Integratie van bioinformatica benaderingen en experimentele validaties om de rol van Inkeping signalering in ovariële kanker te begrijpen

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bioinformatica is een handige manier om grootschalige gegevenssets te verwerken. Door de implementatie van bio-informatica benaderingen kunnen onderzoekers snel, betrouwbaar en efficiënt inzichtelijke toepassingen en wetenschappelijke ontdekkingen verkrijgen. Dit artikel toont het gebruik van bio-informatica in ovariële kankeronderzoek. Het valideert ook met succes bioinformatica bevindingen door middel van experimenten.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Inkeping signalering is een zeer bewaard regelgevings traject betrokken bij vele cellulaire processen. Disregulatie van deze signalering traject leidt vaak tot interferentie met de juiste ontwikkeling en kan zelfs resulteren in initiatie of progressie van kankers in bepaalde gevallen. Omdat dit traject complexe en veelzijdige functies bedient, kan het uitgebreid worden bestudeerd via vele verschillende benaderingen. Hiervan biedt bio-informatica een onmiskenbaar kostenefficiënte, benaderbare en gebruiksvriendelijke studiemethode. Bioinformatica is een handige manier om kleinere stukjes informatie uit grootschalige datasets te extraheren. Door de implementatie van verschillende bioinformatica benaderingen kunnen onderzoekers deze grote datasets snel, betrouwbaar en efficiënt interpreteren, wat inzichtelijke toepassingen en wetenschappelijke ontdekkingen oplevert. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de integratie van bioinformatica benaderingen om de rol van Inkeping signalering in eierstokkanker te onderzoeken. Bovendien worden de bevindingen van bioinformatica gevalideerd door middel van experimenten.

Introduction

De inkeping signalering traject is een zeer goed bewaard traject dat is belangrijk voor vele ontwikkelingsprocessen binnen biologische organismen. Inkeping signalering is gebleken om een belangrijke rol in de celproliferatie en zelf vernieuwing te spelen, en gebreken in de inkeping signalering traject kan leiden tot vele vormen van kanker1,2,3,4,5,6. In sommige omstandigheden, de inkeping signalering traject is gekoppeld aan zowel weefsel groei en Cancer, alsmede celdood en onderdrukking van de tumor7. Meerdere notch receptoren (NOTCH 1 − 4) en co\u2012activator Mastermind (MAML 1 − 3), allemaal met diverse functies, voegen een extra niveau van complexiteit. Terwijl de inkeping signalering traject is verfijnd in termen van functies, de kern traject is eenvoudig op moleculair basis8. Notch receptoren fungeren als transmembraan eiwitten samengesteld uit extracellulaire en intracellulaire gebieden9. Een ligand binding aan de extracellulaire regio van notch receptoren vergemakkelijkt Proteolytische decolleté, waardoor de inkeping intracellulaire domein (NICD) worden vrijgegeven in de Nucleus. NICD bindt vervolgens aan co\u2012activator Mastermind om downstream genexpressie10te activeren.

In de afgelopen jaren, notch signalering is aangetoond dat het spelen van een verscheidenheid van rollen in de inleiding en de progressie van verschillende soorten kankers over verschillende soorten6,11. Bijvoorbeeld, Inkeping signalering is gekoppeld aan tumorigenese met betrekking tot de menselijke NOTCH1 gen12. Onlangs bleken de NOTCH2, NOTCH3, Delta-achtige 3 (DLL3), Mastermind\u2012like proteïne 1 (MAML1)en een desinin-en Metalloproteinase domain\u2012containing eiwit 17 (ADAM17) -genen sterk geassocieerd te zijn met eierstokkanker, vooral met de slechte totale overleving van patiënten13.

Naarmate de hoeveelheid experimentele en patiënt-geassocieerde gegevens voortdurend toeneemt, neemt de vraag naar analyse van de beschikbare gegevens ook toe. De beschikbare gegevens zijn verspreid over publicaties en ze kunnen inconsistente of zelfs tegenstrijdige bevindingen opleveren. Met de ontwikkeling van nieuwe technologie in de afgelopen decennia, zoals de volgende generatie sequencing, is de hoeveelheid beschikbare gegevens exponentieel gegroeid. Hoewel dit een snelle vooruitgang in de wetenschap en de mogelijkheden voor voortgezet biologisch onderzoek vertegenwoordigt, is het een grote uitdaging14om de betekenis van openbaar beschikbare gegevens te beoordelen om onderzoeksvragen op te lossen. Wij geloven dat bioinformatica een handige manier is om kleinere stukjes informatie uit grootschalige datasets te extraheren. Door de implementatie van verschillende bioinformatica benaderingen kunnen onderzoekers deze grote datasets snel, betrouwbaar en efficiënt interpreteren, wat inzichtelijke ontdekkingen oplevert. Deze ontdekkingen kunnen variëren van de identificatie van potentiële nieuwe geneesmiddelen therapie doelen of ziekte biomarkers, tot gepersonaliseerde patiënt behandelingen15,16.

Bioinformatica zelf evolueert snel, en benaderingen veranderen voortdurend naarmate de technologische vooruitgang de medische en biologische wetenschap doet wegvegen. Op dit moment omvatten gemeenschappelijke bioinformatica benaderingen het gebruik van openbaar toegankelijke databases en software Programma's om DNA-of eiwit sequenties te analyseren, genen van bijzondere relevantie of belang te identificeren en de relevantie van genen en genproducten te bepalen via functionele genomics16. Hoewel het gebied van de bio-informatica zeker niet beperkt is tot deze benaderingen, zijn deze belangrijk om clinici en onderzoekers te helpen bij het beheer van biologische gegevens ten voordele van patiënten als geheel.

Deze studie is bedoeld om verschillende belangrijke databases en hun gebruik voor onderzoek over de inkeping signalering traject te markeren. NOTCH2, NOTCH3, en hun co\u2012activator MAML1 werden gebruikt als voorbeelden voor de database studie. Deze genen werden gebruikt omdat het belang van de inkeping signalering traject in ovariële kanker is gevalideerd. Systematische analyse van opgehaalde gegevens bevestigde het belang van Inkeping signalering in eierstokkanker. Bovendien, omdat inkeping signalering is goed bewaard tussen verschillende soorten, er werd bevestigd dat overexpressie van Drosophila melanogaster NiCd en Mastermind samen kunnen induceren tumoren in Drosophila eierstokken, ondersteuning van de bevindingen van de database en de belangrijke en behouden rol van Inkeping signalering in ovariële kanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorspelling van klinische uitkomsten van genomische profielen (PRECOG)

Opmerking: het PRECOG-portaal (precog.stanford.edu) heeft toegang tot openbaar beschikbare gegevens van 165 kanker Expression datasets, inclusief genexpressie niveaus en klinische resultaten van patiënten17. Het biedt specifiek de Meta\u2012Z-analyse, die grote gegevenssets bevat om Z\u2012scores van verschillende genen in 39-kanker typen te bieden om de totale overleving van de patiënt aan te geven. Slechte en goede overlevingspercentages worden aangegeven door respectievelijk positieve en negatieve Z\u2012score waarden.

  1. Maak een account aan met een academische gelieerde e-mail om toegang te krijgen tot deze database. Voer het e-mailadres en wachtwoord in dat aan het account is gekoppeld.
  2. Klik op de knop Details weergeven onder de kop META-Z-analyse .
  3. Voer het gen van belang in de Zoek balk.
  4. Gebruik de schuifbalk aan de onderkant van het scherm om de Survival Z-score te verkrijgen voor het specifieke type kanker.

2. CSIOVDB

Opmerking: CSIOVDB (csibio.NUS.edu.SG/CSIOVDB/CSIOVDB.html) is een microarray-database die is ontwikkeld door het Cancer Science Institute of Singapore om ovariële kanker18te bestuderen. Deze database bevat gegevens van carcinomen van verschillende tumor sites, evenals normale ovariumweefsel gegevens. Daarnaast biedt CSIOVDB Kaplan\u2012Meier overlevings punten om de overleving van patiënten te beoordelen met differentiële genexpressie niveaus. CSIOVDB kan worden toegepast om de associatie te onderzoeken tussen genexpressie niveaus en ovariële kanker stadia/graden.

  1. Input gen van belang, klik dan op de Zoek knop.
  2. Klik op het tabblad ziektestatus .
    Opmerking: dit tabblad biedt samenvattings statistieken van genexpressie van het doel gen van belang in ovariële kanker ziektetoestanden.
  3. Klik op het tabblad histologie .
    Opmerking: dit tabblad biedt samenvattings statistieken van genexpressie van het doel gen van belang in belangrijke ovariële kanker histologieën.
  4. Klik op het tabblad Clinico-pathologische parameters .
    Opmerking: dit tabblad biedt een vergelijking van de genexpressie niveaus tussen verschillende ovariële kanker stadia, rangen en klinische reacties met Mann-Whitney-tests.
  5. Klik op het tabblad Survival .
    Opmerking: dit tabblad biedt Kaplan-Meier-plots die zijn gekoppeld aan algehele overleving en ziektevrije overleving. Voor deze database, ziektevrije overleving wordt beschouwd als progressie-en herhaling-vrije overleving18. Multivariate analyses voor totale overleving en ziektevrije overleving zijn ook te vinden onder dit tabblad. De multivariate analyses vergelijken functies die betrekking hebben op ovariële kanker prognoses (stadium, graad, chirurgische deballast stoffen, histologie, leeftijd) en het gen van belang.
  6. Klik op het tabblad subtype .
    Opmerking: dit tabblad biedt samenvattings statistieken en Mann-Whitney-tests voor het uitdrukkings niveau van het gen van belang in moleculaire subtypen van eierstokkanker. Dit tabblad biedt ook Kaplan-Meier-plots in verband met de algehele overleving en ziektevrije overleving van het gen van belang in moleculaire subtypen van ovariële kanker.

3. genexpressie in normaal en tumor weefsel (GENT)

NB: de GENT Portal (Medical \ u2012genome. kribb. re. kr/GENT) wordt ontwikkeld en onderhouden door het Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB)19. Het verzamelt 16.400 (U133A; 241 gegevenssets) en 24.300 (U133plus2; 306 gegevenssets) openbaar beschikbare voorbeelden. Na standaardisatie biedt GENT genexpressie gegevens over diverse weefsels, die verder worden onderverdeeld in tumor-en normale weefsels.

  1. Klik op het tabblad zoeken boven aan het scherm.
  2. In de sectie 1. Trefwoord, selecteer het gensymbool voor de termen uit het vervolgkeuzemenu, voer het gensymbool van het gen van belang in het lege gebied van het trefwoord sectie en selecteer weefsel voor de type optie.
  3. Klik op de knop zoeken aan de onderkant van de 1. Trefwoord sectie. Het toont de samenvatting grafieken van genexpressie in normale en tumorweefsels van verschillende kankersoorten op basis van de U133A en U122Plus2 platforms.
    Notes: het is optioneel om de optie gegevens filtering bovenaan de overzichtsgrafiek te selecteren om een bepaalde database te bekijken om te bestuderen.
  4. Klik op de link naast het downloaden van resultaatgegevens om toegang te krijgen tot de gedetailleerde informatie over de genexpressie waarden, weefsel typen en gegevensbronnen.

4. breed Instituut Cancer Cell line encyclopedie (CCLE)

Opmerking: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) is gemaakt door het Broad Institute en biedt genomische profielen en mutaties van 947 humane kankercellijnen20.

  1. Voer de gewenste genen in de zoekbalk in en klik vervolgens op de knop zoeken .
  2. In de sectie met de naam gegevensset selecteren, klikt u op de optie mRNA expressie (rnaseq) in het vervolgkeuzemenu.
    Opmerking: andere opties zijn mRNA expressie (Affy), Achilles shRNA knockdownen Copy Number.
  3. Klik op de knop alle sporen omschakelen . Selecteer het weefseltype van de interesse in het grijze vak aan de rechterkant. Scrol omlaag naar de onderkant van het scherm en klik op de knop mRNA-expressie downloaden .
  4. Open het gedownloade tekstdocument. Kopieer en plak alle tekst in Sheet 1. Kopieer alle tekst in het blad 1.
  5. Klik op het blad in het tabblad spreadsheet software Sheet 2 onder in het werkblad. Klik met de rechtermuisknop op de A kolom, selecteer Plakken speciaalen selecteer vervolgens de Transponeer optie in Sheet 2.
  6. Zodra de tekst is omgezet in twee kolommen op blad 2, klikt u op de vervolgkeuzepijl voor de Sorteer & filter optie kop en selecteer vervolgens de filter optie. Er verschijnt een pijl in het kopgebied met het label Gene. Klik op de pijl en typ het weefseltype van de interesse.
    Notes: deze stap filtert alle gegevens en geeft alleen genuitdrukkings niveaus weer voor het weefseltype van belang.

5. Cbioportaal

Opmerking: cbioportal (www.cioportal.org) werd ontwikkeld op het Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSK), en toegangen, analyseert, en visualiseert grootschalige kanker genomische data21,22. Specifiek, dit portaal stelt onderzoekers in staat om te zoeken naar genetische veranderingen en signalering netwerken.

  1. Met behulp van de query op de bestemmingspagina, klikt u op de organen/weefsels van belang onder de sectie met het label Selecteer studies. Selecteer de specifieke studie van belang, dan druk op de query door gen knop.
  2. In de sectie met de naam selecteren genomic profielen, selecteer uit de drie opties: mutaties, putatieve kopie-nummer wijzigingen van Gistic, of mRNA expressie. Selecteer verder corresponderende gegevens uit het dropdown menu voor Selecteer patiënt/Case set.
  3. Voer de doel-gen-symbool (en) in het queryvak van Voer genenin. Klik op de knop query verzenden .
  4. Klik op het tabblad netwerk bovenaan de pagina om het gewenste gennetwerk op te halen.
    Opmerking: het signalerings netwerk is kleurgecodeerd. De ingevoerde genen worden aangegeven door zaad knopen met een dikke rand. Elk gen wordt vertegenwoordigd door een rode cirkel en de kleurintensiteit van de rode cirkel weerspiegelt de mutatiefrequentie. Genen zijn verbonden door verschillend gekleurde lijnen. Bruine lijnen betekenen "in zelfde component", wat de betrokkenheid bij dezelfde biologische component aangeeft. Blauwe lijnen betekenen "reageert met", wat duidt op genreacties. Groene lijnen betekenen "statusverandering", wat suggereert dat een gen een toestand verandering van een ander gen kan veroorzaken.
  5. Klik op het tabblad bestand boven aan de afbeelding om Opslaan als afbeelding (PNG) te kiezen voor het downloaden van netwerk afbeeldingen.

6. dissectie van Drosophila met gewenste genotypen en DAPI-kleuring

Opmerking: Verzamel de vrouwelijke Drosophila met de gewenste genotypes en ontleden de Fly eierstokken om de procedures van DAPI-kleuring voorbeeld vorming te ondergaan.

  1. Vlieg aandelen voorbereiden TJ-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; UAS-mam. A; en w [1118] om vliegen te creëren met NiCd-overexpressie (TJ-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) en NiCd en mam-overexpressie (TJ-Gal4, Gal80ts/UAS-mam. A; UAS-NICD-GFP/+) vermogen.
  2. Pas de temporele en regionale genexpressie targeting (doel) techniek toe om spatiotemporele genexpressie23te beheersen. Til vliegen op 18 ° c tot volwassenheid, dan verschuiving naar 29 ° c voor 48 h met gist voor dissectie.
    Opmerking: TJ-Gal4 kan alleen UAS -expressie onder hogere temperaturen aandrijven, wanneer de remming door Gal80ts is verlicht. De toevoeging van gist voorafgaand aan dissectie vergroot de eierstokken voor het oogsten.
  3. Plaats 3 mL 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4) in een embryo schaaltje. Gebruik een CO2 -pad om de vliegen te anesthetiseren.
  4. Kies een vrouwelijke vlieg, pak vervolgens voorzichtig de onderste thorax van de vlieg met behulp van een paar ontleden Tang en dompel het in de 1x PBS-oplossing in een embryo-collectie schotel. Gebruik een tweede paar pincet om de onderbuik te knijpen en zachtjes te trekken om de inwendige organen vrij te geven.
  5. Identificeer en ontkoppel het paar eierstokken van het vlieg lichaam. Breek de gespierde schede aan het achterste uiteinde van de eierstokken en scheid de ovariolen.
    Opmerking: het scheiden van de ovariolen en het breken van de spier schede is vereist om betere kleuringsresultaten te bereiken.
  6. Plaats de eierstokken in een centrifugebuis van 1,5 mL die 500 μL 1x PBS bevat. De buis moet op ijs blijven totdat alle eierstokken worden verzameld.
  7. Verwijder de 1x PBS en plaats 0,5 mL oplossing (4% formaldehyde) in de buis. Plaats de tube gedurende 10 minuten op de nutator.
  8. Verwijder de Fix-oplossing uit de tube en gooi deze weg in een geschikte afvalbak. Gebruik 1 mL 1x PBT (1x PBS aangevuld met 0,4% Triton™ X-100) om de eierstokken 3x gedurende 15 minuten te wassen.
  9. Gooi de laatste PBT-spoeling weg en voeg 1 mL PBTG (0,2% runderserum albumine, 5% normaal geiten serum in 1x PBT) toe om niet-specifieke binding te voorkomen.
    Opmerking: deze stap kan worden overgeslagen voor DAPI-kleuring, maar is essentieel voor het vlekken op antilichamen. Gedetailleerde immunohistochemie-kleuring kan worden gevonden in Jia et al.24.
  10. Plaats 150 μL DAPI (10 μg/mL) in de buis gedurende 10 − 15 minuten nutation. Gooi de DAPI weg en was de eierstokken 1x gedurende 10 minuten met 1 mL 1x PBT. Verwijder de PBT en was 2x gedurende 10 minuten met 1x PBS.
  11. Verwijder overtollige PBS totdat ongeveer 300 μL PBS in de buis met de eierstokken blijft. Pipetteer de eierstokken meerdere malen omhoog en omlaag met een pipet van 200 μL om de Eier kamers vrij te maken.
  12. Draai de buis voorzichtig om en verwijder voorzichtig zo veel mogelijk 1x PBS-oplossing zonder de eierstokken te verwijderen. Plaats 120 μL montage oplossing (1 g n-Propylgallaat, 5 ml 10X PBS, 40 ml glycerol en 5 ml dH2O) in de buis.
    Opmerking: montage oplossing is plakkerig, dus het is moeilijk om exact 120 μL montage oplossing in een buis over te brengen. Om dit probleem te verhelpen, kan een pipetpunt van 1.000 μL worden gebruikt om drie druppels montage oplossing in de buis toe te voegen.
  13. Verwijder ongeveer 0,33 mm van een pipetpunt van 200 μL en gebruik de nieuw uitgesneden pipetpunt om de montage oplossing op een glasplaat met Microscoop te plaatsen.
  14. Plaats het afdekglas voorzichtig op de montage oplossing en sluit de randen van de Afdekstrook af met transparante nagellak.
    Opmerking: het afdichten van de randen van het afdekglas is nodig om te voorkomen dat de Eier kamers aan de binnenkant van de montage oplossing vloeien bij het nemen van confocale beelden.
  15. Verkrijg beelden met een confocale Microscoop met behulp van de volgende instellingen: objectief objectief = 10x vergroting; numeriek diafragma = 0,8; DAPI-emissie golflengte = 410 − 513 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met behulp van de in stap 1 genoemde procedure met behulp van het PRECOG-portaal werden de Z-scores van NOTCH2, NOTCH3en MAML1 bij eierstokkanker verkregen (respectievelijk 1,3, 2,32, 1,62). De negatieve Z\u2012score waarden duiden op de slechte totale overleving van patiënten met hoge uitdrukkings niveaus van de drie genen. Met voorwaardelijke opmaak van de spreadsheet software worden de Z\u2012score waarden weergegeven in een gekleurd staafdiagram in Figuur 1.

De CSIOVDB database werd gebruikt om de bevindingen te bevestigen. Met behulp van de instructies in stap 2, NOTCH2, NOTCH3en MAML1 werden opeenvolgend ingevoerd in de csiovdb database zoekgebied, en de patiënt Survival gegevens die zich onder de Survival tab werd opgehaald. Naast de totale overlevings gegevens biedt CSIOVDB ziektevrije overleving. CSIOVDB scheidt patiënten verder om de overlevings gegevens te presenteren op basis van Q1 vs. Q4 (onderste kwartiel vs. bovenste kwartiel) van genexpressie niveaus. In overeenstemming met eerdere bevindingen correleren hoge expressie van NOTCH2, NOTCH3en MAML1 met een slechte totale overleving en ziektevrije overleving (Figuur 2A, B). Ondertussen biedt het tabblad Clinico-pathologische parameters van CSIOVDB ook een vergelijking van de genexpressie niveaus tussen verschillende ovariële kanker stadia, rangen en klinische reacties met Mann-Whitney-tests. De resultaten tonen aan dat hogere uitdrukkings niveaus van NOTCH2, NOTCH3en MAML1 gepaard gaan met geavanceerde ovariële kanker stadia (Figuur 2C).

Omdat NOTCH2, NOTCH3en MAML1 essentieel zijn voor de totale overleving van de patiënt, werden de genexpressie niveaus in ovariële tumoren en kankercellijnen verder onderzocht. De expressie gegevens van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 in normale en tumor OVARIËLE weefsels werden gedownload van het U133A platform met behulp van de stap 3 instructies voor Gent. Wetenschappers kunnen de gedownloade gegevens verwerken op basis van hun eigen specifieke onderzoeksdoel. Hier gebruikten we de gegevens om de doos en whisker plots te produceren met behulp van GraphPad Prism (versie 8). Verdere permutatie tests suggereerden dat NOTCH2, NOTCH3en MAML1 sterk worden uitgedrukt in tumorweefsels (Figuur 3A). Volgende, de expressie gegevens van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 in ovariële kanker cellijnen werden gedownload volgens protocol stap 4, met behulp van ccle. Genexpressie niveaus in cellijnen van kanker worden getoond door de doos en de whisker plots (Figuur 3B). Hoewel de uitdrukkings niveaus van NOTCH2, NOTCH3en MAML1 hoog zijn in cellijnen van kanker, kunnen er geen conclusies worden getrokken vanwege het ontbreken van normale besturingselementen van de cellijn in de ccle-database. Wetenschappers kunnen echter de oorsprong van kankercellijnen identificeren en de uitdrukkings niveaus vergelijken op basis van verschillende rangen, stadia en andere clinicopathologische parameters.

Zodra de betekenis van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 in ovariële kanker werden bevestigd, het cbioportal werd gebruikt om hun bijbehorende signaal netwerk te bestuderen. Met behulp van protocol stap 5, Ovary/Fallopian buis werd geselecteerd voor bepaalde studies, vervolgens de ovariële sereuze CYSTADENOCARCINOOM (tcga, natuur 2011) gegevensset werd gekozen voor analyse. Voor de sectie met het label Selecteer genomische profielen, de mRNA-uitdrukking werd geselecteerd, en ten slotte het profiel mRNA expressie Z-scores (alle genen). Voor de sectie Selecteer patiënt/Case set, de monsters met mRNA gegevens (Agilent Microarray) (489) optie werd gekozen uit het dropdown menu. Aan het einde werden genen NOTCH2, NOTCH3en MAML1 geselecteerd om de query in te dienen. Op basis van de drie kern genen werd een signalerings netwerk gecreëerd om de 50 meest veranderde naburige genen te bieden, die zich ook in hetzelfde traject bevinden met de hoogste mutatie percentages (Figuur 4).

Omdat inkeping signalering is goed bewaard tussen verschillende soorten, het werd onderzocht in Drosophila ovariële kanker. Inkeping signalering is eerder gemeld voor het reguleren van follikel celproliferatie25, differentiatie26,27, en celcyclus voorschrift28,29. Overexpressie van NICD alleen induceerde geen tumoren in Drosophila (Figuur 5A), omdat het epitheel van de Drosophila Eier kamers intact bleef met één enkele laag. Echter, overexpressie van NICD en mam samen geïnduceerde tumoren in Drosophila (Figuur 5B), die wordt aangetoond door meerdere epitheliale lagen en geaccumuleerde cellen.

Figure 1
Figuur 1: expressie van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 bij eierstokkanker wordt geassocieerd met een slechte totale overleving. De overleving Z-scores van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 bij ovariële kankerpatiënten worden gepresenteerd. Slechte overleving wordt aangegeven door negatieve Z\u2012score waarden. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: hoge niveaus van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 bij eierstokkanker worden geassocieerd met een slechte totale overleving, slechte ziektevrije overleving en gevorderde kanker stadia. De microarray database CSIOVDB biedt Kaplan-Meier overall overleving en ziektevrije overleving plots van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 bij ovariële kankerpatiënten, en genexpressie niveaus in verschillende stadia van kanker. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 worden sterk uitgedrukt in ovariële tumoren en cellijnen van kanker. P-waarden zijn geïndiceerd om genexpressie in normale eierstokken en corresponderende ovariële tumoren te vergelijken. (Afkortingen: ovarium-N = normale ovarium weefsels; Ovarium-C = eierstokkanker weefsels). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 genen en hun geassocieerde signalerings netwerk met de 50 meest veranderde naburige genen. Het signalerings netwerk is kleurgecodeerd. De ingevoerde genen worden aangegeven door zaad knopen met een dikke rand. Elk gen wordt vertegenwoordigd door een rode cirkel en de kleurintensiteit van de rode cirkel weerspiegelt de mutatiefrequentie. Genen zijn verbonden door verschillend gekleurde lijnen. Bruine lijnen betekenen "in zelfde component", wat de betrokkenheid bij dezelfde biologische component aangeeft. Blauwe lijnen betekenen "reageert met", wat duidt op genreacties. Groene lijnen betekenen "statusverandering", wat suggereert dat een gen een toestand verandering van een ander gen kan veroorzaken. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: NiCd en mam in Drosophila induceren ook ovariële tumoren. A. overexpressie van NiCd alleen induceert geen tumorvorming in Drosophila. B. overexpressie van NiCd en mam samen induceren tumoren in Drosophila. Schaalbalk = 50 μm Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aangezien er talloze benaderingen en methoden zijn voor het gebruik van bio-informatica, zijn er tal van databases online beschikbaar voor het grote publiek. Een overvloed aan informatie kan worden geëxtraheerd uit elk van deze databases, maar sommige zijn het meest geschikt voor bepaalde doeleinden, zoals het beoordelen van de overleving van de patiënt op basis van bepaalde inputs. Systematische analyses van opgehaalde gegevens uit verschillende individuele databases kunnen op overtuigende wijze belangrijke wetenschappelijke bevindingen opleveren.

De huidige analyse richt zich op de rol van Inkeping signalering in eierstokkanker door het gebruik van bio-informatica benaderingen. De meta-Z-analyse op de PRECOG Portal-database werd bijvoorbeeld gebruikt om Z-scores te verkrijgen die de overlevings resultaten van patiënten in klinisch kankeronderzoek aangeven. CSIOVDB is een andere meta-analyse database die werd gebruikt om overlevings resultaten van ovariële kankerpatiënten te bestuderen. De CSIOVDB-gegevens valideerde de bevindingen van het PRECOG-portaal dat NOTCH2, NOTCH3en MAML1 essentieel zijn voor de totale overleving van de patiënt. Later, de toepassingen van de GENT en CCLE databases verder aangetoond dat NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 zijn sterk uitgedrukt in ovariële tumoren en kanker cellijnen. De combinatie van deze databases systematisch onthuld de belangrijke rollen van NOTCH2, NOTCH3, en MAML1 in ovariële kanker. Dit gebruik van bioinformatica methoden voorzag in een efficiënte manier om kankeronderzoek kosteneffectief te doen en laat zien hoe het belangrijke bevindingen kan opleveren voor toekomstige experimentele en klinische toepassingen.

Bio-informatica biedt het publiek de mogelijkheid om toegang te krijgen tot de resultaten van duizenden experimenten in één keer. De informatie die afkomstig is van openbare databases biedt een kosteneffectieve en efficiënte manier om een experimenteel ontwerp te maken voorafgaand aan het uitvoeren van experimenten. Daarnaast is het belangrijk om op te merken dat openbaar beschikbare gegevens verspreid kunnen worden over publicaties en inconsistente of zelfs tegenstrijdige bevindingen kunnen opleveren, waarvoor meta-analyses moeten worden uitgevoerd via bio-informatica benaderingen. Wetenschappers kunnen experimenten ontwerpen en uitvoeren op basis van de gegevens die zijn gevonden via grote bioinformatica-databases om specifieke wetenschappelijke hypotheses te valideren. De resultaten van het Drosophila -experiment bevestigden de bevindingen van de databases van bioinformatica en ondersteunden verder het idee dat notch pathway-componenten moeten blijven worden onderzocht als potentiële therapeutische geneesmiddel doelen. De succesvolle validering van bioinformatica bevindingen door middel van experimenten suggereert ook het belang van bioinformatica benaderingen voor wetenschappelijke ontdekkingen.

Er kunnen enkele beperkingen van bioinformatica zijn. Ten eerste kunnen sommige websites/tools hun bevindingen niet bijwerken vanwege tijd inspanningen of kosten die gepaard gaan met onderhoud. Ten tweede kunnen sommige websites/tools voortdurend worden bijgewerkt, maar de update met extra invoer kan eerder verkregen resultaten wijzigen. Ten derde behouden ontwikkel ontwikkelaars van sommige websites/tools auteursrechten en beperken ze het gebruik van hun inhoud. Ten vierde zijn analyses of algoritmen van bepaalde websites/tools mogelijk niet altijd nauwkeurig.

Om deze beperkingen te overwinnen, worden enkele stappen of aanpassingen en probleemoplossing voor betere toekomstige toepassingen voorgesteld. Ten eerste stellen sommige websites/tools onderzoekers in staat om handmatig nieuwe gegevens te laden voor analyse. Zo niet, onderzoekers kunnen downloaden en analyseren van de meest recente gegevens op hun eigen. Ten tweede moeten onderzoekers herhaaldelijk hun analyses uitvoeren en de data bijhouden. Als resultaten aanzienlijk veranderen, onderzoekers wellicht de extra input van gegevens te gebruiken om erachter te komen van de redenen. Ten derde kunnen onderzoekers een alternatieve website/tool vinden om hun analyses uit te voeren om potentiële auteursrechtproblemen te voorkomen. Ten vierde kunnen onderzoekers extra websites/tools krijgen om hun belangrijke bevindingen te valideren. Als er problemen zijn met analyses of algoritmen, kunnen onderzoekers de gegevens downloaden en opnieuw analyseren om de fouten te corrigeren of andere websites/tools te gebruiken met de juiste instellingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door start-up financiering, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award, en Research Seed Funding Award van Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. (2019).
  2. Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21, (7), 702-712 (2019).
  3. Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43, (1), 70-76 (2019).
  4. Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
  5. Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
  6. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  7. Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 722-735 (2016).
  8. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138, (17), 3593-3612 (2011).
  9. Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5, (2), 207-216 (2000).
  10. Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7761-7774 (2001).
  11. Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9, (5), 837-854 (2019).
  12. Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1, (5), 466-476 (2002).
  13. Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17, (6), 4914-4920 (2019).
  14. Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
  15. Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2, (9), 470-489 (2013).
  16. Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324, (7344), 1018-1022 (2002).
  17. Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21, (8), 938-945 (2015).
  18. Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6, (41), 43843-43852 (2015).
  19. Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
  20. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  21. Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6, (269), (2013).
  22. Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2, (5), 401-404 (2012).
  23. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004, (220), 6 (2004).
  24. Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
  25. Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132, (2), (2019).
  26. Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209, (5), 301-311 (1999).
  27. Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, (19), 4299-4308 (2005).
  28. Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
  29. Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131, (13), 3169-3181 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics