Kvantitativ måling av Intratekalt syntetisert proteiner i mus

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Forhøyede spinalvæske proteinnivåer kan enten være et resultat av diffusjon av plasma protein over en endret blod-hjerne barriere eller intratekal syntese. En optimalisert test protokollen er presentert i denne artikkelen som bidrar til å diskriminere begge tilfeller og gir kvantitative målinger av intratekalt syntetisert proteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gilli, F., Welsh, N. C., Linzey, M. R., Royce, D. B., DiSano, K. D., Pachner, A. R. Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice. J. Vis. Exp. (153), e60495, doi:10.3791/60495 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Spinalvæske (CSF), en væske som finnes i hjernen og ryggmargen, er av stor betydning for både grunnleggende og klinisk vitenskap. Analysen av CSF protein sammensetning leverer viktig informasjon i grunnleggende nevrovitenskap forskning så vel som nevrologiske sykdommer. En påminnelse er at proteiner målt i CSF kan utlede fra både intratekal syntese og transudation fra serum, og proteinanalyse av CSF kan bare bestemme summen av disse to komponentene. Å diskriminere mellom protein transudation fra blodet og intratekalt produserte proteiner i dyremodeller så vel som hos mennesker, CSF protein profilering målinger ved hjelp av konvensjonelle proteinanalyse verktøy må inkludere beregning av albumin CSF/serum kvotienten (Qalbumin), en markør for integriteten av blod-hjerne-GRENSESNITTET (bbI), og protein indeksen (Qprotein/qalbumin), et anslag på intratekal proteinsyntese. Denne protokollen illustrerer hele prosedyren, fra CSF og blod samling til kvotienter og indekser beregninger, for kvantitativ måling av intratekal proteinsyntese og BBI svekkelse i musen modeller av nevrologiske lidelser.

Introduction

Spinalvæske (CSF), en klar og fargeløs væske rundt hjernen og ryggmargen, har stor klinisk og grunnleggende vitenskapelig betydning. CSF bevarer det elektrolytisk miljøet i sentralnervesystemet (CNS), balanserer systemisk syre-base-status, leverer næringsstoffer til neuronal og gliacellene celler, fungerer som et lymfesystemet for CNS, og transporterer hormoner, nevrotransmittere, cytokiner og andre nevropeptider i hele CNS1. Således, som CSF sammensetningen reflekterer aktiviteten til CNS, tilbyr denne væsken en verdifull, men indirekte, tilgang til å karakterisere den fysiologiske og patologiske tilstand av CNS.

CSF har blitt brukt til å diagnostisere forhold som påvirker CNS i over hundre år, og for det meste av denne tiden, ble det først og fremst studert av klinikere som et diagnostisk verktøy. Men i de senere årene neurobiologists har anerkjent potensialet i CSF for å studere patofysiologi av CNS. Spesielt har flere høy gjennomstrømming proteinanalyse verktøy blitt innført i nevrovitenskap riket slik at en detaljert studie av protein sammensetningen av CSF, med en forventning om at denne analysen kan bidra til å gi innsikt i de dynamiske endringene som oppstår i CNS.

Teknologisk utvikling i multiplex immunanalysen teknikker som Luminex og Simoa Technologies2,3, gir forskerne i dag med evnen til å oppdage hundrevis av proteiner ved svært lave konsentrasjoner. Videre, de samme teknologiene tillater bruk av små prøve volumer, og dermed fremme studier i små dyr, inkludert mus, der begrenset utvalg volumer av CSF har utelukket detaljerte characterizations av væsken inntil nylig.

Likevel, en påminnelse er at proteiner målt i CSF kan utlede fra intratekal syntese og/eller transudation fra serum på grunn av en skadet blod-hjerne-grensesnitt (BBI). Dessverre kan proteinanalyse av CSF alene bare bestemme summen av disse to komponentene. For å diskriminere mellom transudat og intratekalt produserte proteiner, må CSF protein målinger ved hjelp av et tilgjengelig proteinanalyse verktøy justeres for individuell variasjon i serumkonsentrasjoner, samt barriere integritet. Men selv om denne justeringen brukes ofte i klinisk praksis, for eksempel CSF IgG-indeksen, som har høy følsomhet for å oppdage intratekal IgG syntese4,5,6, hittil svært få forskningsstudier har korrigert CSF protein konsentrasjoner for serumkonsentrasjon og barriere integritet7,8.

Foreløpig er Reibergram tilnærmingen den beste måten å bestemme barrierefunksjon og intratekal syntese av proteiner. Det er en grafisk evaluering i CSF/serum kvotienten diagrammer som analyserer, på en integrert måte, både barrieren (Dys) funksjon og intratekal proteinsyntese, med henvisning til en utelukkende blod-avledet protein9,10. Den svært rikelig protein albumin er vanligvis valgt som referanse protein fordi det er produsert bare i leveren og fordi størrelsen, ca 70 kDa, er middels mellom små og store proteiner11. Analysen diagrammet ble først definert av Reiber og Felgenhauer i 1987 for de store klassene av immunglobuliner (igs)11, som empirisk basert på resultatene Hentet fra analyse av tusenvis av menneskelige prøver9. Tilnærmingen ble senere bekreftet av anvendelsen av de to Fick ' s lover diffusjon i teorien om molekylær diffusjon/flow rate12. En slik teori demonstrerer spredningen av et protein gjennom barrieren har en hyperbolske fordeling og kan kvantitativt forklare dynamikken av proteiner i CNS9,13. Samlet sett er fordelen med å bruke Reibergram for å demonstrere intratekal proteinsyntese at det samtidig identifiserer protein fraksjon som kommer inn i CSF fra serum samt mengden protein som finnes i CSF på grunn av lokal produksjon.

Den nåværende artikkelen og den relaterte protokollen beskriver hele prosedyren, fra CSF og blod samling til den endelige beregningene korrigere CSF proteinnivåer, for den kvantitative måling av intratekal proteinsyntese i musemodeller av nevrologiske Lidelser. Denne prosedyren gir en Baseline mot å vurdere (1) den patofysiologiske opprinnelsen til noen CSF protein og (2) stabilitet og funksjonell betydning av barriere integritet. Denne prosedyren og protokollen er ikke bare nyttig for å vurdere musen CSF prøver, men er også nyttig i å analysere CSF i en rekke dyremodeller av nevrologiske sykdommer og menneskelige pasienter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeide utnytter protokoller anmelder og anerkjent av det institusjonell dyr bekymre og bruk komité (IACUC) for Geisel skolen av medisin for Dartmouth.

1. innsamling av væsker

Merk: både serum og CSF er nødvendig. To protokoller for hver væske samling er nødvendig for å overleve og obduksjon.

  1. Serum og CSF-kolleksjon ved hjelp av overlevelses prosedyrer
    Merk: for å overleve væske samling, bør serum samling foran CSF samlingen som det er en mindre invasiv prosedyre. CSF må fås innen en uke av serum uavgjort.
    1. Retro-orbital blødning prosedyre for serum samling.
      Merk: denne prosedyren er for å overleve blødning av mus14. Fremgangsmåten beskrevet gjelder for alle aldre, kjønn, og belastningen av mus. Siden IACUC regler tilsier at et maksimalt blod volum på 1% av kroppsvekten kan fjernes som en enkelt blodprøve, anbefales det at prosedyren utføres bare på mus som veier mer enn 15 g.
      1. Flytt burene som inneholder mus fra stativet til et passende arbeidsområde. Klargjør anestesi gass maskinen ved å slå på oksygen strømningsmåleren til 1 L/min.
      2. Plasser dyret i induksjon kammeret og Lukk lokket tett. Slå på isoflurane fordamper til 3,5% og overvåke dyret til tilbakelent.
      3. Fjern dyret fra kammeret og vurdere nivået av anestesi ved pedal refleks, dvs, fast footpad knipe. Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi før du utfører prosedyren: mangel på respons på en fast knipe indikerer tilstrekkelig anestesi.
      4. Holde anesthetized musen ved å fatte den løse huden bak ørene med tommelen og pekefingeren på den ikke-dominerende hånd. Bule øynene ved å bruke pekefingeren til å trekke tilbake huden over øyet og tommelen for å trekke tilbake huden under øynene.
      5. Plasser tuppen av en Pasteur-pipette inn i øye kontakten under øyeeplet (figur 1, venstre panel), og dirigere spissen på omtrent 45 ° mot midten av øye kontakten (figur 1, høyre panel). Roter pipette mellom fingrene under den fremre passasjen. Påfør forsiktig trykk og slipp deretter til blodet går inn i pipette.
        Merk: maksimalt antall blod som kan trekkes tilbake på en gang fra dette stedet er ca 1% av kroppsvekten, for eksempel 0,2 mL fra en 20 g mus.
      6. Fjern forsiktig kapillær for å hindre skade på øyet og plassere innsamlet blod i et 1,5 mL sentrifugerør. Lukk øyelokket og påfør mildt trykk med gasbind for å hindre ytterligere blødning. Når den er fullstendig våken og mobil (vanligvis 3 − 5 min), returner musen til holde buret.
      7. Tillat blodpropp i 30 − 60 min ved romtemperatur (RT), deretter sentrifuger blod i 10 min ved 2 000 x g i en 4 ° c nedkjølt sentrifuge. Bruk en ren pipette for å samle serum i et nytt, merket 0,5 mL hetteglass. Umiddelbart fryse hetteglass med serum ved-80 ° c.
    2. CSF samling med overlevelse prosedyre
      Merk: denne prosedyren er for overlevelse kirurgi, og det er basert på protokollen utgitt av Liu og Duff i 200815. Musene anesthetized av en ketamin (20 mg/mL), xylazine (0,5 mg/mL) og acepromazine (0,5 mg/mL) cocktail administrert intraperitonealt.
      1. Flytt burene som inneholder mus fra stativet til et utpekt operasjons arbeidsområde. Forbered operasjons plass i et sterilt miljø. Sørg for at alle instrumenter og materialer steriliseres før operasjonen.
      2. Veie musen og beregne anestesi volumet nødvendig (0,1 mL anestesi cocktail for en 20 g mus). Injiser anestesi intraperitonealt16. Etter noen minutter, test musen ved å knipe footpad for å sikre tilstrekkelig anestesi. Hvis mer bedøvelse er nødvendig, ytterligere injisere 0,01 − 0.03 mL av bedøvelse cocktail.
      3. Bruk en saks eller en barbermaskin til å barbere et lite område av hodet, på den caudal enden, midtre del av skallen, for å eksponere stort nok arbeidsområde for CSF-kolleksjon. Plasser musen i liggende posisjon på stereotaxic instrument, og støtt hodet ved hjelp av øre linjer (figur 2a).
        Merk: musen er lagt ned slik at hodet danner en nesten 135 ° vinkel med kroppen (figur 2a). Når Dyret er plassert, brukes en kirurgisk gardin for å opprettholde et sterilt felt på operasjonsstedet. Clear selvklebende gardiner foretrekkes for CSF samling i mus, som de tillater for direkte og mer fokusert visualisering av dyret.
      4. Tørk operasjonsstedet med 30% klorheksidin diacetate. Ved hjelp av en steril skalpell, lage en sagittal snitt av huden dårligere enn bakhodet å utsette musklene overliggende i Cisterna magna.
      5. Ved stump disseksjon med tang, skille subkutant vev og muskler for å avdekke Cisterna magna (figur 2b). Bruk microretractors å holde musklene fra hverandre (figur 2b) og utsett Dura mater meningeal lag over Cisterna magna.
      6. Vask forsiktig med sterilt fosfat-bufret saltvann (PBS) for å fjerne eventuell mulig blod forurensning. Blot tørke Dura mater med en steril bomullsdott og forsiktig punktering av membranen dekker Cisterna magna med en 30 G nål. Raskt og forsiktig sette inn et lite glass kapillærrør for å samle CSF (figur 2C).
        Merk: intrakraniell trykk gjør at CSF kan strømme spontant inn i kapillær (figur 2C). Avhengig av alder og størrelse på musen oppnås omtrent 5 − 12 μL av CSF fra hver mus.
      7. Fjern kapillærrøret forsiktig fra membranen. Koble røret til en 3 mL sprøyte gjennom en polyetylen slange (tabell over materialer) og injisere den innsamlede CSF i et merket 0,5 ml rør (figur 2D). Hold hetteglassene i isen.
      8. Lukk snitt ved hjelp av polydioxanone Sutur (PDS) med engangsnål og ved hjelp av begravet sting17. Rengjør av arealet av noe tørket blod eller vev.
      9. Injiser mus, subkutant eller intraperitonealt16, med 0,05 − 0,1 mg/kg av buprenorfin-hydrochloride som smertestillende behandling. Injiser også subkutant 1 mL sterilt saltvann for å forhindre dehydrering.
      10. Plasser musen tilbake i et rent og varmt bur for å bli frisk. Når musen er mobil og i stand til å nå mat og vann, plassere buret tilbake på stativet.
      11. Sentrifuger CSF for 10 min ved 1 000 x g i en 4 ° c nedkjølt sentrifuge. Kontroller graden av blod forurensning ved visuell inspeksjon for identifisering av xanthochromia og tilstedeværelsen av en rød pellet i bunnen av røret. Kast blod-forurenset prøver.
        Merk: formelen benyttet for korreksjon av CSF protein beløp i blod-forurenset prøvene er basert på ligningen parametre som inkluderer proteininnhold i CSF og serum, hematokrit (HCT), og røde blodlegemer (RBC) telle i CSF og blod18. Imidlertid kan en slik korreksjon strategi ikke enkelt brukes på musen CSF eksemplarer på grunn av lite volum, derfor begrense korreksjon strategien til en visuell inspeksjon.
      12. Ved hjelp av en ren pipette teknikk, samle CSF inn i en ny 0,2 mL tube, etterlater pellet med celler. Fortynne CSF 1:3 med PBS å redusere volumet tap på grunn av aerosol. Fryse hetteglasset med CSF ved-80 ° c umiddelbart.
  2. Serum og CSF samling ved hjelp av ikke-overlevelse prosedyrer
    Merk: for ikke-overlevelse væske samling, CSF samlingen kommer før serum samling som musen må ha en puls.
    1. CSF samling på obduksjon
      Merk: denne prosedyren er for ikke-overlevelse kirurgi, og ca 10 − 20 μL av CSF er innhentet fra hver mus. En steril kirurgisk feltet anbefales, men ikke nødvendig for ikke-overlevelse kirurgi.
      1. Flytt burene som inneholder mus fra stativet, til et komfortabelt arbeidsområde. Følg trinn 1.1.2.2 − 1.1.2.7 og 1.1.2.11 − 1.1.2.12 for CSF-kolleksjonen. Fortsett til seksjon 1.2.2 for serum samling.
    2. Blood samling via intrakardielle punktering (åpen tilnærming)
      Merk: forventet antall blod volumer er ca. 3% av kroppsvekten, for eksempel 0,6 mL fra en 20 g mus.
      1. Etter CSF-kolleksjonen sikrer du at musen fortsatt er tilstrekkelig anesthetized ved å knipe footpad. Hvis noen reaksjon er observert, administrere en andre dose av bedøvelse. Hvis ingen reaksjon er observert, Fortsett.
      2. Plasser dyret på baksiden og tørk huden på magen med 70% alkohol. Med kirurgisk saks, åpne bryst hulen og utsett hjertet. Sett inn en 25 G nål (festet til en 3 mL sprøyte) i venstre ventrikkel og forsiktig Påfør negativt Trykk på sprøytestempelet. Trekk ut nålen etter at blodet er samlet.
      3. Utfør en sekundær metode for døds død som halshogging eller cervical forvridning å sikre at dyret er avdøde.
      4. Skyv stempelet på sprøyten ned og Injiser det innsamlede blodet inn i et 1,5 mL hetteglass. Tillat blodpropp i 30-60 min på RT og deretter sentrifuger den i 10 min ved 2 000 x g i en 4 ° c nedkjølt sentrifuge.
      5. Ved hjelp av ren pipette, samle serum i et nytt, merket 0,5 mL hetteglass. Umiddelbart fryse hetteglass med serum ved en-80 ° c fryser.

2. protein analyse

  1. Bruk en foretrukket metode, for eksempel Luminex teknologi, for kvantifisere mål protein (r) og albumin i matchet serum og CSF eksemplarer.
    Merk: Her er et eksempel gitt med Luminex magnetisk teknologi, men praktisk talt enhver teknikk som måler protein mengder, inkludert enzym-koblet immunosorbentanalyse analyser (ELISAs), kan brukes til gjeldende protokoll. Ideelt sett er CSF og serumprøver kjøres for både albumin og målrette proteiner på samme plattform. Analysen forhold må være optimalisert for viktige trinn i protokollen som antigen-perle kopling konsentrasjon, serum og CSF sample fortynninger, best egnet standard kurver for hver analytt, og buffer sammensetning for å redusere ikke-spesifikke reaktivitet. Hvis et kommersielt sett brukes til protein måling (s), for eksempel immunglobulin isotyping sett (Tabell av materialer) som brukes til å innhente dataFigur 3må produsentens instruksjoner følges.
    1. Ved tine og før analyse, sentrifuger CSF og serumprøver (2 000 x g i 10 min) og bruke supernatanten for å hindre tilstopping av filter platene og/eller sonde. Følg analysen prosedyren leveres med Kit for passende prøve fortynninger. Ellers, bestemme riktig fortynning for hver analytt og væske. Fortynne prøvene i PBS tilsvarende.
      Merk: Hvis det ikke er noen spesifikk veiledning eller instruksjoner, må det etableres fortynninger for hver analytt og væske før studie testen, ved å bestemme de aktuelle fortynnings områdene som er nødvendige for å oppnå konsentrasjons estimater som faller innenfor de pålitelig område av en standard kurve. Å vite egenskapene til den biologiske prøven som skal analyseres, for eksempel fysiologiske og patologiske konsentrasjoner i væsken, gjør det mulig å prøve forskjellige fortynninger med prøver av lav, middels og høy analytt innhold. Hvis forventet spekter av konsentrasjoner i prøvene er kjent a priori, kan fortynninger velges etter beregning hvor mange ganger prøven må fortynnes for å være innenfor den valgte standard kurve rekkevidde.
      FORSIKTIG: ved beregning av fortynning faktorer, husk at CSF har allerede blitt fortynnet 1:3.
    2. Forbered en standard kurve for hvert protein av interesse, for eksempel, albumin og IgG som brukes til å generere data i Figur 3, ved seriell fortynning referanse standard proteiner. Under utarbeidelsen av standard kurver, bland hver høyere konsentrasjon nøye før du gjør neste fortynning.
      Merk: uavhengig av den valgte metoden for kvantifisering er det viktig å inkludere en standard kurve hver gang analysen utføres for å anslå konsentrasjonen av protein (er) i prøver. Det beste valget for en referanse standard er en renset, kjent konsentrasjon av protein av interesse. Bestemme på den spesifikke fortynninger, samt antall datapunkter og replikerer brukes til å definere standard kurve, avhenger av graden av ikke-linearitet i standardkurven.
    3. Velg riktig antistoff-sammenkoblede magnetiske perle sett (tabell med materialer). For individuelle hetteglass med perler, sonikere hvert hetteglass for 30 s og Vortex i 1 min. Forbered en "arbeids perler blanding" ved å fortynne perle bestandene til en endelig konsentrasjon av 50 perler av hvert sett/μL i analysen/vask buffer (PBS, 1% storfe serum albumin [BSA]). Tilsett 50 μL av blandede perler i hver brønn i en flat bunn 96-brønn plate (tabell over materialer).
      FORSIKTIG: de fluorescerende perlene er lysfølsomme. Derfor bør de beskyttes mot langvarig eksponering for lys gjennom hele prosedyren.
    4. Diagram plasseringen av bakgrunner, standarder og prøver på et godt kart regneark.
    5. Tilsett 50 μL av analyse/vaskebuffer i hver bakgrunns brønn, og 50 μL av hver standard til brønnene for standardkurven. Last 50 mL av hvert utvannet prøve inn i de aktuelle brønnene sist. Pakk platen med folie og ruge med agitasjon (~ 800 RPM) på en plate shaker i 30 min ved RT.
    6. Plasser platen på en håndholdt magnet (tabell av materialer) og hvile platen på magneten for ~ 60 s for å tillate fullstendig innstilling av magnetiske perler. Fjern godt innhold ved å forsiktig decanting platen og trykkplaten på absorberende pads for å fjerne rester av væske.
    7. Vask platen ved å fjerne den fra magneten, ved å tilsette 200 μL av analysen/vaskebuffer, ved risting for ~ 30 s, og til slutt ved å knytte den til magneten. Gjenta vask 3x.
    8. Fortynne biotinylated deteksjon antistoff, dvs. biotin-merket antistoff hevet mot protein verts arter, til 4 μg/mL i analysen/vask buffer. Tilsett 50 μL av det fortynnede deteksjons antistoff i hver brønn. Dekkplaten og ruge i 30 min på RT på tallerkenen shaker på ~ 800 RPM. Plasser platen på magneten og gjenta trinn 2.1.6 og 2.1.7.
    9. Fortynne fykoerytrin (PE)-bøyd streptavidin (SAPE) til 4 μg/mL i analyse/vaskebuffer. Tilsett 50 μL av fortynnet SAPE i hver brønn. Dekkplaten og ruge i 30 min på RT på tallerkenen shaker på ~ 800 RPM. Plasser platen på magneten og gjenta trinn 2.1.6 og 2.1.7.
    10. Fjern platen fra magneten og resuspend perlene i 100-μL av analyse/vaskebuffer. Les brønner med en dual laser Flow-basert deteksjon instrument som gjør det mulig for påvisning av omfanget av PE fluorescens intensitet (FI).
      Merk: signalet, for eksempel, FI, genereres er proporsjonal med mengden av målet antigen festet til overflaten av perlene.
    11. Eksporter rådata og Opprett standard kurver med grafisk deteksjons signal FI kontra standard protein konsentrasjoner. Bruk standardkurven (e) til å beregne konsentrasjonen av analytt (e) i prøvene.
      Merk: albumin er fortrinnsvis uttrykt i g/dL, mens proteiner av interesse er fortrinnsvis uttrykt i mg/dL.

3. intratekal indeks beregninger

  1. Organiser protein konsentrasjons verdier i et regneark, og analyser resultatene ved å bruke følgende formler.
  2. Beregn Qalbumin:
    Equation 1
    der CSFalbumin og serumalbumin er konsentrasjoner av albumin i matchet serum og CSF eksemplarer, henholdsvis.
  3. Beregn Q-protein:
    Equation 2
    hvor CSFprotein og serumprotein er konsentrasjoner av mål protein (er) i matchet serum og CSF eksemplarer, henholdsvis.
  4. Beregn protein indeksen:
    Equation 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette representative eksperimentet hadde som mål å sammenligne intratekal syntese av IgG i to klinisk relevante gnager modeller av multippel sklerose (MS): PLP139-151-indusert relapsing eksperimentelle autoimmune Encefalomyelitt (R-eae) og den kroniske progressive, Theiler ' s murine encefalomyelitt virus-indusert demyeliniserende sykdom (TMEV-IDD). R-EAE er en nyttig modell for forståelse relapsing-remittering MULTIPLE SCLEROSIS, mens det TMEV-IDD modell vise egenskaper kronisk progressiv MULTIPLE SCLEROSIS19.

For denne studien er det utført en kvantitativ analyse av den intratekal IgG-syntesen i R-EAE (n = 12) og TMEV-IDD (n = 28). Begge gruppene ble analysert på toppen av sin sykdom. En ekstra gruppe på 10 mus ble humbug behandlet og tjente som alder-matchet kontroll grupper (cR-EAE n = 4, cTMEV-IDD humbug n = 6).

En magnetisk perle BAS ert tilnærming med det kommersielt tilgjengelige settet (tabell over materialer) ble brukt til å måle total IgG i samsvarende serum-og CSF-prøver. Den totale IgG-verdien ble avledet fra summen av de underklasse IgG1-, IgG2a-, IgG2b-og IgG3-verdiene. Albumin ble målt med en kommersiell mus albumin ELISA Kit (tabell over materialer) fordi en Luminex analysen for albumin var ikke tilgjengelig på den tiden. Alle målinger ble utført nøye etter produsentens instruksjoner. Albumin kvotienten (Qalbumin) og IgG-indeksen (qIgG/qalbumin) ble deretter brukt til å differensiere blod-VERSUS CNS-avledet IgG i CSF.

Som vist i figur 3a, er faktiske nivåer av totalt IgG betydelig økt i CSF av begge gnager modeller av MS i forhold til de tilsvarende alders-matchet humbug kontroller (p ≤ 0,026). Men R-EAE mus viser betydelig forbedret Qalbumin verdier (p ≤ 0,019), indikerer økt permeabilitet av barrieren i disse musene (figur 3b). Omvendt, ingen forskjeller i Qalbumin eksisterer mellom TMEV-IDD og Sham mus (p = 0,49), og dermed bekrefter vår tidligere funn av en intakt barriere i TMEV-IDD mus7,8. For ytterligere å diskriminere mellom transudat og intratekalt produsert IgG i R-EAE og TMEV-IDD, ble IgG-indeksen målt, viser signifikant høyere verdier i TMEV-IDD mus (p ≤ 0,0006), og derfor intratekal IgG produksjon i denne modellen (figur 3c).

En intakt barriere i TMEV-IDD mus sammen med en høy IgG indeks antyder at i denne modellen, antistoff produseres i CNS. Omvendt, i R-EAE, en betydelig barriere sammenbrudd og en lav IgG indeks gir bevis for at CSF IgG er hovedsakelig produsert av perifere stedet intratekal B-celler, også noe som tyder på at i denne akutte modellen av MS, CSF IgG er hovedsakelig avledet fra serum.

Figure 1
Figur 1: retro-orbital blødning av mus. Venstre: riktig plassering av nålen i forhold til retro-orbital sinus, øyeeplet og baksiden av banen. Høyre: pipette plasseringen begynner i midtre canthus av øyet og glir til rygg aspektet i bane. Kapillær er satt inn i en vinkel på 45 °. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: CSF samling i mus. (A) øret barer støtte hodet av musen, og musen er lagt ned slik at hodet danner en 135 ° vinkel med kroppen. Pilen peker på eksponert Cisterna magna. (B) ved Blunt disseksjon med pinsett, er musklene separert for å utsette Cisterna magna (pekte på pilen). Microretractors brukes til å holde musklene fra hverandre. (C) et lite glass kapillærrør brukes til å samle CSF fra Cisterna magna. CSF renner spontant inn i kapillær, på grunn av intrakraniell trykk. Pilen peker på den innsamlede CSF i kapillær. (D) CSF overføres til en 0,5 ml rør gjennom en modifisert 3 ml sprøyte. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Blood-Brain barrierefunksjon og intratekal syntese av IgG i R-eae og TMEV-IDD. Dot blot representerer (A) CSF nivåer av total IgG (mg/dl) målt ved Luminex teknologi, (B) albumin CSF/serum kvotienter (Qalbumin), og (C) IgG indekser (qIG/Qalbumin) i R-eae og TMEV-IDD mus samt alder-matchet kontroll mus (CR-eae og cTMEV-IDD). Vannrette linjer representerer median verdien for denne gruppen. p < 0,0001; p < 0,001; * *p < 0,01; *p < 0,05. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitative metoder for evaluering av økt CSF protein konsentrasjoner er nyttige verktøy i karakterisering av fysiologiske og patologiske tilstand av CNS. Men utover pålitelig kvantifisering av CSF proteinnivåer, påvisning av CSF proteiner krever et uttrykk for resultater som diskriminerer mellom blod-og CNS-avledet fraksjoner i CSF. Men hittil har de ofte brukte protein kvantifisering analysene ikke tillater diskriminering mellom de to protein komponentene, selv ved hjelp av høy gjennomstrømming verktøy. Derfor har det blitt foreslått konkrete korrigeringer av protein målinger for å skille mellom proteiner syntetisert i CNS-rommet og proteiner avledet fra blodet. Slike rettelser kompenserer for individuell variasjon i både serumkonsentrasjoner og barriere integritet. Samlet sett er disse korreksjoner basert på beregninger av en CSF/serum-kvotienten (Qprotein), noe som reduserer variasjoner på grunn av forskjeller i den individuelle konsentrasjonen av serum protein. Variasjon av Qprotein knyttet til individuelle forskjeller i barriere funksjonen kan ytterligere senkes ved å knytte QPROTEIN til en CSF/serum albumin kvotienten (Qalbumin). Kombinasjonen av begge rettelser er generelt kjent som protein Index og beregnes som Qprotein/qalbumin ratio4,6.

Albumin, syntetisert og skilles ut av leveren, er den store plasma protein som sirkulerer i blodet. Fordi albumin produseres utelukkende utenfor CNS og dens nivåer i CSF er lav (~ 0,15 g/dL), økt CSF albumin nivåer indikere enten skade på BBI eller blod forurensning på grunn av intratekal blødning eller traumatisk CSF samling. I noen av disse forholdene, albumin transudates fra serum inn i CSF i forhold til sin serumkonsentrasjon. Derfor, i fravær av blod forurensning, kan Qalbumin brukes som en indikator på barrierefunksjon20. Motsatt, Qalbumin forblir konstant innenfor normal områder hos mennesker og dyr med en intakt bbI21. En fundamental forutsetning for å bruke dennekvotienten iintratekal protein syntese beregningen er at den økte mengden av CSFprotein i nær Vær av en lekk barriere er proporsjonal med økningen i CSF albumin konsentrasjon. Denne antakelsen har blitt eksperimentelt bekreftet i en studie fra 19774, der forfatterne OVERVÅKES i MS pasienter Blood-CSF passasje av radiolabeled IgG og albumin Hentet fra friske menneskelige Sera.

I likhet med albumin, kan noe protein i blodet krysse BBI. Når barrieren er intakt, er Q-proteinet relativt konstant. I motsetning til albumin, kan imidlertid mange proteiner også bli syntetisert i CNS. Som en konsekvens kan et endret Q-protein følge av en skadet barriere og/eller økt intratekal protein produksjon. Likevel, når en forhøyet CSF proteinkonsentrasjon skyldes bare en kompromittert BBI, verdier for både Qprotein og qalbumin er økt, sammenlignet med verdier for de samme kvotienter i dyr med en intakt barriere. I kontrast, når barrieren er intakt, økt CSF protein konsentrasjoner er mest sannsynlig på grunn av økt intratekal syntese, og bare Qprotein er slutt økt.

Bruken av protein indeksen kan være delvis begrenset av fem faktorer: 1) den store variasjonen av CSF albumin konsentrasjon hos friske dyr, 2) de ulike hydrodynamisk radius av proteiner, 3) den endogene CNS uttrykk for proteiner, 4) ulike prøvetaking teknikker, og 5) de morfologiske forskjellene i BBI. Den store variasjonen av CSF albumin konsentrasjon hos friske dyr resulterer i betydelig variasjon i verdiene for den endelige protein indeksen. Hos mennesker, for eksempel, Qalbumin er alders avhengig siden det øker med22år. En tidligere rapport også nevnt en sex-basert forskjell i Qalbumin i en sunn befolkning23. Likeledes, i mus albumin konsentrasjoner avhenge alder og mus belastning24, f. eks, Qalbumin for unge, mannlige, C57Bl/6 mus kan være forskjellig fra Qalbumin for gamle, kvinnelige, DBA/1j mus. Derfor kan ikke standardiserte referanse intervaller for barriere integritet etableres på tvers av og innenfor arter, og hensiktsmessige terskler må beregnes basert på de spesifikke eksperimentelle forholdene.

En annen faktor som forårsaker variasjon i normale indekser blant proteiner er deres molekylstørrelse. Passering av serumproteiner gjennom BBI avhenger av deres molekylære størrelse, og sammenhengen mellom clearance rate og molekylær vekt (MW) er mye brukt til å evaluere permeabilitet av BBI. Generelle proteinstrukturer varierer i størrelse fra titalls til flere tusen aminosyrer. Noen proteiner er av relativt liten molekylstørrelse, slik som chemokiner, med en molekylvekt som varierer mellom 8 og 20 kDa. En slik lav MW favoriserer kryssing av BBI, til slutt resulterer i høyere normal protein indekser. Annerledes er andre proteiner, som IgM, svært store (900 − 950 kDa), derfor viser svært lave indekser i normale forhold6. Men dette er ikke alltid tilfelle, siden, til tross for en lignende MW, noen proteiner trenge gjennom barrieren mye bedre enn andre proteiner, muligens på grunn av en annen form. Således, den diffusjon koeffisient av et protein, og dermed hydrodynamisk radier beregnet fra det, avhenger av både størrelse og form av molekyler25. Den fundamentale forskjellen mellom det geometriske og det hydrodynamisk volumet av et protein blir mest tydelig med store proteiner over 150 kDa. De synkende clearance av for eksempel ceruloplasmin (132 kDa), IgG (150 kDa) og IgA (150 kDa) reflekterer de hydrodynamisk heterogenitet til disse tre proteinene, som har tilsvarende MW25. Det er også mulig at det er intratekal produksjon av proteiner under normale omstendigheter. Noen chemokiner, for eksempel CXCL10, produseres vanligvis intratekalt, mens andre, for eksempel CXCL13, ikke er26,27. Dette betyr at tolkning av protein indekser under de fleste eksperimentelle forhold vanligvis krever analyse av alder-, Sex-, og belastning matchet ubehandlede kontroller.

Protein nivåer i væsker kan også bli påvirket av ulike prøvetaking teknikker. Selv om dette ikke kan være et problem for CSF samlingen som beskrevet her-det er ingen forskjeller i CSF prøvetaking mellom de beskrevne overlevelse og ikke-overlevelse prosedyrer-, ulike blod innsamlings metoder kan ha en innvirkning på det totale serum protein beløpet. Noen metoder for blod samling yield arteriell blod, andre gir venøs blod, mens atter andre gir en blanding av både14. Prøven innhentet fra overlevelse retro-orbital blødning er en blanding av venøs blod og vev væske, mens terminalen blod samling fra CARDIAC punktering kan gi venøs eller arteriell blod eller en blanding av begge14. Hos friske dyr, kan den totale protein og albumin innhold av arteriell blod serum være noe høyere enn de samme fraksjoner av venøs blod serum28. Dette bør tas i betraktning når overlevelse og ikke-overlevelse prøver sammenlignes.

Til slutt, en viktig funksjon for å vurdere er den heterogene morfologiske strukturen i BBI, som består av minst to distinkte barrierer, blod-hjerne barriere (BBB) ligger på endotelet av hjernen microårene og Blood-CSF barriere (BCSF) ligger ved epitel av akkord plexuses29. Begge barrierer begrenser og regulerer passering av molekyler og celler mellom perifere og spinal rom, selv om de gjør det ved forskjellige mekanismer. Mens BBB er en reell fysisk barriere, preget av et komplekst samspill mellom cellene, er BCSF mer av en fysiologisk barriere, som for det meste avhenger av CSF Flow. Reduksjoner i CSF produksjon, utgivelse, og strømningshastighet på grunn av nevrologiske tilstander og/eller traumer svekke BCSF funksjon, og dermed øke Qalbumin9,30,31,32. Derfor, Qalbumin fungerer som en bedre markør for BCSF permeabilitet i stedet for BBB eller generelt bbI permeabilitet.

Oppsummert er beregningen av en protein indeks en relativt enkel, og godt karakterisert metode for diskriminering mellom transudat og intratekalt produsert proteiner. Fordelen med å bruke denne formelen for å korrigere den generelle måling av proteiner i CSF prøvene er at det genererer en objektiv variabel for å kvantifisere den intratekal syntesen av proteiner og for å måle BBI, spesielt BCSF, (Dys) funksjon. Gitt robusthet av denne tilnærmingen, korrigering av CSF protein beløp gjennom Qalbumin og protein indeksen gir en Baseline mot å vurdere (1) den patofysiologisk opprinnelsen til eventuelle CSF protein og (2) stabilitet og funksjonell betydning for barriere integritet. Her er det presentert en detaljert protokoll, fra CSF og blod samling til den endelige beregningene korrigere den totale CSF protein beløp, som gjelder for musen modeller for nevrologiske sykdommer. Imidlertid kan den samme protokollen enkelt tilpasses studiet av CSF og intratekal syntese av proteiner i alle dyr, inkludert mennesker. Qalbumin og IgG indeksen er allerede ofte brukt i klinisk praksis for diagnostisering av inflammatoriske nevrologiske sykdommer6. De samme parametrene har også blitt brukt til å evaluere et bredt spekter av cytokiner og chemokiner hos pasienter med inflammatoriske demyeliniserende sykdommer26,33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker personalet på Center for sammenlignende medisin og forskning (CCMR) på Dartmouth for deres eksperthjelp av musene som brukes for disse studiene. Den Bornstein Research Fund finansiert denne forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL insulin syringe BD 329650
1 mL syringe BD 329622
25 gauge needle BD 305122
3 mL syringe BD 309582
30 gauge insulin needle BD 305106
Absorbent pads Any suitable brand
Acepromazine Patterson Vet Supply Inc
BioPlex Handheld Magnetic Washer BioRad 171020100 Magnet
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader BioRad 171015001
BioPlex Pro Flat Bottom Plates BioRad 171025001
Biotinilated detection antibody Any suitable source The antibody has to be directed against the species of the protein of interest.
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A4503
Buprenorphine hydrochloride PAR Pharmaceutical NDC 42023-179-05
Capillary Tubes Sutter Instrument B100-75-10 OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller.
Centrifuge tube, 0.2 mL VWR 20170-012
Centrifuge tube, 0.5 mL VWR 87003-290
Centrifuge tube, 1.5 mL VWR 87003-294
Chlorhexidine diacetate Nolvasan E004272
Disposable pipettes tips Any suitable brand
Ear bars KOPF Instruments 1921 or 1922
Ethanol Kopter V1001
Freezer VWR VWR32086A
Gauze Medline NON25212
Heating pad Sunbeam XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch
Induction Chamber VETEQUIP
Isoflurane Patterson Vet Supply Inc NDC 14043-704-06
Ketamine (KetaVed) Patterson Vet Supply Inc
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) BioRad Antibody-coupled magnetic bead
Microplate Shaker Southwest Scientific SBT1500
Microretractors Carfill Quality ACD-010 Blunt - 1 mm
Microsoft Office (Excel) Microsoft
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel EMD Millipore MGAMMAG-300K Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids.
Mouse Albumin capture ELISA kit Novus Biological NBP2-60484 Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids.
Multichannel pipette Eppendorf 3125000060
Non-Sterile swabs MediChoice WOD1002 Need to be autoclaved for sterility
Oxygen AIRGAS OX USPEA
Pasteur Pippettes Fisher 13-678-20A 5 & 3/4"
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen Patterson Vet 8695G P-3 Reverse Cutting, 18"
PE-Streptavidin BD Biosciences 554061
Pipetters Eppendorf Research seriers
Polyethylene tubing
Refrigerated Centrifuge Beckman Coulter ALLEGRA X-12R
Scale Uline H2716
Scalpel Feather EF7281
Shaver Harvard Apparatus 52-5204
Standard proteins Any suitable source The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest.
Stereotaxic instrument KOPF Instruments Model 900LS Standard Accessories
Sterile 1 x PBS Corning Cellgro 21-040-CV
Sterile saline Baxter 0338-0048-02 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP
Surgical Forceps Curved, 7 (2) Fine Science Tools 11271-30 Dumont
Surgical Scissors Fine Science Tools 14094-11 Stainless 25x
Vaporizer + Flow meter Moduflex Anhestesia Instruments
Vortex Fisher 02-215-414
Warming pad Kent Scientific Corporation RT-JR-20
Water Sonicator Cole Parmer EW-08895-01
Xylazine Patterson Vet Supply Inc

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Whedon, J. M., Glassey, D. Cerebrospinal fluid stasis and its clinical significance. Alternative Therapies in Health and Medicine. 15, (3), 54-60 (2009).
  2. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  3. Barro, C., et al. Fluid biomarker and electrophysiological outcome measures for progressive MS trials. Multiple Sclerosis. 23, (12), 1600-1613 (2017).
  4. Tourtellotte, W. W., et al. Multiple sclerosis: measurement and validation of central nervous system IgG synthesis rate. Neurology. 30, (3), 240-244 (1980).
  5. Bonnan, M. Intrathecal IgG synthesis: a resistant and valuable target for future multiple sclerosis treatments. Multiple Sclerosis International. 2015, 296184 (2015).
  6. Reiber, H. Cerebrospinal fluid--physiology, analysis and interpretation of protein patterns for diagnosis of neurological diseases. Multiple Sclerosis. 4, (3), 99-107 (1998).
  7. DiSano, K. D., Linzey, M. R., Royce, D. B., Pachner, A. R., Gilli, F. Differential neuro-immune patterns in two clinically relevant murine models of multiple sclerosis. Journal of Neuroinflammation. 16, (1), 109 (2019).
  8. Pachner, A. R., Li, L., Lagunoff, D. Plasma cells in the central nervous system in the Theiler's virus model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 232, (1-2), 35-40 (2011).
  9. Reiber, H. Flow rate of cerebrospinal fluid (CSF)--a concept common to normal blood-CSF barrier function and to dysfunction in neurological diseases. Journal of Neurological Sciences. 122, (2), 189-203 (1994).
  10. Reiber, H., Zeman, D., Kusnierova, P., Mundwiler, E., Bernasconi, L. Diagnostic relevance of free light chains in cerebrospinal fluid - The hyperbolic reference range for reliable data interpretation in quotient diagrams. Clinica Chimica Acta. 497, 153-162 (2019).
  11. Reiber, H., Felgenhauer, K. Protein transfer at the blood cerebrospinal fluid barrier and the quantitation of the humoral immune response within the central nervous system. Clinica Chimica Acta. 163, (3), 319-328 (1987).
  12. Dorta-Contreras, A. J. Reibergrams: essential element in cerebrospinal fluid immunological analysis. Revista de Neurologia. 28, (10), 996-998 (1999).
  13. Metzger, F., Mischek, D., Stoffers, F. The Connected Steady State Model and the Interdependence of the CSF Proteome and CSF Flow Characteristics. Frontiers Neuroscience. 11, 241 (2017).
  14. Wolforth, J. Methods of blood collection in the mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  15. Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. Journal of Visualized Experiments. (21), e960 (2008).
  16. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), e2771 (2012).
  17. Johnston, S. A., Tobias, K. M. Veterinary Surgery: Small Animal Expert Consult - E-Book. Elsevier Health Sciences. (2017).
  18. Nigrovic, L. E., Shah, S. S., Neuman, M. I. Correction of cerebrospinal fluid protein for the presence of red blood cells in children with a traumatic lumbar puncture. Journal of Pediatrics. 159, (1), 158-159 (2011).
  19. McCarthy, D. P., Richards, M. H., Miller, S. D. Mouse models of multiple sclerosis: experimental autoimmune encephalomyelitis and Theiler's virus-induced demyelinating disease. Methods in Molecular Biology. 900, 381-401 (2012).
  20. Link, H., Tibbling, G. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. II. Relation of the concentration of the proteins in serum and cerebrospinal fluid. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 391-396 (1977).
  21. Tibbling, G., Link, H., Ohman, S. Principles of albumin and IgG analyses in neurological disorders. I. Establishment of reference values. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation. 37, (5), 385-390 (1977).
  22. Deisenhammer, F., et al. Guidelines on routine cerebrospinal fluid analysis. Report from an EFNS task force. European Journal of Neurology. 13, (9), 913-922 (2006).
  23. Johanson, C. E., Stopa, E. G., McMillan, P. N. The blood-cerebrospinal fluid barrier: structure and functional significance. Methods in Molecular Biology. 686, 101-131 (2011).
  24. Zaias, J., Mineau, M., Cray, C., Yoon, D., Altman, N. H. Reference values for serum proteins of common laboratory rodent strains. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 48, (4), 387-390 (2009).
  25. Felgenhauer, K., Renner, E. Hydrodynamic radii versus molecular weights in clearance studies of urine and cerebrospinal fluid. Annals of Clinical Biochemistry. 14, (2), 100-104 (1977).
  26. Pachner, A. R., DiSano, K., Royce, D. B., Gilli, F. Clinical utility of a molecular signature in inflammatory demyelinating disease. Neurology, Neuroimmunology & Neuroinflammation. 6, (1), 520 (2019).
  27. Pachner, A. R., Li, L., Gilli, F. Chemokine biomarkers in central nervous system tissue and cerebrospinal fluid in the Theiler's virus model mirror those in multiple sclerosis. Cytokine. 76, (2), 577-580 (2015).
  28. Gerbi, C. Protein concentration in the arterial and venous renal blood serum of the rabbit. Archives of Biochemistry and Biophysics. 31, (1), 49-61 (1951).
  29. Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37, (1), 13-25 (2010).
  30. Reiber, H. Proteins in cerebrospinal fluid and blood: barriers, CSF flow rate and source-related dynamics. Restorative Neurology and Neuroscience. 21, (3-4), 79-96 (2003).
  31. Reiber, H. Knowledge-base for interpretation of cerebrospinal fluid data patterns. Essentials in neurology and psychiatry. Arquivos de Neuropsiquiatria. 74, (6), 501-512 (2016).
  32. Kuehne, L. K., Reiber, H., Bechter, K., Hagberg, L., Fuchs, D. Cerebrospinal fluid neopterin is brain-derived and not associated with blood-CSF barrier dysfunction in non-inflammatory affective and schizophrenic spectrum disorders. Journal of Psychiatric Research. 47, (10), 1417-1422 (2013).
  33. Bromader, S., et al. Changes in serum and cerebrospinal fluif cytokines in response to non-neurological surgery: an observational study. Journal of Neuroinflammation. 9, 242 (2012).
  34. Starhof, C., et al. Cerebrospinal fluid pro-inflammatory cytokines differentiate parkinsonian syndromes. Journal of Neuroinflammation. 15, (1), 305 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics