Интеграция подходов к биоинформатике и экспериментальных валидсов для понимания роли сигнализации в раке яичников

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Биоинформатика является полезным способом обработки крупномасштабных наборов данных. Благодаря внедрению подходов к биоинформатике исследователи могут быстро, надежно и эффективно получать проницательные приложения и научные открытия. Эта статья демонстрирует использование биоинформатики в исследованиях рака яичников. Он также успешно проверяет биоинформатики выводы путем экспериментов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Notch сигнализации является весьма сохранимым нормативным путем, участвующих во многих сотовых процессов. Дисрегуляция этого сигнального пути часто приводит к вмешательству в надлежащее развитие и может даже привести к инициации или прогрессированию рака в некоторых случаях. Поскольку этот путь служит сложным и универсальным функциям, его можно изучить с помощью различных подходов. Из них биоинформатика обеспечивает, несомненно, экономичный, доступный и удобный для пользователя метод исследования. Биоинформатика является полезным способом извлечения небольших фрагментов информации из крупномасштабных наборов данных. Благодаря внедрению различных подходов к биоинформатике исследователи могут быстро, надежно и эффективно интерпретировать эти большие наборы данных, принося проницательные приложения и научные открытия. Здесь представлен протокол для интеграции биоинформатики подходов к исследованию роли Notch сигнализации в рак яичников. Кроме того, результаты биоинформатики проверяются на основе экспериментов.

Introduction

Путь сигнализации Notch является очень сохранимым путем, который важен для многих процессов развития в биологических организмах. Было показано, что сигнализация notch играет значительную роль в пролиферации клеток и самообновлении, а дефекты в пути сигнализации Notch могут привести ко многим видам рака1,2,3,4,6. В некоторых случаях, Notch сигнальный путь был связан как с ростом тканей и рака, а также клеточной смерти и подавления опухоли7. Несколько рецепторов Notch (NOTCH 1'4) и co'u2012activator Mastermind (MAML 1'3), все с различными функциями, добавить дополнительный уровень сложности. В то время как путь сигнализации Notch является сложным с точки зрения функций, его основной путь прост на молекулярной основе8. Рецепторы notch действуют как трансмембранные белки, состоящие из внеклеточных и внутриклеточных областей9. Лиганд, связывающийся с внеклеточной областью рецепторов Notch, облегчает протеолитоическое расщепление, что позволяет высвобождению внутриклеточного домена Notch (NICD) в ядро. ЗАТЕМ NICD связывается с co'u2012activator Mastermind, чтобы активировать экспрессию генов вниз по течению10.

В последние годы, Notch сигнализации было показано, играют различные роли в инициации и прогрессирования нескольких видов рака различных видов6,11. Например, Нотч сигнализации была связана с опухолевого гена с участием человека NOTCH1 ген12. В последнее время, NOTCH2, NOTCH3, Дельта-как 3 (DLL3), Mastermind'u2012like белка 1 (MAML1), и дезинтехрин и металлопротеиназы домена no2012содержащий белок 17 (ADAM17) гены были показаны, чтобы быть сильно связаны с раком яичников, особенно с плохой общей выживаемости пациентов13.

По мере постоянного увеличения объема экспериментальных и связанных с пациентами данных возрастает и спрос на анализ имеющихся данных. Имеющиеся данные разбросаны по публикациям, и они могут предоставлять противоречивые или даже противоречивые выводы. С развитием новых технологий в последние десятилетия, таких как секвенирование следующего поколения, объем имеющихся данных вырос в геометрической прогрессии. Хотя это представляет собой быстрый прогресс в области науки и возможности для продолжения биологических исследований, оценка значения общедоступных данных для решения вопросов исследования является большой проблемой14. Мы считаем, что биоинформатика является полезным способом извлечения небольших фрагментов информации из крупномасштабных наборов данных. Благодаря внедрению различных подходов к биоинформатике исследователи могут быстро, надежно и эффективно интерпретировать эти большие наборы данных, принося глубокие открытия. Эти открытия могут варьироваться от выявления потенциальных новых целей лекарственной терапии или биомаркеров болезни, персонализированные лечения пациентов15,16.

Биоинформатика сама по себе быстро развивается, и подходы постоянно меняются по мере того, как технологические достижения размывают медицинскую и биологическую науку. В настоящее время общие подходы биоинформатики включают использование общедоступных баз данных и программных программ для анализа последовательностей ДНК или белка, определения генов, имеющих особую актуальность или важность, и определения актуальности генов и генных продуктов с помощью функциональной геномики16. Хотя область биоинформатики, безусловно, не ограничивается этими подходами, они имеют важное значение в оказании помощи врачам и исследователям управлять биологическими данными в интересах пациентов в целом.

Это исследование направлено на выделение нескольких важных баз данных и их использование для исследований о Нотч сигнального пути. В качестве примеров для исследования базы данных были использованы NOTCH2, NOTCH3, и их co'u2012activator MAML1. Эти гены были использованы, потому что важность Нотч сигнальный путь в рак яичников была проверена. Систематический анализ полученных данных подтвердил важность сигнализации Notch при раке яичников. Кроме того, поскольку Нотч сигнализации хорошо сохраняется между видами, было подтверждено, что переэкспрессия Drosophila melanogaster NICD и Mastermind вместе может вызвать опухоли в дрозофилы яичников, поддерживая выводы базы данных и значительную и сохраненную роль Notch сигнализации в рак яичников.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Прогнозирование клинических результатов из геномных профилей (PRECOG)

ПРИМЕЧАНИЕ: Портал PRECOG (precog.stanford.edu) получает доступ к общедоступным данным из 165 наборов данных экспрессии рака, включая уровни экспрессии генов и клинические исходыпациента 17. В нем, в частности, содержится анализ Мета-у2012 , который включает в себя большие наборы данных, чтобы обеспечить qu2012scores различных генов в 39 типах рака, чтобы показать общую выживаемость пациента. Низкие и хорошие показатели выживаемости указываются положительными и отрицательными значениями за 2012 баллов, соответственно.

  1. Создайте учетную запись с академической аффилированной электронной почты для доступа к этой базе данных. Введите адрес электронной почты и пароль, связанный с учетной записью.
  2. Нажмите на кнопку «Подробности представления», расположенную под заголовком анализа Мета-Я.
  3. Ввиньте ген интереса в панель поиска.
  4. Используйте панель прокрутки, расположенную в нижней части экрана, чтобы получить оценку выживания для конкретного типа рака.

2. CSIOVDB

ПРИМЕЧАНИЕ: CSIOVDB(csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) является микроаррей базы данных, разработанной Институтом рака науки Сингапура для изучения рака яичников18. Эта база данных содержит данные карциномы из различных участков опухоли, а также нормальные данные ткани яичников. Кроме того, CSIOVDB предоставляет планы выживания Kaplan'u2012Meier для оценки выживаемости пациентов с дифференциальными уровнями экспрессии генов. CSIOVDB может быть применен для исследования связи между уровнями экспрессии генов и стадиями рака яичников / классов.

  1. Входной ген, представляющий интерес, затем нажмите кнопку поиска.
  2. Нажмите на вкладку State State.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вкладка предоставляет краткую статистику экспрессии генов целевого гена, интересуемого в состояниях рака яичников.
  3. Нажмите на вкладку "Гистология".
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вкладка предоставляет краткую статистику экспрессии генов целевого гена, интересуюсь основными гистологиями рака яичников.
  4. Нажмите на вкладку Clinico-патологических параметров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вкладка обеспечивает сравнение уровней экспрессии гена между различными стадиями рака яичников, оценками и клиническими реакциями с испытаниями Mann-Whitney.
  5. Нажмите на вкладку «Выживание».
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вкладка предоставляет Каплан-Мейер участков, связанных с общей выживания и без болезней выживания. Для этой базы данных, без болезней выживания считается прогрессирование и рецидив свободной выживания18. Мультивариатные анализы для общего выживания и без болезней выживания также находятся под этой вкладкой. Многовариантные анализы сравнивают особенности, связанные с прогнозами рака яичников (стадия, оценка, хирургическое обезвренку, гистология, возраст) и ген, представляющий интерес.
  6. Нажмите на вкладку Подтипа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта вкладка содержит сводную статистику и тесты Манн-Уитни на уровень экспрессии гена, интересуемого молекулярными подтипами рака яичников. Эта вкладка также предоставляет Каплан-Мейер участков, связанных с общей выживания и без болезней выживания гена, интересуюда в молекулярных подтипов рака яичников.

3. Выражение гена через нормальные и опухолевые ткани (GENT)

ПРИМЕЧАНИЕ: Портал GENT (медицинский no2012genome.kribb.re.kr/GENT) разработан и поддерживается Корейским научно-исследовательским институтом бионауки и биотехнологии (KRIBB)19. Он собирает 16400 (U133A; 241 набор данных) и 24 300 (U133plus2; 306 наборов данных) общедоступных образцов. После стандартизации, GENT предлагает данные экспрессии генов в различных тканях, которые далее делятся на опухоли и нормальные ткани.

  1. Нажмите на вкладку Поиск в верхней части экрана.
  2. В разделе помечено 1. Ключевое слово, выберите символ гена для Условий из меню выпадения, введите генный символ интереса гена в пустой области раздела Ключевого слова, и выберите Ткань для варианта типа.
  3. Нажмите кнопку поиска в нижней части 1. Раздел ключевого слова. Он показывает краткие графики экспрессии генов в нормальных и опухолевых тканях различных типов рака на основе платформ U133A и U122Plus2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно выбирать опцию фильтрации данных в верхней части сводного графика, чтобы выделить конкретную базу данных для изучения.
  4. Нажмите на ссылку рядом с Result Data Download, чтобы получить доступ к подробной информации о значениях экспрессии генов, типах тканей и источниках данных.

4. Широкий институт рака клеточной линии энциклопедии (CCLE)

ПРИМЕЧАНИЕ: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) был создан Институтом Широкого и обеспечивает геномные профили и мутации 947 линий раковых клеток человека20.

  1. Ввиньте нужные гены в панель поиска, а затем нажмите кнопку поиска.
  2. В разделе с пометкой Select Datasetщелкните опцию выражения mRNA (RNAseq) из меню выпадения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие варианты включают выражение мРНК (Affy), Ахиллес shRNA нокдаун, и копировать номер.
  3. Нажмите на кнопку Toggle All Traces. Выберите тип ткани интерес из серой коробке справа. Прокрутите вниз до нижней части экрана и нажмите кнопку выражения Скачать mRNA.
  4. Откройте загруженный текстовый документ. Копировать и вставить весь текст в лист 1. Копируйте весь текст в листе 1.
  5. Нажмите на лист в таблице программного обеспечения Лист 2 вкладке в нижней части таблицы. Нажмите правой кнопкой мыши на столбец А, выберите Paste Special,а затем выберите опцию Transpose в листе 2.
  6. После того, как текст транспонируется в две колонки на листе 2, нажмите на стрелку выпадения для сортировки и фильтра вариант заголовок, а затем выберите вариант фильтра. Стрелка появится в области заголовка помечены Гена. Нажмите на стрелку и введите в ткани типа интереса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет фильтровать все данные и отображать только уровни экспрессии генов для ткани типа интереса.

5. cBioPortal

ПРИМЕЧАНИЕ: cBioPortal (www.cioportal.org) был разработан в Мемориал Слоун Kettering онкологический центр (MSK), и доступ, анализирует и визуализирует крупномасштабных геномных данных рака21,22. В частности, этот портал позволяет исследователям искать генетические изменения и сигнальные сети.

  1. Используя запрос на целевой странице, щелкните органы/ткани, представляющие интерес в разделе помечены Select Studies. Выберите конкретное исследование, представляющие интерес, а затем нажмите кнопку Запрос а геном.
  2. В разделе помечены Выберите геномные профили, выберите из трех вариантов: Мутации, Путивные изменения числа копий от GISTIC, или mRNA Выражение. Далее выберите соответствующие данные из меню выпадения для Select Patient/Case Set.
  3. Введите символ гена-мишени (ы) в поле запроса Enter Genes. Нажмите кнопку Отправка Запроса.
  4. Нажмите на вкладку Сети в верхней части страницы, чтобы получить нужную сеть генов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнальная сеть закодирована цветом. Вводимые гены указываются семенными узлами с толстой границей. Каждый ген представлен красным кругом, а цветовая интенсивность красного круга отражает его частоту мутаций. Гены соединены разноцветными линиями. Коричневые линии означают "В том же компоненте", что указывает на участие в том же биологическом компоненте. Синие линии означают "Реагирует с", что указывает на генные реакции. Зеленые линии означают "Изменение государства", предполагая, что один ген может вызвать изменение состояния другого гена.
  5. Нажмите на вкладку Файл в верхней части изображения, чтобы выбрать Сохранить как изображение (PNG) для загрузки сетевого изображения.

6. Рассечение дрозофилы с желаемыми генотипами и dAPI окрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите самку дрозофилы с желаемыми генотипами, затем вскрыть мухи яичников пройти процедуры DAPI окрашивания для визуализации.

  1. Подготовьте запасы мух tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, wе; UAS-mam.A; и w 1118 для создания мух с NICD-переэкспрессией (tj-Gal4, Gal80ts/ ; UAS-NICD-GFP / )и NICD и mam-overexpression(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; Возможность UAS-NICD-GFP/).
  2. Применить височной и региональной экспрессии генов ориентации (TARGET) метод для контроля пространственно-временной экспрессии генов23. Поднимите мух и до взросления, затем переключите на 29 градусов по Цельсию на 48 ч с дрожжами перед вскрытием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: tj-Gal4 может управлять экспрессией UAS только при более высоких температурах, когда ингибирование Gal80ts сбавито. Добавление дрожжей до вскрытия увеличивает яичники для сбора урожая.
  3. Поместите 3 мл 1x фосфат-буферизированного сосуда (PBS) (137 мм NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4) в тарелке коллекции эмбрионов. Используйте КО2 площадку для обезвражежать мух.
  4. Выберите самку мухи, а затем тщательно захватить нижнюю грудную клетку мухи с помощью пары рассекающих щипцы и погрузить его в раствор 1x PBS в тарелке коллекции эмбрионов. Используйте вторую пару щиптем, чтобы ущипнуть нижнюю часть живота и осторожно вытащить внутренние органы.
  5. Определите и отсоедините пару яичников от тела мухи. Разбейте мышечную оболочку, расположенную на задней части яичников, и разделите овариолы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разделение овариолов и нарушение мышечной оболочки требуется для того, чтобы достичь более высокого качества окрашивания результатов.
  6. Поместите яичники в центрифугу мощностью 1,5 мл, которая содержит 500 л 1x PBS. Трубка должна оставаться на льду до тех пор, пока не будут собраны все яичники.
  7. Удалите 1x PBS и поместите 0,5 мл исправления раствора (4% формальдегида) в трубку. Поместите трубку на nutator в течение 10 минут.
  8. Удалите исправный раствор из трубки и утилизируйте его в подходящем контейнере для отходов. Используйте 1 мл 1x PBT (1x PBS дополнен0.4% Тритон™ X-100) для мытья яичников 3x в течение 15 минут.
  9. Откажитесь от окончательной стирки PBT и добавьте 1 мл PBTG (0,2% бычьей сыворотки альбумина, 5% нормальной козьей сыворотки в 1x PBT), чтобы предотвратить неспецифическую связывание.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть пропущен для DAPI окрашивания, но это важно для окрашивания антител. Детальное окрашивание иммуногистохимии можно найти в Jia et al.24.
  10. Поместите 150 кЛ DAPI (10 мкг/мл) в трубку в течение 10-15 минут nutation. Откажитесь от DAPI и мыть яичники 1x в течение 10 минут с помощью 1 мл 1x PBT. Удалите PBT и мыть 2x в течение 10 минут с помощью 1x PBS.
  11. Удалите избыток PBS до приблизительно 300 ЗЛ PBS остается в трубке с яичниками. Пайпет яичников вверх и вниз несколько раз с помощью 200 л пипетки, для того, чтобы освободить яичные камеры.
  12. Аккуратно вращайте трубку и тщательно удалите как можно больше раствора 1x PBS, не удаляя яичники. Поместите в трубку 120 л монтажного раствора (1 г n-пропил галлата, 5 мл 10X PBS, 40 мл глицерола и 5 мл dH2O).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажный раствор липкий, поэтому трудно передать ровно 120 л монтажного раствора в трубку. Чтобы облегчить эту проблему, наконечник пипетки мощностью 1000 л может быть использован для добавления трех капель монтажного раствора в трубку.
  13. Удалите примерно 0,33 мм с наконечника пипетки мощностью 200 л и используйте недавно вырезанный наконечник пипетки, чтобы поместить монтажное решение на стеклянную горку микроскопа.
  14. Аккуратно поместите стекло крышки на монтажное решение и запечатайте края крышки скольжения с прозрачным лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запечатывание краев крышки стекла необходимо для предотвращения яичные камеры из течет внутри монтажного решения при принятии конфокальных изображений.
  15. Приобретение изображений с помощью конфокального микроскопа с использованием следующих настроек: объективная линза и увеличение 10 раз; числовая диафрагма 0,8; Длина волны эмиссии DAPI 410-513 нм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Используя процедуру, упомянутую в шаге 1 с помощью портала PRECOG, были получены оценки NOTCH2, NOTCH3и MAML1 при раке яичников (1.3, 2.32, 1.62 соответственно). Отрицательные значения qu2012score указывают на плохую общую выживаемость пациентов с высоким уровнем экспрессии трех генов. С помощью условного форматирования программного обеспечения для электронных таблиц значения qu2012score отображаются на цветном графике на рисунке 1.

Для подтверждения полученных результатов была использована база данных CSIOVDB. Используя инструкции в шаге 2, NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 были последовательно введены в области поиска базы данных CSIOVDB, и данные о выживании пациента, расположенные под вкладкой выживания, были извлечены. В дополнение к общим данным выживания, CSIOVDB обеспечивает выживание без болезней. CSIOVDB далее отделяет пациентов, чтобы представить данные о выживаемости на основе No 1 против No 4 (нижний квартиль против верхнего квартиля) уровней экспрессии генов. В соответствии с предыдущими выводами, высокое выражение NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 коррелируют с плохой общей выживаемости и без болезней выживания (Рисунок 2A,B). Между тем, Clinico-патологических параметры вкладка CSIOVDB также обеспечивает сравнение уровней экспрессии генов между различными стадиями рака яичников, классов и клинических реакций с Манн-Уитни испытаний. Результаты показывают, что более высокие уровни экспрессии NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 связаны с поздними стадиями рака яичников(рисунок 2C).

Поскольку NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 имеют решающее значение для общего выживания пациента, уровни экспрессии генов в опухолях яичников и раковых клеток линий были исследованы далее. Данные выражения NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 в нормальных и опухолевых тканей яичников были загружены с платформы U133A с использованием инструкций шага 3 для GENT. Ученые могут обрабатывать загруженные данные в соответствии с их собственной конкретной целью исследования. Здесь мы использовали данные для получения коробок и усов с помощью GraphPad Prism (версия 8). Дальнейшие тесты на перестановку показали, что NOTCH2, NOTCH3и MAML1 высоко выражены в опухолевых тканях(рисунок 3A). Далее, данные выражения NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 в линиях раковых клеток яичников были загружены в соответствии с протоколом шаг 4, с использованием CCLE. Уровни экспрессии генов в линиях раковых клеток показаны участками коробки и усов(рисунок 3B). Несмотря на то, что уровни экспрессии NOTCH2, NOTCH3и MAML1 имеют высокий уровень раковых клеток, выводы нельзя сделать из-за отсутствия нормального контроля линии клеток в базе данных CCLE. Тем не менее, ученые могут определить происхождение раковых клеток линий, и сравнить уровни экспрессии на основе различных классов, этапов и других клиническипатологических параметров.

После того, как значение NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 в рак яичников были подтверждены, cBioPortal был использован для изучения их связанных сигнальной сети. Используя протокол шаг 5, Яичный / Фаллопийтрубка была выбрана для выбора исследований, то яичников серозный cystadenocarcinoma (TCGA, Природа 2011) набор данных был выбран для анализа. Для раздела помечены Выберите геномные профили, выражение мРНК был выбран, и, наконец, его профиль мРНК выражение - оценки (все гены). Для раздела Выберите набор пациентов/случаев, образцы с данными mRNA (Agilent microarray) (489) вариант был выбран из меню выпадения. В конце были выбраны гены NOTCH2, NOTCH3и MAML1 для отправки запроса. На основе трех основных генов была создана сигнальная сеть, чтобы обеспечить 50 наиболее часто изменяемых соседних генов, которые также находятся в том же пути с самыми высокими показателями мутации(рисунок 4).

Потому что Notch сигнализации хорошо сохраняется между видами, он был исследован в Drosophila рака яичников. Notch сигнализации ранее сообщалось регулировать пролиферацию фолликула клеток25, дифференциация26,27, и регулирование клеточного цикла28,29. Переэкспрессия NICD только не вызывают опухоли в Drosophila (Рисунок 5A), как эпителий дрозофилы яичные камеры остались нетронутыми с одним слоем. Тем не менее, переэкспрессия NICD и Mam вместе индуцированных опухолей в Drosophila (Рисунок 5B), который демонстрируется несколькими эпителиальными слоями и накопленных клеток.

Figure 1
Рисунок 1: Выражение NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 в рак яичников связано с плохой общей выживаемости. Представлены показатели выживания no-scores NOTCH2, NOTCH3и MAML1 у больных раком яичников. Плохая выживаемость указывается на отрицательные значения qu2012score. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Высокие уровни NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 в рак яичников связаны с плохой общей выживаемости, плохой без болезней выживания, и поздних стадиях рака. База данных microarray CSIOVDB обеспечивает Каплан-Мейер общей выживаемости и без болезней выживаемости участков NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 у больных раком яичников, и уровни экспрессии генов в различных стадиях рака. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 высоко выражены в опухолях яичников и раковых клеток линий. Значения P показаны для того чтобы сравнить выражение гена в нормальных яичниках и соответствуя туморах яичников. (Аббревиативы: Яичники-N - нормальные ткани яичников; Ткани рака яичников- C ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: NOTCH2/NOTCH3/ MAML1 гены и связанная с ними сигнальная сеть с 50 наиболее часто изменяемыми соседними генами. Сигнальная сеть кодируется по цвету. Вводимые гены указываются семенными узлами с толстой границей. Каждый ген представлен красным кругом, а цветовая интенсивность красного круга отражает его частоту мутаций. Гены соединены разноцветными линиями. Коричневые линии означают "В том же компоненте", что указывает на участие в том же биологическом компоненте. Синие линии означают "Реагирует с", что указывает на генные реакции. Зеленые линии означают "Изменение государства", предполагая, что один ген может вызвать изменение состояния другого гена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: NICD и маму в Drosophila также вызывают опухоли яичников. A. Переэкспрессия NICD сама по себе не вызывает образование опухоли у Дрозофилы. B. Переэкспрессия NICD и мам вместе вызывают опухоли у Дрозофилы. Шкала бар 50 мкм Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Поскольку существует бесчисленное множество подходов и методов использования биоинформатики, существует множество баз данных, доступных в Интернете для широкой общественности. Из каждой из этих баз данных можно извлечь обилие информации, но некоторые из них лучше всего подходят для конкретных целей, таких как оценка выживаемости пациентов на основе определенных входных данных. Систематический анализ полученных данных из различных отдельных баз данных может убедительно дать важные научные выводы.

Текущий анализ фокусируется на роли Ноч сигнализации в рак яичников через использование биоинформатики подходов. Например, анализ Мета-Я в базе данных портала PRECOG был использован для получения з-оценки, указывающие на исходы выживаемости пациентов в клинических исследованиях рака. CSIOVDB является еще одной мета-анализ базы данных, которая была использована для изучения выживаемости пациентов с раком яичников. Данные CSIOVDB успешно подтвердили выводы портала PRECOG, которые, по данным NOTCH2, NOTCH3и MAML1, имеют решающее значение для общего выживания пациентов. Позже, приложения баз данных GENT и CCLE также показали, что NOTCH2, NOTCH3, и MAML1 высоко выражены в опухолях яичников и раковых клеток. Сочетание этих баз данных систематически выявило значительную роль NOTCH2, NOTCH3и MAML1 в раке яичников. Такое использование методов биоинформатики обеспечило эффективный способ проведения исследований рака экономически эффективно и показывает, как он может дать важные выводы для будущих экспериментальных и клинических приложений.

Биоинформатика предоставляет общественности возможность получить доступ к результатам тысяч экспериментов одновременно. Информация, полученная из общедоступных баз данных, обеспечивает экономически эффективный и эффективный способ разработки экспериментального проекта до проведения экспериментов. Кроме того, важно отметить, что общедоступные данные могут быть разбросаны по публикациям и могут предоставлять противоречивые или даже противоречивые выводы, что требует проведения мета-анализа с помощью подходов к биоинформатике. Ученые могут разрабатывать и проводить эксперименты на основе данных, найденных с помощью крупных баз данных биоинформатики для проверки конкретных научных гипотез. Результаты эксперимента Drosophila подтвердили результаты из биоинформатики баз данных и далее поддержали идею о том, что Notch пути компоненты должны продолжать исследоваться в качестве потенциальных терапевтических целей наркотиков. Успешная проверка результатов биоинформатики с помощью экспериментов также свидетельствует о важности подходов к биоинформатике для научных открытий.

Там могут быть некоторые ограничения биоинформатики. Во-первых, некоторые веб-сайты/инструменты могут не обновлять свои выводы из-за временных усилий или затрат, связанных с обслуживанием. Во-вторых, некоторые веб-сайты/инструменты постоянно обновляются, но обновление с дополнительным итогом может изменить ранее полученные результаты. В-третьих, разработчики некоторых веб-сайтов/инструментов оставляют авторские права и ограничивают использование их содержимого. В-четвертых, анализы или алгоритмы определенных веб-сайтов/инструментов не всегда могут быть точными.

Для преодоления этих ограничений предлагаются некоторые шаги или изменения и устранение неполадок для лучшего будущих приложений. Во-первых, некоторые веб-сайты/инструменты позволяют исследователям вручную загружать новые данные для анализа. В противном случае исследователи могут самостоятельно загружать и анализировать самые последние данные. Во-вторых, исследователям необходимо неоднократно проводить анализы и вести учет дат. Если результаты существенно изменятся, исследователям, возможно, придется использовать дополнительный вход данных, чтобы выяснить причины. В-третьих, исследователи могут найти альтернативный веб-сайт/инструмент для проведения анализа, чтобы избежать потенциальных проблем с авторским правом. В-четвертых, исследователи могут получить дополнительные веб-сайты / инструменты для проверки своих важных выводов. При наличии каких-либо проблем с анализом или алгоритмами, исследователи могут загрузить и повторно проанализировать данные, чтобы исправить ошибки или использовать другие веб-сайты / инструменты с соответствующими настройками.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Start-Up Финансирование, Колледж науки и математики исследований Грант, Летняя исследовательская сессия премии, а также исследования семян Финансирование премии от Университета Джорджии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. (2019).
  2. Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21, (7), 702-712 (2019).
  3. Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43, (1), 70-76 (2019).
  4. Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
  5. Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
  6. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  7. Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 722-735 (2016).
  8. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138, (17), 3593-3612 (2011).
  9. Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5, (2), 207-216 (2000).
  10. Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7761-7774 (2001).
  11. Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9, (5), 837-854 (2019).
  12. Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1, (5), 466-476 (2002).
  13. Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17, (6), 4914-4920 (2019).
  14. Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
  15. Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2, (9), 470-489 (2013).
  16. Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324, (7344), 1018-1022 (2002).
  17. Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21, (8), 938-945 (2015).
  18. Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6, (41), 43843-43852 (2015).
  19. Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
  20. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  21. Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6, (269), (2013).
  22. Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2, (5), 401-404 (2012).
  23. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004, (220), 6 (2004).
  24. Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
  25. Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132, (2), (2019).
  26. Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209, (5), 301-311 (1999).
  27. Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, (19), 4299-4308 (2005).
  28. Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
  29. Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131, (13), 3169-3181 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics