्कि न्यूरोलॉजिकल रोगों और मानव रोगियों के पशु मॉडलों की एक भीड़ में सीएसएफ का विश्लेषण करने में भी उपयोगी हैं।

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Protocol

डार्टमाउथ में गीसेल स्कूल ऑफ मेडिसिन में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा समीक्षा और अनुमोदित प्रोटोकॉल का उपयोग करता है।

1. तरल पदार्थों का संग्रह

नोट: सीरम और सीएसएफ दोनों की आवश्यकता है। जीवित रहने और नेक्रॉप्सी के लिए प्रत्येक तरल पदार्थ संग्रह के लिए दो प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है।

  1. अस्तित्व प्रक्रियाओं का उपयोग करसीरम और सीएसएफ संग्रह
    नोट: अस्तित्व तरल पदार्थ संग्रह के लिए, सीरम संग्रह सीएसएफ संग्रह से पहले होना चाहिए क्योंकि यह एक कम आक्रामक प्रक्रिया है। सीएसएफ सीरम ड्रा के एक सप्ताह के भीतर प्राप्त किया जाना चाहिए।
    1. सीरम संग्रह के लिए रेट्रो-ऑर्बिटल रक्तस्राव प्रक्रिया।
      नोट: यह प्रक्रिया चूहों के अस्तित्व रक्तस्राव के लिए है14। वर्णित प्रक्रिया चूहों की किसी भी उम्र, लिंग और तनाव पर लागू होती है। चूंकि आईएसएसीसी नियम यह तय करते हैं कि शरीर के वजन के 1% की अधिकतम रक्त मात्रा को एक रक्त ड्रा के रूप में हटाया जा सकता है, इसलिए यह सिफारिश की जाती है कि प्रक्रिया केवल 15 ग्राम से अधिक वजनवाले चूहों पर की जाती है।
      1. चूहों से युक्त पिंजरों को रैक से एक उपयुक्त कार्य क्षेत्र में ले जाएं। ऑक्सीजन फ्लो मीटर को 1 एल/मिन में बदलकर एनेस्थीसिया गैस मशीन तैयार करें।
      2. जानवर को इंडक्शन चैंबर में रखें और ढक्कन को कसकर बंद करें। आइसोफ्लोरीन वाष्पीकरण को 3.5% पर चालू करें और पशु को वापस होने तक निगरानी करें।
      3. जानवर को कक्ष से निकालें और पेडल पलटा द्वारा संज्ञाहरण के स्तर का आकलन करें, यानी, फर्म फुटपैड चुटकी। प्रक्रिया करने से पहले संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई सुनिश्चित करें: एक फर्म चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी पर्याप्त संज्ञाहरण इंगित करता है ।
      4. गैर-प्रमुख हाथ के अंगूठे और तर्जनी के साथ कान के पीछे ढीली त्वचा को लोभी करके एनेस्थेटाइज्ड माउस को नियंत्रित करें। आंखों के नीचे त्वचा को वापस खींचने के लिए आंखों और अंगूठे के ऊपर त्वचा को वापस खींचने के लिए इंडेक्स फिंगर का उपयोग करके आंखों को उभारें।
      5. आंखों की पुतली के नीचे आंख सॉकेट में एक पाश्चर पिपेट की नोक रखें(चित्रा 1,बाएं पैनल), आंख सॉकेट के बीच की ओर लगभग 45 डिग्री पर टिप निर्देशित(चित्रा 1,दाएं पैनल)। आगे के मार्ग के दौरान उंगलियों के बीच पिपेट घुमाएं। कोमल दबाव लागू करें और फिर तब तक छोड़ें जब तक कि रक्त पिपेट में प्रवेश न कर दे।
        नोट: रक्त की अधिकतम मात्रा है कि इस स्थान से एक समय में वापस लिया जा सकता है शरीर के वजन का लगभग 1% है, जैसे, एक 20 ग्राम माउस से ०.२ mL ।
      6. आंख ों में चोट को रोकने के लिए केशिका को धीरे से हटा दें और एकत्र रक्त को 1.5 मिलील अपकेंद्री ट्यूब में रखें। पलक को बंद करें और आगे रक्तस्राव को रोकने के लिए धुंध के साथ हल्के दबाव लागू करें। एक बार पूरी तरह से सतर्क और मोबाइल (आमतौर पर 3−5 मिन), माउस को उसके होल्डिंग पिंजरे में वापस कर दें।
      7. कमरे के तापमान (आरटी) पर 30−60 टिन के लिए रक्त को थक्का बनाने की अनुमति दें, फिर 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज में 2,000 x ग्राम पर 10 न्यूनतम के लिए रक्त को अपकेंद्रित्र करें। एक साफ पिपेट तकनीक का उपयोग करके, सीरम को एक नए, लेबल 0.5 मिली शीशी में इकट्ठा करें। तुरंत सीरम की शीशी को 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
    2. अस्तित्व की प्रक्रिया के साथ सीएसएफ संग्रह
      नोट: यह प्रक्रिया अस्तित्व सर्जरी के लिए है, और यह २००८ में लियू और डफ द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल पर आधारित है15. चूहों को एक केटामाइन (20 मिलीग्राम/mL), जाइलाज़ीन (०.५ मिलीग्राम/mL), और एसीप्रोमाजिन (०.५ मिलीग्राम/mL) कॉकटेल द्वारा इंट्रापेरिटोनी प्रशासित द्वारा एनेस्थेटाइज्ड किया जाता है ।
      1. रैक से चूहों वाले पिंजरों को एक नामित सर्जरी कार्य क्षेत्र में ले जाएं। बाँझ वातावरण में सर्जरी की जगह तैयार करें। सुनिश्चित करें कि उपयोग किए गए सभी उपकरणों और सामग्रियों को सर्जरी से पहले निष्फल कर दिया जाता है।
      2. माउस का वजन करें और आवश्यक संज्ञाहरण मात्रा (20 ग्राम माउस के लिए संज्ञाहरण कॉकटेल का 0.1 मिलील) की गणना करें। एनेस्थीसिया इंट्रापेरिटोनी16इंजेक्ट करें । कुछ मिनट ों के बाद, पर्याप्त संज्ञाहरण सुनिश्चित करने के लिए फुटपैड को पिन करके माउस का परीक्षण करें। यदि अधिक एनेस्थेटिक की आवश्यकता है, तो आगे एनेस्थेटिक कॉकटेल के 0.01−03 एमएल इंजेक्ट करें।
      3. सीएसएफ संग्रह के लिए बड़े पर्याप्त कार्य क्षेत्र का पर्दाफाश करने के लिए, काउडल अंत पर, खोपड़ी पर मध्यस्थ, सिर के एक छोटे से क्षेत्र को शेव करने के लिए या तो कैंची या शेवर का उपयोग करें। स्टीरियोटैक्सिक उपकरण पर प्रवण स्थिति में माउस की स्थिति, और कान सलाखों(चित्रा 2A)का उपयोग करके सिर स्थिर।
        नोट: माउस को नीचे रखा जाता है ताकि सिर शरीर के साथ लगभग 135 डिग्री कोण बनाता है(चित्रा 2A)। एक बार जानवर तैनात है, एक शल्य चिकित्सा स्थल पर एक बाँझ क्षेत्र बनाए रखने के लिए प्रयोग किया जाता है। चूहों में सीएसएफ संग्रह के लिए स्पष्ट चिपकने वाले पर्दे पसंद किए जाते हैं, क्योंकि वे जानवर के प्रत्यक्ष और अधिक केंद्रित दृश्य के लिए अनुमति देते हैं।
      4. 30% क्लोरहेक्सीडीन डायटेट के साथ सर्जिकल साइट को झाड़ू। बाँझ स्केलपेल का उपयोग करके, सिस्टर्न मैग्ना की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए ऑक्सीपुट से कम त्वचा का एक सजिटल चीरा बनाएं।
      5. संदंश के साथ कुंद विच्छेदन द्वारा, सिस्टर्ना मैग्ना(चित्रा 2B)का पर्दाफाश करने के लिए चमड़े के नीचे के ऊतकों और मांसपेशियों को अलग करें। मांसपेशियों को अलग रखने के लिए माइक्रोरेट्रैक्टर ्स का उपयोग करें(चित्रा 2 B)और सिस्टर्ना मैग्ना पर ड्यूरा मेटर मेनिंगल परत को बेनकाब करें।
      6. किसी भी संभावित रक्त संदूषण को दूर करने के लिए बाँझ फॉस्फेट-बफर्ड लवण (पीबीएस) से धीरे-धीरे धोएं। दाग एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ ड्यूरा मेटर सूखी और धीरे से एक 30 जी सुई के साथ सिस्टर्ना मैग्ना को कवर झिल्ली पंचर । सीएसएफ(चित्रा 2C)को इकट्ठा करने के लिए जल्दी और धीरे से एक छोटे ग्लास केशिका ट्यूब डालें।
        नोट: इंट्राक्रैनियल दबाव सीएसएफ को केशिका(चित्रा 2 सी)में अनायास प्रवाह करने की अनुमति देता है। माउस की उम्र और आकार के आधार पर, सीएसएफ का लगभग 5−12 माइक्रोन प्रत्येक माउस से प्राप्त किया जाता है।
      7. झिल्ली से केशिका ट्यूब को सावधानी से हटा दें। पॉलीथीन ट्यूबिंग(सामग्री की तालिका)के माध्यम से ट्यूब को 3 मिलीसी सिरिंज से कनेक्ट करें और एकत्र किए गए सीएसएफ को लेबल वाली 0.5 मिलीएल ट्यूब(चित्रा 2D)में इंजेक्ट करें। शीशियों को बर्फ में रखें।
      8. डिस्पोजेबल सुई के साथ पॉलीडिऑक्सोनोन सीवन सीवन सीवन (पीडीएस) का उपयोग करके और दफन टांके17का उपयोग करके बंद चीरा । किसी भी सूखे रक्त या ऊतक के क्षेत्र को साफ करें।
      9. चूहों को इंजेक्ट करें, चमड़े से या इंट्रापेरिटोनी16,0.05−0.1 मिलीग्राम/किलो ग्राम बुप्रेनोरफिन हाइड्रोक्लोराइड के साथ एनाल्जेसिक उपचार के रूप में। इसके अलावा, निर्जलीकरण को रोकने के लिए बाँझ खारा के 1 mL को कम से कम इंजेक्ट करें।
      10. वसूली के लिए माउस को एक साफ और गर्म पिंजरे में वापस रखें। एक बार माउस मोबाइल है और भोजन और पानी तक पहुंचने में सक्षम है, रैक पर पिंजरे वापस जगह है ।
      11. 4 डिग्री सेल्सियस रेफ्रिजरेटेड सेंट्रलाइज में 1,000 x ग्राम पर 10 मिन के लिए सेंट्रलाइज सीएसएफ। xanthochromia की पहचान और ट्यूब के नीचे में एक लाल गोली की उपस्थिति के लिए दृश्य निरीक्षण द्वारा रक्त संदूषण की डिग्री की जांच करें। रक्त दूषित नमूनों को त्यागें।
        नोट: रक्त दूषित नमूनों में सीएसएफ प्रोटीन मात्रा के सुधार के लिए उपयोग किया गया फार्मूला समीकरण मापदंडों पर आधारित है जिसमें सीएसएफ और सीरम में प्रोटीन सामग्री, हेमेटोक्रिट (एचसीटी), और सीएसएफ और रक्त18में लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) की गिनती शामिल है । हालांकि, इस तरह की सुधार रणनीति को छोटी मात्रा के कारण माउस सीएसएफ नमूनों पर आसानी से लागू नहीं किया जा सकता है, इसलिए सुधार रणनीति को एक दृश्य निरीक्षण तक सीमित करता है।
      12. एक साफ पिपेट तकनीक का उपयोग करना, कोशिकाओं के साथ गोली के पीछे छोड़ते हुए, एक नई 0.2 एमएल ट्यूब में सीएसएफ इकट्ठा करें। एयरोसोल के कारण वॉल्यूम लॉस को कम करने के लिए पीबीएस के साथ सीएसएफ 1:3 को पतला करें। सीएसएफ की शीशी को तुरंत 80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कर दें।
  2. सीरम और सीएसएफ संग्रह गैर-अस्तित्व प्रक्रियाओं का उपयोग करके
    नोट: गैर-अस्तित्व तरल पदार्थ संग्रह के लिए, सीएसएफ संग्रह सीरम संग्रह से पहले है क्योंकि माउस को पल्स की आवश्यकता होती है।
    1. नेक्रॉप्सी में सीएसएफ संग्रह
      नोट: यह प्रक्रिया गैर-जीवित रहने की सर्जरी के लिए है, और सीएसएफ का लगभग 10−20 माइक्रोन प्रत्येक माउस से प्राप्त किया जाता है। एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र की सिफारिश की है, लेकिन गैर अस्तित्व सर्जरी के लिए आवश्यक नहीं है।
      1. रैक से चूहों वाले पिंजरों को आरामदायक काम करने की जगह पर ले जाएं। सीएसएफ संग्रह के लिए चरण 1.1.2.2−1.1.2.7 और 1.1.2.11−1.1.2.12 का पालन करें। सीरम संग्रह के लिए धारा 1.2.2 पर आगे बढ़ें।
    2. इंट्राकार्डियक पंचर के माध्यम से रक्त संग्रह (खुला दृष्टिकोण)
      नोट: रक्त की मात्रा की उम्मीद शरीर के वजन का लगभग 3% है, उदाहरण के लिए, 20 ग्राम माउस से 0.6 मिलीग्राम।
      1. सीएसएफ संग्रह के बाद यह सुनिश्चित करें कि माउस अभी भी फुटपैड को पिन करके पर्याप्त रूप से एनेस्थेटाइज्ड है। यदि कोई प्रतिक्रिया देखी जाती है, तो संवेदनाकारियों की दूसरी खुराक का प्रशासन करें। यदि कोई प्रतिक्रिया नहीं देखी जाती है, तो आगे बढ़ें।
      2. जानवर को पीठ पर रखें और 70% अल्कोहल के साथ पेट पर त्वचा को झाड़ू लें। सर्जिकल कैंची के साथ, छाती गुहा खोलें और दिल को बेनकाब करें। बाईं वेंट्रिकल में 25 जी सुई (3 मिलीग्राम सिरिंज से जुड़ी) डालें और धीरे-धीरे सिरिंज प्लंजर पर नकारात्मक दबाव डालें। खून एकत्र होने के बाद सुई वापस लें।
      3. इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि करें जैसे कि डेपुटेशन या सर्वाइकल अव्यवस्था यह सुनिश्चित करने के लिए कि जानवर मृतक है।
      4. सिरिंज के प्लंजर को नीचे धकेलें और एकत्र रक्त को 1.5 मिली शीशी में इंजेक्ट करें। आरटी पर 30-60 मिन के लिए रक्त को थक्का जमने दें और फिर इसे 4 डिग्री सेल्सियस प्रशीतित अपकेंद्रितित में 2,000 x ग्राम पर 10 मिन के लिए अपकेंद्रित करें।
      5. स्वच्छ पिपेट तकनीक का उपयोग करके, सीरम को एक नए, लेबल 0.5 मिली शीशी में इकट्ठा करें। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर पर सीरम की शीशी को तुरंत फ्रीज करें।

2. प्रोटीन विश्लेषण

  1. मिलान सीरम और सीएसएफ नमूनों में लक्ष्य प्रोटीन (एस) और एल्बुमिन की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक पसंदीदा विधि, उदाहरण के लिए, ल्यूमिनेक्स तकनीक का उपयोग करें।
    नोट: यहां, ल्यूमिनेक्स चुंबकीय प्रौद्योगिकी के साथ एक उदाहरण दिया गया है, लेकिन लगभग कोई भी तकनीक जो प्रोटीन की मात्रा को मापती है, जिसमें एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (ELISAs) शामिल हैं, वर्तमान प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है। आदर्श रूप से, सीएसएफ और सीरम नमूने एक ही मंच पर एल्बुमिन और लक्ष्य प्रोटीन दोनों के लिए चलाए जाते हैं। परख की स्थिति एंटीजन-मनका युग्मन एकाग्रता, सीरम और सीएसएफ नमूना कमजोर होने, प्रत्येक एनालाइये के लिए सर्वश्रेष्ठ-फिट मानक घटता, और गैर-विशिष्ट प्रतिक्रियाशीलता को कम करने के लिए बफर संरचना जैसे प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए। यदि एक वाणिज्यिक किट प्रोटीन (एस) माप के लिए प्रयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, इम्यूनोग्लोबुलिन आइसोटाइपिंग किट (सामग्री की तालिका) में प्रस्तुत डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल कियाचित्रा 3पर, निर्माताओं के निर्देशों का पालन करना होगा।
    1. विगलन पर और विश्लेषण से पहले, अपकेंद्रित्र सीएसएफ और सीरम नमूने (10 वर्ष के लिए २,००० x ग्राम) और फिल्टर प्लेटों के क्लोजिंग को रोकने के लिए सुपरनेटेंट का उपयोग करें और/या जांच । उचित नमूना कमजोर करने के लिए किट के साथ प्रदान की परख प्रक्रिया का पालन करें। अन्यथा, प्रत्येक एनालीट और तरल पदार्थ के लिए उचित कमजोर पड़ने का निर्धारण करें। तदनुसार पीबीएस में नमूनों को पतला करें।
      नोट: यदि कोई विशिष्ट मार्गदर्शन या निर्देश नहीं हैं, तो प्रत्येक एनालाइट और तरल पदार्थ के लिए कमजोर पड़ना अध्ययन परीक्षण से पहले स्थापित किया जाना है, ताकि एकाग्रता अनुमान प्राप्त करने के लिए आवश्यक उचित कमजोर पड़ने वाली श्रेणियों का निर्धारण किया जा सके जो सबसे भीतर आते हैं एक मानक वक्र की विश्वसनीय रेंज। जैविक नमूने की विशेषताओं को जानने के लिए विश्लेषण किया जाना है, उदाहरण के लिए, तरल पदार्थ में शारीरिक और रोग सांद्रता, कम, मध्यम और उच्च विश्लेषण सामग्री के नमूनों के साथ अलग-अलग कमजोर होने की कोशिश करने की अनुमति देता है। यदि नमूनों में सांद्रता की अपेक्षित सीमा को प्राथमिकताओं में जाना जाता है, तो चुने गए मानक वक्र सीमा के भीतर होने के लिए नमूने को कितनी बार पतला किया जाना है, इसकी गणना करने के बाद कमजोरियों का चयन किया जा सकता है।
      सावधानी: कमजोर पड़ने वाले कारकों की गणना करके, याद रखें कि सीएसएफ पहले से ही 1:3 पतला हो चुका है।
    2. धारावाहिक कमजोर संदर्भ मानक प्रोटीन द्वारा चित्रा 3में डेटा उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले रुचि के प्रत्येक प्रोटीन के लिए एक मानक वक्र तैयार करें, उदाहरण के लिए, एल्बुमिन और आईजीजी। मानक घटता की तैयारी के दौरान, अगले कमजोर पड़ने से पहले प्रत्येक उच्च एकाग्रता को अच्छी तरह से मिलाएं।
      नोट: क्वांटिफिकेशन की चुनी हुई विधि की परवाह किए बिना, नमूनों में प्रोटीन (एस) एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए परख का अनुमान लगाने के लिए हर बार एक मानक वक्र को शामिल करना आवश्यक है। संदर्भ मानक के लिए सबसे अच्छा विकल्प ब्याज के प्रोटीन की एक शुद्ध, ज्ञात एकाग्रता है। विशिष्ट कमजोरहोने पर निर्णय लेना, साथ ही मानक वक्र को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले डेटा बिंदुओं और प्रतिकृतियों की संख्या, मानक वक्र में गैर-लाइनारिटी की डिग्री पर निर्भर करती है।
    3. उपयुक्त एंटीबॉडी-युग्मित चुंबकीय मनका सेट(सामग्री की तालिका) काचयन करें। मोतियों की अलग-अलग शीशियों के लिए, प्रत्येक शीशी को 30 एस और भंवर के लिए 1 मिन के लिए तैयार करें। परख/वॉश बफर (पीबीएस, 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन [बीएसए]) में प्रत्येक सेट/माइक्रोन के 50 मोतियों की अंतिम एकाग्रता के लिए मनका के शेयरों को कमजोर करके एक "काम मोतियों का मिश्रण" तैयार करें। एक फ्लैट-बॉटम 96-वेल प्लेट(सामग्रीकी तालिका) में प्रत्येक कुएं में मिश्रित मोतियों के 50 माइक्रोन जोड़ें।
      सावधानी: फ्लोरोसेंट मोतियों प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं। इसलिए, उन्हें प्रक्रिया के दौरान प्रकाश के लंबे समय तक जोखिम से बचाया जाना चाहिए।
    4. एक अच्छी तरह से नक्शा वर्कशीट पर पृष्ठभूमि, मानकों और नमूनों की नियुक्ति आरेख।
    5. प्रत्येक पृष्ठभूमि में परख/धोने बफर के ५० μL अच्छी तरह से जोड़ें, और मानक वक्र के लिए कुओं के लिए प्रत्येक मानक के ५० μL । उपयुक्त कुओं में प्रत्येक पतला नमूना के 50 मीटर लोड पिछले। पन्नी के साथ थाली लपेटें और आंदोलन के साथ इनक्यूबेट (~ 800 आरपीएम) आरटी में 30 मिन के लिए एक प्लेट शेखर पर।
    6. प्लेट को एक हाथ में चुंबक(सामग्री की तालिका)पर रखें और चुंबकीय मोतियों की पूरी सेटिंग की अनुमति देने के लिए ~ 60 एस के लिए चुंबक पर प्लेट को आराम दें। अवशिष्ट तरल को हटाने के लिए शोषक पैड पर प्लेट को धीरे-धीरे डिकेंट करके अच्छी तरह से सामग्री निकालें।
    7. इसे चुंबक से हटाकर प्लेट को धोएं, परख के २०० μL जोड़कर/बफर धोएं, ~ 30 एस के लिए मिलाते हुए, और अंत में इसे चुंबक में फिर से संलग्न करके । धोने 3x दोहराएं।
    8. प्रोटीन होस्ट प्रजातियों के खिलाफ उठाए गए बायोटिन लेबल वाले एंटीबॉडी को कमजोर करें, परख/वॉश बफर में 4 μg/mL । प्रत्येक अच्छी तरह से पतला पता लगाने एंटीबॉडी के 50 μL जोड़ें। ~800 आरपीएम पर प्लेट शेकर पर आरटी पर 30 मिन के लिए प्लेट और इनक्यूबेट को कवर करें। चुंबक पर प्लेट रखें और चरण 2.1.6 और 2.1.7 दोहराएं।
    9. तनु फाइकोरिथ्रिन (पीई) - परख/वॉश बफर में 4 μg/mL करने के लिए स्ट्रेप्टाविडिन (SAPE) को संयुग्मित स्ट्रेप्टाविडिन (SAPE) । प्रत्येक अच्छी तरह से पतला SAPE के 50 μL जोड़ें। ~800 आरपीएम पर प्लेट शेकर पर आरटी पर 30 मिन के लिए प्लेट और इनक्यूबेट को कवर करें। चुंबक पर प्लेट रखें और चरण 2.1.6 और 2.1.7 दोहराएं।
    10. चुंबक से थाली निकालें और परख के १०० μL में मोतियों को फिर से निलंबित/ एक दोहरी लेजर प्रवाह आधारित पता लगाने उपकरण है जो पीई फ्लोरेसेंस तीव्रता (FI) की भयावहता का पता लगाने के लिए अनुमति देता है के साथ कुओं पढ़ें ।
      नोट: संकेत, उदाहरण के लिए, FI, उत्पन्न, मोतियों की सतह से जुड़े लक्ष्य एंटीजन की मात्रा के आनुपातिक है।
    11. कच्चे डेटा का निर्यात करें और डिटेक्शन सिग्नल फाई बनाम मानक प्रोटीन सांद्रता को ग्राफकर मानक घटता बनाएं। नमूनों में एनालाइट (एस) की एकाग्रता की गणना करने के लिए मानक वक्र (एस) का उपयोग करें।
      नोट: एल्बुमिन अधिमानतः जी/डीएल में व्यक्त किया जाता है, जबकि ब्याज के प्रोटीन अधिमानतः एमजी/डीएल में व्यक्त किए जाते हैं ।

3. इंट्राथेकल इंडेक्स गणना

  1. प्रोटीन एकाग्रता मूल्यों को स्प्रेडशीट में व्यवस्थित करें और निम्नलिखित सूत्रों को लागू करके परिणामों का विश्लेषण करें।
  2. क्यूएल्बुमिनकी गणना करें:
    Equation 1
    जहां सीएसएफएल्बुमिन और सीरमएल्बुमिन क्रमशः मिलान सीरम और सीएसएफ नमूनों में एल्बुमिन की सांद्रता हैं।
  3. क्यूप्रोटीनकी गणना करें:
    Equation 2
    जहां सीएसएफप्रोटीन और सीरमप्रोटीन क्रमशः मिलान सीरम और सीएसएफ नमूनों में लक्ष्य प्रोटीन (एस) की सांद्रता है।
  4. प्रोटीन इंडेक्स की गणना करें:
    Equation 3

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Representative Results

इस प्रतिनिधि प्रयोग के उद्देश्य से कई काठिन्य (एमएस) के दो चिकित्सकीय प्रासंगिक कृंतक मॉडलों में आईजीजी के इंट्राथेकल संश्लेषण की तुलना करना है: पीएलपी139-151-प्रेरितप्रयोगात्मक ऑटोइम्यून एन्सेफेलोमाइलाइटिस (आर-ईएई) और पुरानी प्रगतिशील, थिलर के मूत्र एन्सेफेलोमाइलाइटिस वायरस-प्रेरित डेमिएलिनिटिंग (TMED)। आर-ईएई रीलैपिंग-रेमिटिंग एमएस को समझने के लिए एक उपयोगी मॉडल है, जबकि TMEV-IDD मॉडल में क्रोनिक प्रोग्रेसिव एमएस19की सुविधा है।

वर्तमान अध्ययन के लिए, आर-ईएई (एन = 12) और TMEV-IDD (n = 28) में इंट्राथेकल आईजीजी संश्लेषण का मात्रात्मक विश्लेषण किया गया है। दोनों समूहों को उनकी बीमारी के चरम पर विश्लेषण किया गया । 10 चूहों के एक अतिरिक्त समूह को नकली-इलाज किया गया था और उम्र से मेल खाने वाले नियंत्रण समूहों (सीआर-ईएई एन = 4, सीटीएमईवी-आइडी शाम एन = 6) के रूप में कार्य किया गया था।

व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट(सामग्री की तालिका)के साथ एक चुंबकीय मनका आधारित दृष्टिकोण का उपयोग मिलान सीरम और सीएसएफ नमूनों में कुल आईजीजी को मापने के लिए किया गया था। कुल आईजीजी मूल्य उपवर्ग आईजीजी 1, आईजीजी2ए, आईजीजी2बी और आईजीजी 3 मूल्यों के योग से प्राप्त किया गया था। एल्बुमिन को एक वाणिज्यिक माउस एल्बुमिन एलिसा किट(सामग्री की तालिका)के साथ मापा गया था क्योंकि उस समय एल्बुमिन के लिए ल्यूमिनेक्स परख उपलब्ध नहीं थी। सभी माप निर्माताओं के निर्देशों का सावधानीपूर्वक पालन किया गया। एल्बुमिन भागफल (क्यूएल्बुमिन)और आईजीजी इंडेक्स (क्यूआईजीजी/क्यूएल्बुमिन)का उपयोग सीएसएफ में रक्त बनाम सीएनएस-व्युत्पन्न आईजीजी में अंतर करने के लिए किया गया था ।

जैसा कि चित्रा 3एमें दिखाया गया है, इसी आयु-मिलान वाले नकली नियंत्रण(पी) 0.026) की तुलना में एमएस के दोनों कृंतक मॉडलों के सीएसएफ में कुल आईजीजी का वास्तविक स्तर काफी बढ़ जाता है। हालांकि, आर-ईएई चूहों काफी बढ़ाया क्यूएल्बुमिन मूल्यों(पी ♫ 0.019) दिखाते हैं, जो इन चूहों(चित्रा 3B)में बाधा की बढ़ती पारगम्यता का संकेत देते हैं। इसके विपरीत, क्यूएल्बुमिन में कोई अंतर TMEV-IDD और नकली चूहों(पी = 0.49) के बीच मौजूद नहीं है, इस प्रकार TMEV-IDD चूहों7,8में एक बरकरार बाधा के हमारे पिछले खोज की पुष्टि । आर-ईएई और टीएमईवी-आईडीडी में ट्रांसड्यूडेट और इंट्राथेकैली उत्पादित आईजीजी के बीच और भेदभाव करने के लिए, आईजीजी सूचकांक मापा गया, जो TMEV-IDD चूहों(p ‧ 0.0006) में काफी अधिक मूल्यदिखा रहा था, और इसलिए इस मॉडल(चित्रा 3 सी)में इंट्राथेकल आईजीजी उत्पादन।

एक उच्च आईजीजी सूचकांक के साथ TMEV-IDD चूहों में एक अक्षुण्ण बाधा से पता चलता है कि इस मॉडल में, सीएनएस के भीतर एंटीबॉडी का उत्पादन किया जाता है। इसके विपरीत, आर-ईएई में, एक महत्वपूर्ण बाधा टूटने और कम आईजीजी सूचकांक इस बात का सबूत प्रदान करता है कि सीएसएफ आईजीजी ज्यादातर इंट्राथेकल बी कोशिकाओं के बजाय परिधीय द्वारा उत्पादित किया जाता है, यह भी सुझाव देता है कि एमएस के इस तीव्र मॉडल में, सीएसएफ आईजीजी ज्यादातर सीरम से प्राप्त होता है।

Figure 1
चित्रा 1: चूहों का रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव। बाएं: रेट्रो-ऑर्बिटल सीनस, आईबॉल और कक्षा के पीछे के सापेक्ष सुई का सही प्लेसमेंट। सही: पिपेट स्थान आंख के मध्यस्थ कैंटस में शुरू होता है और कक्षा के पृष्ठीय पहलू के लिए ग्लाइड्स। केशिका 45 डिग्री के कोण पर डाला जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: चूहों में सीएसएफ संग्रह। (क)कान के बार माउस के सिर का समर्थन करते हैं, और माउस को निर्धारित किया जाता है ताकि सिर शरीर के साथ 135 डिग्री कोण बनाता है। तीर उजागर सिस्टर्ना मैग्ना की ओर इशारा करता है। (ख)संदंश के साथ कुंद विच्छेदन द्वारा, मांसपेशियों को सिस्टर्ना मैग्ना (तीर द्वारा इंगित) का पर्दाफाश करने के लिए अलग किया जाता है। माइक्रोरेट्रैक्टर का उपयोग मांसपेशियों को अलग रखने के लिए किया जाता है। (ग)सिस्टर्न मैग्ना से सीएसएफ एकत्र करने के लिए एक छोटी ग्लास केशिका ट्यूब का उपयोग किया जाता है। सीएसएफ इंट्राक्रैनियल दबाव के कारण केशिका में अनायास बहती है। तीर केशिका में एकत्र सीएसएफ की ओर इशारा करता है। (D)सीएसएफ को संशोधित 3 मिलीएल सिरिंज के माध्यम से 05 मिलीएल ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: रक्त मस्तिष्क बाधा समारोह और आर-EAE और TMEV-IDD में आईजीजी के इंट्राथेकल संश्लेषण। डॉट ब्लॉट का प्रतिनिधित्व(ए)ल्यूमिनेक्स तकनीक द्वारा मापा गया कुल आईजीजी (एमजी/डीएल) का सीएसएफ स्तर,(बी)एल्बुमिन सीएसएफ/सीरम भागफल (क्यूएल्बुमिन),और(सी)आईजीजी सूचकांक (क्यूआईजी/क्यूएल्बुमिन)आर-ईएई और TMEV-IDD चूहों के साथ-साथ आयु-मिलान नियंत्रण चूहों (सीआर-ईएई और cTMEV-IDD)। क्षैतिज रेखाएं उस समूह के लिए औसत मूल्य का प्रतिनिधित्व करती हैं। पी एंड एलटी; 0.0001; पी एंड एलटी; 0.001; **पी एंड एलटी; 0.01; *पी एंड एलटी; 0.05। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

सीएसएफ प्रोटीन सांद्रता के मूल्यांकन के लिए मात्रात्मक तरीके सीएनएस के शारीरिक और रोग राज्य के लक्षण वर्णन में उपयोगी उपकरण हैं। हालांकि, सीएसएफ प्रोटीन के स्तर के विश्वसनीय मात्राकरण से परे, सीएसएफ प्रोटीन का पता लगाने के लिए परिणामों की अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है जो सीएसएफ में रक्त और सीएनएस-व्युत्पन्न अंशों के बीच भेदभाव करता है। हालांकि, आज तक, आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन क्वांटिफिकेशन परख दो प्रोटीन घटकों के बीच भेदभाव की अनुमति नहीं देते हैं, यहां तक कि उच्च थ्रूपुट उपकरणों की सहायता से भी। इस प्रकार, सीएनएस डिब्बे और रक्त से प्राप्त प्रोटीन के भीतर संश्लेषित प्रोटीन के बीच अंतर करने के लिए प्रोटीन मापन में विशिष्ट सुधार ों का प्रस्ताव किया गया है। इस तरह के सुधार सीरम सांद्रता और बाधा अखंडता दोनों में व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता के लिए क्षतिपूर्ति करते हैं । कुल मिलाकर, ये सुधार सीएसएफ/सीरम भागफल (क्यूप्रोटीन)की गणना पर आधारित होते हैं, जो सीरम प्रोटीन की व्यक्तिगत एकाग्रता में अंतर के कारण परिवर्तनशीलता को कम करता है । बैरियर फ़ंक्शन में व्यक्तिगत मतभेदों से संबंधित क्यूप्रोटीन की भिन्नता को सीएसएफ/सीरम एल्बुमिन भागफल (क्यूएल्बुमिन)से क्यूप्रोटीन से संबंधित करके और कम किया जा सकता है। दोनों सुधारों के संयोजन को आम तौर पर प्रोटीन इंडेक्स के रूप में जाना जाता है और इसकी गणना क्यूप्रोटीन/क्यूएल्बुमिन अनुपात4,6के रूप में की जाती है ।

एल्बुमिन, संश्लेषित और जिगर द्वारा स्रावित, प्रमुख प्लाज्मा प्रोटीन है जो खून में फैलता है। क्योंकि एल्बुमिन सीएनएस के बाहर विशेष रूप से उत्पादित होता है और सीएसएफ में इसका स्तर कम है (~ 0.15 ग्राम/डीएल), सीएसएफ एल्बुमिन का स्तर बढ़ाया गया है, जिससे इंट्राथेकल हेमरेज या दर्दनाक सीएसएफ संग्रह के कारण बीबीआई या रक्त संदूषण को या तो नुकसान होता है। इनमें से किसी भी स्थिति में, एल्बुमिन सीरम से सीरम एकाग्रता के अनुपात में सीआरएफ में स्थानांतरित हो जाता है। इसलिए, रक्त संदूषण के अभाव में, क्यूएल्बुमिन को बाधा समारोह20के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विपरीत, क्यूएल्बुमिन एक अक्षुण्ण बीबीआई21के साथ मनुष्यों और जानवरों में सामान्य पर्वतमाला के भीतर स्थिर रहता है। इंट्राथेकल प्रोटीन संश्लेषण गणना में इस भागफल4,6 का उपयोग करने के लिए एक मौलिक धारणा यह है कि एक टपका हुआ बाधा की उपस्थिति में सीएसएफ प्रोटीन की बढ़ी हुई मात्रा सीएसएफ एल्बुमिन एकाग्रता में वृद्धि के आनुपातिक है। इस धारणा को प्रायोगिक रूप से 1 9 774से एक अध्ययन में पुष्टि की गई है, जिसमें लेखकों ने एमएस रोगियों में स्वस्थ मानव सेरा से प्राप्त रेडियोलेबल आईजीजी और एल्बुमिन के रक्त-सीएसएफ मार्ग पर नजर रखी।

एल्बुमिन के समान, रक्त में कोई भी प्रोटीन बीबीआई को पार कर सकता है। जब बाधा बरकरार है, क्यूप्रोटीन अपेक्षाकृत स्थिर है । एल्बुमिन के विपरीत, हालांकि, कई प्रोटीन को सीएनएस के भीतर संश्लेषित भी किया जा सकता है। नतीजतन, एक बदल क्यूप्रोटीन एक क्षतिग्रस्त बाधा और/या वृद्धि इंट्राथेकल प्रोटीन उत्पादन से परिणाम कर सकते हैं । फिर भी, जब एक ऊंचा सीएसएफ प्रोटीन एकाग्रता सिर्फ एक समझौता बीबीआई के कारण है, दोनों क्यूप्रोटीन और क्यूएल्बुमिन के लिए मूल्यों में वृद्धि कर रहे हैं, एक बरकरार बाधा के साथ जानवरों में इन एक ही भागभाग के लिए मूल्यों की तुलना में । इसके विपरीत, जब बाधा बरकरार है, सीएसएफ प्रोटीन सांद्रता में वृद्धि इंट्राथेकल संश्लेषण के कारण सबसे अधिक संभावना है, और केवल क्यूप्रोटीन अंततः बढ़ जाता है ।

प्रोटीन सूचकांक का उपयोग आंशिक रूप से पांच कारकों द्वारा सीमित किया जा सकता है: 1) स्वस्थ जानवरों में सीएसएफ एल्बुमिन एकाग्रता की बड़ी परिवर्तनशीलता, 2) प्रोटीन के विभिन्न हाइड्रोडायनामिक त्रिज्या, 3) प्रोटीन की एंडोजेनस सीएनएस अभिव्यक्ति, 4) विभिन्न नमूना तकनीक, और 5) बीबीआई के रूपात्मक मतभेद। स्वस्थ जानवरों में सीएसएफ एल्बुमिन एकाग्रता की बड़ी परिवर्तनशीलता के परिणामस्वरूप अंतिम प्रोटीन सूचकांक के लिए मूल्यों में काफी परिवर्तनशीलता होती है। उदाहरण के लिए, मनुष्यों में, क्यूएल्बुमिन उम्र पर निर्भर है क्योंकि यह22साल की उम्र के साथ बढ़ता है। एक पिछली रिपोर्ट में एक स्वस्थ जनसंख्या23में क्यूएल्बुमिन में सेक्स आधारित अंतर का भी उल्लेख किया गया था । इसी तरह, चूहों एल्बुमिन सांद्रता में उम्र और माउस तनाव24पर निर्भर करते हैं, उदाहरण के लिए, युवा, पुरुष, C57Bl/6 चूहों के लिए क्यूएल्बुमिन पुराने, महिला, डीबीए/1जे चूहों के लिए क्यूएल्बुमिन से अलग हो सकता है । इसलिए, बाधा अखंडता के लिए मानकीकृत संदर्भ अंतराल प्रजातियों में और भीतर स्थापित नहीं किया जा सकता है, और उचित थ्रेसहोल्ड विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर गणना की जानी चाहिए ।

प्रोटीन के बीच सामान्य अनुक्रमित में परिवर्तनशीलता पैदा करने वाला एक अन्य कारक उनका आणविक आकार है। बीबीआई के माध्यम से सीरम प्रोटीन का पारित होना उनके आणविक आकार पर निर्भर करता है, और निकासी दर और आणविक वजन (मेगावाट) के बीच सहसंबंध व्यापक रूप से बीबीआई की पारगम्यता का मूल्यांकन करने के लिए उपयोग किया जाता है। सामान्य प्रोटीन संरचनाएं दसियों से कई हजार अमीनो एसिड तक आकार में होती हैं। कुछ प्रोटीन अपेक्षाकृत छोटे आणविक आकार के होते हैं, जैसे कि केमोकिन्स, 8 से 20 केडीए के बीच आणविक वजन के साथ। इस तरह के एक कम मेगावाट बीबीआई के पार एहसान, अंततः उच्च सामांय प्रोटीन अनुक्रमित में जिसके परिणामस्वरूप । अलग तरह से, आईजीएम जैसे अन्य प्रोटीन बहुत बड़े (900−950 केडीए) हैं, इसलिए सामान्यपरिस्थितियों6 में बहुत कम अनुक्रमित दिखाई देते हैं। हालांकि, यह हमेशा मामला नहीं है, क्योंकि, एक समान मेगावाट के बावजूद, कुछ प्रोटीन बाधा बहुत अंय प्रोटीन की तुलना में बेहतर रिस, संभवतः क्योंकि एक अलग आकार की । इस प्रकार, प्रोटीन का प्रसार गुणांक, और इसलिए हाइड्रोडायनामिक रेडी की गणना25अणुओं के आकार और आकार दोनों पर निर्भर करती है। ज्यामितीय और प्रोटीन की हाइड्रोडायनामिक मात्रा के बीच बुनियादी अंतर 150 केडीए से ऊपर बड़े प्रोटीन के साथ सबसे स्पष्ट हो जाता है। उदाहरण के लिए, सेरुलोप्लास्मिन (132 केडीए), आईजीजी (150 केडीए), और आईजीए (150 केडीए) की घटती निकासी दर इन तीन प्रोटीनों की हाइड्रोडायनामिक विषमता को दर्शाती है, जिसमें समान मेगावाट25है। यह भी संभव है कि सामान्य परिस्थितियों में प्रोटीन का इंट्राथेकल उत्पादन हो। कुछ केमोकिन, उदाहरण के लिए, CXCL10, आम तौर पर इंट्राथेकैली का उत्पादन किया जाता है, जबकि अन्य, जैसे, CXCL13,26,27नहीं हैं। इसका मतलब यह है कि अधिकांश प्रयोगात्मक परिस्थितियों में प्रोटीन इंडेक्स की व्याख्या के लिए आम तौर पर आयु-, लिंग-और तनाव से मिलान किए गए अनुपचारित नियंत्रणों के विश्लेषण की आवश्यकता होती है।

तरल पदार्थों में प्रोटीन का स्तर विभिन्न नमूना तकनीकों से भी प्रभावित हो सकता है। हालांकि यह सीएसएफ संग्रह के लिए एक मुद्दा नहीं हो सकता है जैसा कि यहां वर्णित है - वर्णित अस्तित्व और गैर-अस्तित्व प्रक्रियाओं के बीच सीएसएफ नमूने में कोई अंतर नहीं है - विभिन्न रक्त संग्रह विधियों का कुल सीरम प्रोटीन राशि पर प्रभाव पड़ सकता है। रक्त संग्रह के कुछ तरीके धमनी रक्त प्राप्त करते हैं, अन्य रक्त निकलते हैं, जबकि अभी भी अन्य दोनों14का मिश्रण पैदा करते हैं। अस्तित्व रेट्रो-कक्षीय रक्तस्राव से प्राप्त नमूना विषैले रक्त और ऊतक तरल पदार्थ का मिश्रण है, जबकि हृदय पंचर से टर्मिनल रक्त संग्रह विषैले या धमनी रक्त या दोनों14का मिश्रण पैदा कर सकता है। स्वस्थ जानवरों में, धमनी रक्त सीरम की कुल प्रोटीन और एल्बुमिन सामग्री वेणुस रक्त सीरम28के समान अंशों की तुलना में थोड़ी अधिक हो सकती है। जीवित रहने और जीवित न रहने वाले नमूनों की तुलना किए जाने पर इस पर विचार किया जाना चाहिए।

अंत में, विचार करने के लिए एक महत्वपूर्ण विशेषता बीबीआई की विषम रूपात्मक संरचना है, जिसमें कम से कम दो अलग-अलग बाधाएं, मस्तिष्क माइक्रोवेस के एंडोथेलियम पर स्थित रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) और कोरॉयड प्लेक्सस29के एपिथेलियम पर स्थित रक्त-सीएसएफ बैरियर (बीसीएफ) शामिल हैं। दोनों बाधाएं परिधीय और सेरेब्रोस्पाइनल डिब्बों के बीच अणुओं और कोशिकाओं के मार्ग को प्रतिबंधित और विनियमित करती हैं, हालांकि वे विभिन्न तंत्रों द्वारा ऐसा करते हैं। जबकि बीबीबी एक वास्तविक शारीरिक बाधा है, जो कोशिकाओं के बीच एक जटिल परस्पर क्रिया की विशेषता है, बीसीएसएफ एक शारीरिक बाधा है, जो ज्यादातर सीएसएफ प्रवाह पर निर्भर करती है। न्यूरोलॉजिकल स्थितियों और/या आघात के कारण सीएसएफ उत्पादन, रिलीज और प्रवाह दर में कटौती बीसीएसएफ कार्य को ख़राब करती है, जिससे क्यूएल्बुमिन9,30,31, 32में वृद्धि होती है । इसलिए, क्यूएल्बुमिन बीबीबी या आम तौर पर बीबीआई परगम्यता के बजाय बीसीएसएफ परगम्यता के बेहतर मार्कर के रूप में कार्य करता है।

संक्षेप में, प्रोटीन इंडेक्स की गणना ट्रांसड्यूडेट और इंट्राथेकैली उत्पादित प्रोटीन के बीच भेदभाव के लिए अपेक्षाकृत सरल और अच्छी तरह से विशेषता वाली विधि है। सीएसएफ नमूनों में प्रोटीन के सामान्य माप को सही करने के लिए इस फार्मूले को लागू करने का लाभ यह है कि यह प्रोटीन के इंट्राथेकल संश्लेषण की मात्रा निर्धारित करने और बीबीआई, विशेष रूप से बीसीएसएफ, (डीआईएस) कार्य को मापने के लिए एक उद्देश्य चर उत्पन्न करता है। इस दृष्टिकोण की मजबूती को देखते हुए, क्यूएल्बुमिन और प्रोटीन इंडेक्स के माध्यम से सीएसएफ प्रोटीन की मात्रा में सुधार एक आधार रेखा प्रदान करता है जिसके खिलाफ किसी भी सीएसएफ प्रोटीन की पैथोफिजियोलॉजिक उत्पत्ति का आकलन (1) और (2) बाधा अखंडता की स्थिरता और कार्यात्मक महत्व है। यहां यह एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, सीएसएफ और रक्त संग्रह से अंतिम गणना के लिए कुल सीएसएफ प्रोटीन राशि है, जो तंत्रिका विज्ञान रोगों के लिए माउस मॉडल पर लागू होता है सही । हालांकि, एक ही प्रोटोकॉल आसानी से सीएसएफ और मनुष्यों सहित किसी भी जानवर में प्रोटीन के इंट्राथेकल संश्लेषण के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । क्यूएल्बुमिन और आईजीजी इंडेक्स पहले से ही आमतौर पर भड़काऊ न्यूरोलॉजिकल रोगों के निदान के लिए नैदानिक अभ्यास में उपयोग किया जाता है6। इन मापदंडों का सफलतापूर्वकउपयोग26,33,34रोगों वाले रोगियों में साइटोकिन्स और केमोकिनकी की एक विस्तृत श्रृंखला का मूल्यांकन करने के लिए किया गया है ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक इन अध्ययनों के लिए इस्तेमाल चूहों की अपनी विशेषज्ञ देखभाल के लिए डार्टमाउथ में तुलनात्मक चिकित्सा और अनुसंधान (CCMR) के लिए केंद्र के कर्मचारियों का शुक्रिया अदा करते हैं । बोर्नस्टीन रिसर्च फंड ने इस शोध को वित्त पोषित किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

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References

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