Integrering af Bioinformatik tilgange og eksperimentelle valideringer for at forstå rollen af notch signalering i kræft i æggestokkene

Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bioinformatik er en nyttig måde at behandle store datasæt på. Gennem implementeringen af Bioinformatik tilgange, kan forskerne hurtigt, pålideligt, og effektivt opnå indsigtsfulde applikationer og videnskabelige opdagelser. Denne artikel viser udnyttelsen af Bioinformatik i kræftforskning i æggestokkene. Det også med succes validerer Bioinformatik resultater gennem eksperimenter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Notch signalering er en meget bevaret regulatoriske vej, der er involveret i mange cellulære processer. Dysregulering af denne signalerings pathway fører ofte til interferens med korrekt udvikling og kan endda resultere i initiering eller progression af kræft i visse tilfælde. Fordi denne pathway tjener komplekse og alsidige funktioner, kan det undersøgt udførligt gennem mange forskellige tilgange. Af disse giver Bioinformatik en unægtelig omkostningseffektiv, tilgængelig og brugervenlig studiemetode. Bioinformatik er en nyttig måde at udtrække mindre stykker information fra store datasæt. Gennem gennemførelsen af forskellige Bioinformatik tilgange, kan forskerne hurtigt, pålideligt, og effektivt fortolke disse store datasæt, giver indsigtsfulde applikationer og videnskabelige opdagelser. Her præsenteres en protokol for integration af Bioinformatik tilgange til at undersøge rollen af notch signalering i kræft i æggestokkene. Desuden valideres Bioinformatik fund gennem eksperimenter.

Introduction

Den notch signalering pathway er en meget bevaret vej, der er vigtig for mange udviklingsmæssige processer inden for biologiske organismer. Notch signalering har vist sig at spille en betydelig rolle i celle spredning og selvfornyelse, og defekter i hak signalering pathway kan føre til mange typer af kræft1,2,3,4,5,6. Under visse omstændigheder har den notch signalering pathway været knyttet til både væv vækst og kræft samt celledød og tumor suppression7. Multiple notch receptorer (NOTCH 1 − 4) og co\u2012activator Mastermind (MAML 1 − 3), alle med forskellige funktioner, tilføje et ekstra niveau af kompleksitet. Mens den notch signalering pathway er sofistikeret med hensyn til funktioner, dens centrale pathway er enkel på en molekyl basis8. Notch receptorer fungerer som transmembran proteiner sammensat af ekstracellulære og intracellulære regioner9. En ligand binding til det ekstracellulære område af notch receptorer letter proteolytisk spaltning, som gør det muligt for notch intracellulære domæne (NICD) at blive frigivet i kernen. NICD binder derefter til co\u2012activator Mastermind for at aktivere downstream genekspression10.

I de seneste år har notch signalering vist sig at spille en række roller i indledningen og progression af flere typer af kræft på tværs af forskellige arter6,11. For eksempel har notch signalering været knyttet til tumor involverer Human NOTCH1 gen12. For nylig, den NOTCH2, NOTCH3, Delta-lignende 3 (DLL3), Mastermind\u2012like protein 1 (MAML1), og en disintegrin og metalloproteinase domain\u2012indeholdende protein 17 (ADAM17) gener blev vist sig at være stærkt forbundet med kræft i æggestokkene, især med den dårlige samlede overlevelse af patienter13.

Da mængden af eksperimentelle og patientrelaterede data kontinuerligt øges, stiger efterspørgslen efter analyse af de tilgængelige data også. De tilgængelige data er spredt på tværs af publikationer, og de kan levere usammenhængende eller endog modstridende resultater. Med udviklingen af ny teknologi i de seneste årtier, såsom næste generations sekvensering, er mængden af tilgængelige data vokset eksponentielt. Selv om dette repræsenterer hurtige fremskridt inden for videnskab og muligheder for fortsat biologisk forskning, vurdering af betydningen af offentligt tilgængelige data til at løse forskningsspørgsmål er en stor udfordring14. Vi mener, at Bioinformatik er en nyttig måde at udtrække mindre stykker information fra store datasæt. Gennem gennemførelsen af forskellige Bioinformatik tilgange, kan forskerne hurtigt, pålideligt, og effektivt fortolke disse store datasæt, giver indsigtsfulde opdagelser. Disse opdagelser kan variere fra identifikationen af potentielle nye Drug Therapy mål eller sygdoms biomarkører, til personlige patient behandlinger15,16.

Bioinformatik i sig selv er under hastig udvikling, og tilgange er i konstant forandring som teknologiske fremskridt feje medicinsk og biologisk videnskab. I øjeblikket omfatter fælles Bioinformatik tilgange udnyttelsen af offentligt tilgængelige databaser og softwareprogrammer til at analysere DNA-eller protein sekvenser, identificere gener af særlig relevans eller betydning og bestemme relevansen af gener og genprodukter gennem funktionel genomforskning16. Selv om Bioinformatik området bestemt ikke er begrænset til disse tilgange, er disse vigtige for at hjælpe klinikere og forskere med at forvalte biologiske data til gavn for patienterne som helhed.

Denne undersøgelse har til formål at fremhæve flere vigtige databaser og deres anvendelse til forskning om notch signalering pathway. NOTCH2, NOTCH3og deres co\u2012activator MAML1 blev brugt som eksempler til database studiet. Disse gener blev anvendt, fordi betydningen af den notch signalering pathway i kræft i æggestokkene er blevet valideret. Systematiske analyser af hentede data bekræftede vigtigheden af notch signalering i kræft i æggestokkene. Desuden, fordi notch signalering er godt bevaret på tværs af arter, det blev bekræftet, at overekspression af Drosophila MELANOGASTER NiCd og Mastermind sammen kan fremkalde tumorer i Drosophila æggestokke, støtte databasen resultater og den betydelige og bevaret rolle af notch signalering i kræft i æggestokkene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forudsigelse af kliniske resultater fra Genomprofiler (PRECOG)

Bemærk: PRECOG-portalen (precog.stanford.edu) har adgang til offentligt tilgængelige data fra 165 Cancer Expression-datasæt, herunder genekspressions niveauer og patient kliniske resultater17. Det giver specifikt meta \U2012z analyse, som inkorporerer store datasæt til at give Z\u2012scores af forskellige gener i 39 kræfttyper til at indikere patientens samlede overlevelse. Dårlige og gode overlevelsesrater er indikeret af henholdsvis positive og negative Z\u2012score værdier.

  1. Opret en konto med en akademisk tilknyttet e-mail for at få adgang til denne database. Angiv den mailadresse og adgangskode, der er knyttet til kontoen.
  2. Klik på knappen Vis detaljer , som findes under overskriften meta-Z-analyse .
  3. Indtast interesse genet i søge feltet.
  4. Brug rullepanelet placeret i bunden af skærmen for at opnå overlevelse Z-score for den specifikke kræfttype interesse.

2. CSIOVDB

Bemærk: CSIOVDB (csibio.NUS.edu.SG/CSIOVDB/CSIOVDB.html) er en microarray database udviklet af Cancer Science Institute of Singapore for at studere kræft i æggestokkene18. Denne database indeholder data for carcinomer fra forskellige tumor steder samt normale ovarie vævs data. Derudover giver CSIOVDB Kaplan\u2012Meier overlevelses grunde til at vurdere patientens overlevelse med differens genekspressions niveauer. CSIOVDB kan anvendes til at undersøge sammenslutningen mellem genekspressions niveauer og ovariecancer stadier/-kvaliteter.

  1. Input gen af interesse, og klik derefter på knappen Søg .
  2. Klik på fanen sygdomstilstand .
    Bemærk: denne fane giver sammenfattende statistik over genekspression af målgenet af interesse i æggestokkene Cancer sygdomstilstande.
  3. Klik på fanen histologi .
    Bemærk: denne fane giver sammenfattende statistik over genekspression af målgenet af interesse i større ovariecancer histologier.
  4. Klik på fanen Clinico-patologiske parametre .
    Bemærk: denne fane giver en sammenligning af genekspressions niveauerne blandt forskellige ovariecancer stadier, karakterer og kliniske responser med Mann-Whitney tests.
  5. Klik på fanen overlevelse .
    Bemærk: denne fane giver Kaplan-Meier plots forbundet med samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse. For denne database betragtes sygdomsfri overlevelse som progression-og recidiverfri overlevelse18. Multivariate analyser for samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse findes også under denne fane. De multivariat analyser sammenligne funktioner, der relaterer til kræft i æggestokkene (fase, grad, kirurgisk debulking, histologi, alder) og genet af interesse.
  6. Klik på fanen under type .
    Bemærk: denne fane giver sammenfattende statistikker og Mann-Whitney tests for ekspression niveau af genet af interesse i molekylære undertyper af kræft i æggestokkene. Denne fane giver også Kaplan-Meier plots forbundet med samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse af genet af interesse i molekylære undertyper af kræft i æggestokkene.

3. genekspression på tværs af normal og tumor væv (GENT)

Bemærk: GENT-portalen (Medical \ u2012genome. kribb. re. kr/GENT) er udviklet og vedligeholdt af Korea Research Institute of Bioscience og Biotechnology (KRIBB)19. Det indsamler 16.400 (U133A; 241 datasæt) og 24.300 (U133plus2; 306 datasæt) offentligt tilgængelige prøver. Efter standardisering tilbyder GENT genekspressions data på tværs af forskellige væv, som yderligere opdeles i tumor og normalt væv.

  1. Klik på fanen Søg øverst på skærmen.
  2. I afsnittet med etiketten 1. Søgeord, skal du vælge Gensymbolet for udtrykkene fra rullemenuen, indtaste gensymbolet for det gen af interesse i det tomme område af søgeords sektionen, og vælg væv for type indstillingen.
  3. Klik på knappen Søg nederst i 1. Afsnittet nøgleord . Det viser Resumé grafer af genekspression i normal og tumor væv af forskellige kræfttyper baseret på U133A og U122Plus2 platforme.
    Bemærk: det er valgfrit at vælge data filtrerings muligheden øverst i oversigts grafen for at udvælge en bestemt database til at studere.
  4. Klik på hyperlinket ud for overførsel af resultat data for at få adgang til detaljerede oplysninger om værdierne for genekspression, vævstyper og data kilder.

4. bred Institut Cancer Cell line Encyclopedia (CCLE)

Bemærk: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) blev oprettet af Broad Institute og giver genomprofiler og mutationer af 947 humane Cancer cellelinjer20.

  1. Indtast de ønskede gener i søgefeltet, og klik derefter på knappen Søg .
  2. I afsnittet Vælg datasæt skaldu klikke på indstillingen mRNA Expression (rnaseq) i rullemenuen.
    Bemærk: andre muligheder omfatter mRNA Expression (Affy), Achilles shrna Knockdownog kopi nummer.
  3. Klik på knappen Skift alle spor . Vælg vævstypen interesse fra den grå boks til højre. Rul ned til bunden af skærmen, og klik på knappen Hent mRNA-udtryk .
  4. Åbn det hentede tekstdokument. Kopiér og Indsæt al teksten i ark 1. Kopier al teksten i arket 1.
  5. Klik på arket i fanebladet software Sheet 2 i bunden af regnearket. Højreklik på en kolonne, Vælg Indsæt speciel, og vælg derefter transponering mulighed i ark 2.
  6. Når teksten er gennemført i to kolonner på ark 2, skal du klikke på rullepilen for indstillingen Sortér & filter option og derefter vælge filtrerings indstillingen. En pil vises i overskriftsområdet med navnet gen. Klik på pilen og skriv i vævstype interesse.
    Bemærk: dette trin vil filtrere alle data og kun vise genekspressions niveauer for vævstypen interesse.

5. cBioPortal

Bemærk: cbioportal (www.cioportal.org) blev udviklet på Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), og får adgang til, analyserer og visualiserer storstilet kræft genomiske data21,22. Specifikt, denne portal giver forskerne mulighed for at søge efter genetiske ændringer og signalering netværk.

  1. Ved hjælp af forespørgslen på landingssiden skal du klikke på de organer/væv, som interesserer sig, under afsnittet Select Studies. Vælg den særlige undersøgelse af interesse, derefter ramte forespørgslen ved gene knap.
  2. I afsnittet markeret Vælg Genomprofilerskal du vælge mellem de tre muligheder: mutationer, formodede kopier-nummerændringer fra gisticeller mRNA-udtryk. Vælg yderligere tilsvarende data i rullemenuen for Vælg patient/case-sæt.
  3. Indtast målgensymbolet (erne) i forespørgselsboksen for ENTER- gener. Klik på knappen Send forespørgsel .
  4. Klik på fanen netværk øverst på siden for at hente det ønskede gennetværk.
    Bemærk: signalering-netværket er farvekodet. De indtastede gener er indikeret af frønoder med en tyk kant. Hvert gen repræsenteres af en rød cirkel, og den røde cirkels farveintensitet afspejler dens mutationsfrekvens. Gener er forbundet med forskelligt farvede linjer. Brune linjer betyder "i samme komponent", hvilket indikerer involvering i samme biologiske komponent. Blå linjer betyder "reagerer med", indikerer genreaktioner. Grønne linjer betyder "tilstandsændring", hvilket tyder på, at et gen kan forårsage en tilstandsændring af et andet gen.
  5. Klik på fanen filer øverst i billedet for at vælge Gem som billede (png) til hentning af netværksbillede.

6. dissektion af Drosophila med de ønskede genotyper og dapi-farvning

Bemærk: Saml den kvindelige Drosophila med de ønskede genotyper, derefter dissekere flue æggestokkene til at gennemgå procedurerne for dapi farvning til Imaging.

  1. Forbered flyve bestande TJ-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w *; UAS-Mam. A; og w [1118] for at skabe fluer med NiCd-overekspression (TJ-Gal4, Gal80ts/+; UAS-NICD-GFP/+) og NiCd og Mam-Overexpression (TJ-Gal4, Gal80ts/UAS-Mam. A; Af UAS-NICD-GFP/+).
  2. Anvend den tidsmæssige og regionale genekspression målretning (Target) teknik til at styre temporale gen Expression23. Hæve fluer ved 18 °C indtil voksenalderen, derefter skifte til 29 °C for 48 h med gær før dissektion.
    Bemærk: TJ-Gal4 kan kun køre UAS -ekspression under højere temperaturer, når hæmningen ved Gal80ts er lettet. Tilsætning af gær før dissektion forstørrer æggestokkene for høst.
  3. 3 mL 1x fosfat-bufferet saltvand (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM na2HPO4, 1,8 mm KH2po4) placeres i en embryoopsamlings skål. Brug en CO2 pad til at bedøve fluer.
  4. Vælg en kvindelig flue, og Tag forsigtigt den nedre thorax af flue ved hjælp af et par dissekere-pincet, og Nedsænk det i 1x PBS-opløsningen i en embryoopsamlings skål. Brug et andet par tang til at klemme underlivet og træk forsigtigt for at frigøre de indre organer.
  5. Identificer og frigør æggestokkene fra flyve kroppen. Bryd den muskuløse kappe placeret på den bageste ende af æggestokkene og adskille ovarioler.
    Bemærk: adskillelse af ovarioler og bryde den muskuløse kappe er nødvendig for at opnå højere kvalitet farvning resultater.
  6. Æggestokkene placeres i et 1,5 mL centrifugeglas, der indeholder 500 μL 1x PBS. Røret skal forblive på is, indtil alle æggestokke er indsamlet.
  7. Tag 1x PBS og Placer 0,5 mL Fix-opløsning (4% formaldehyd) i røret. Placer røret på nutator i 10 min.
  8. Fjern Fix-opløsningen fra røret og kassér den i en egnet affaldsbeholder. Brug 1 mL 1x PBT (1x PBS suppleret med 0,4% Triton™ X-100) til at vaske æggestokkene 3x i 15 min.
  9. Den endelige PBT-vask kasseres, og 1 mL PBTG tilsættes (0,2% bovint serumalbumin, 5% normalt gede serum i 1x PBT) for at forhindre uspecifik binding.
    Bemærk: dette trin kan springes over for DAPI-farvning, men det er vigtigt for antistof farvning. Detaljeret immun Histokemisk farvning kan findes i Jia et al.24.
  10. Placer 150 μL DAPI (10 μg/mL) i røret i 10 − 15 minutters nutation. Kassér DAPI'EN og vask æggestokkene 1x i 10 min ved brug af 1 mL 1x PBT. Fjern PBT-og vask 2x i 10 minutter med 1x PBS.
  11. Fjern overskydende PBS, indtil ca. 300 μL PBS forbliver i røret med æggestokkene. Pipet æggestokkene op og ned flere gange ved hjælp af en 200 μL pipette, for at frigøre ægge kamre.
  12. Drej forsigtigt røret ned og fjern forsigtigt så meget 1x PBS-opløsning som muligt uden at fjerne æggestokkene. Placer 120 μL monterings opløsning (1 g n-propylgallat, 5 ml 10X PBS, 40 ml glycerol og 5 ml dH2O) i røret.
    Bemærk: monterings opløsningen er klæbrig, så det er svært at overføre præcis 120 μL monterings opløsning til et rør. For at afhjælpe dette problem kan en 1.000 μL pipettespids bruges til at tilføje tre dråber monterings opløsning i røret.
  13. Fjern ca. 0,33 mm fra en 200 μL pipettespids, og brug den nyskårne pipettespids til at placere monterings opløsningen på et mikroskop glas rutsjebane.
  14. Anbring forsigtigt coverskridglasset på monterings opløsningen, og forsegl kanterne på dæksedlen med transparent neglelak.
    Bemærk: tætning af kanterne af dækglasset er nødvendig for at forhindre ægkamrene i at flyde inde i monterings opløsningen, når der tages konfokale billeder.
  15. Hent billeder med et Konfokal mikroskop ved hjælp af følgende indstillinger: objektiv linse = 10x forstørrelse; numerisk blænde = 0,8; DAPI-emissionbølge længde = 410 − 513 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af den procedure, der blev nævnt i trin 1 ved hjælp af PRECOG-portalen, blev Z-scoren for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kræft i æggestokkene opnået (henholdsvis 1,3, 2,32, 1,62). De negative Z\u2012score værdier indikerer den dårlige samlede overlevelse af patienter med høje ekspressionsniveauer af de tre gener. Ved hjælp af betinget formatering af regnearks softwaren vises værdierne for Z\u2012score i et farvet bjælkediagram i figur 1.

CSIOVDB-databasen blev brugt til at bekræfte resultaterne. Brug af instruktionerne i trin 2, NOTCH2, NOTCH3og MAML1 blev sekventielt indtastet i csiovdb-databasens søgeområde, og patientens overlevelsesdata, der er placeret under fanen overlevelse , blev hentet. Ud over de samlede overlevelses data giver CSIOVDB sygdomsfri overlevelse. CSIOVDB udskille yderligere patienter for at præsentere overlevelsesdata baseret på Q1 vs. Q4 (nedre kvartil vs. øvre kvartil) af genekspressions niveauer. I overensstemmelse med tidligere fund, højt ekspression af NOTCH2, NOTCH3og MAML1 korrelerer med dårlig samlet overlevelse og sygdomsfri overlevelse (figur 2A, B). I mellemtiden, den Clinico-patologiske parametre fanen af CSIOVDB giver også en sammenligning af genet ekspression niveauer blandt forskellige ovariecancer stadier, kvaliteter, og kliniske reaktioner med Mann-Whitney tests. Resultaterne viser, at højere ekspressionsniveauer af NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er forbundet med avancerede ovariecancer stadier (figur 2C).

Da NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er afgørende for patientens overlevelse, blev genekspressions niveauerne i ovarietumorer og cancer cellelinjer undersøgt yderligere. Udtrykket data af NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i normal og tumor OVARIE væv blev hentet fra U133A platform ved hjælp af trin 3 instruktioner til Gent. Forskerne kan behandle de downloadede data i henhold til deres egne specifikke forskningsformål. Her udnyttede vi dataene til at producere kassen og hale-plots ved hjælp af graphpad Prism (version 8). Yderligere permutation undersøgelser tyder på, at NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 er stærkt udtrykt i tumor væv (figur 3A). Dernæst blev udtryks data for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i æggestokkene Cancer cellelinjer hentet i henhold til protokol trin 4 ved hjælp af ccle. Genekspressions niveauerne i Cancer cellelinjer vises ved kassen og hale-plots (figur 3B). Selvom udtryks niveauerne for NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er høje i Cancer cellelinjer, kan der ikke drages konklusioner på grund af manglen på normale cellelinje Kontroller i ccle-databasen. Men, forskerne kan identificere oprindelsen af kræft cellelinjer, og sammenligne ekspressionsniveauer baseret på forskellige kvaliteter, stadier, og andre clinicopathological parametre.

Når betydningen af NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i kræft i æggestokkene blev bekræftet, cbioportal blev udnyttet til at studere deres tilhørende signal netværk. Ved hjælp af protokol trin 5 blev Ovary/fallopian tube udvalgt til udvalgte undersøgelser, derefter blev det ovarie serøse cystadenocarcinoma (tcga, Nature 2011) datasæt valgt til analyse. For afsnittet med etiketten Vælg Genomprofilerblev mRNA-udtrykket valgt, og endelig dets profil mRNA Expression Z-score (alle gener). For sektionen Vælg patient/case set, blev prøverne med mRNA data (Agilent microarray) (489) valgt fra rullemenuen. I slutningen blev gener NOTCH2, NOTCH3og MAML1 valgt til at sende forespørgslen. Baseret på de tre kerne gener blev der oprettet et signalerings netværk for at give de 50 hyppigst ændrede tilstødende gener, som også er på samme vej med de højeste Mutations rater (figur 4).

Fordi notch signalering er godt bevaret på tværs af arter, det blev undersøgt i Drosophila kræft i æggestokkene. Notch signalering er tidligere blevet rapporteret til at regulere follikel celle spredning25, differentiering26,27, og celle cyklus regel28,29. Overekspression af NICD alene inducerede ikke tumorer i Drosophila (figur 5A), da epitelet af Drosophila ægge kamre forblev intakt med et enkelt lag. Men, over ekspression af NICD og Mam sammen induceret tumorer i Drosophila (figur 5B), som er demonstreret ved flere epiteliale lag og akkumulerede celler.

Figure 1
Figur 1: ekspression af NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kræft i æggestokkene er forbundet med dårlig samlet overlevelse. Overlevelse Z-scores af NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i æggestokkene cancerpatienter præsenteres. Dårlig overlevelse er indikeret af negative Z\u2012score værdier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: høje niveauer af NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 i kræft i æggestokkene er forbundet med dårlig samlet overlevelse, dårlig sygdomsfri overlevelse, og avancerede kræft stadier. Microarray databasen CSIOVDB giver Kaplan-Meier samlede overlevelse og sygdomsfrie overlevelses grunde NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i æggestokkene cancerpatienter, og genekspression niveauer i forskellige kræft stadier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: NOTCH2, NOTCH3og MAML1 udtrykkes i høj grad i ovarietumorer og cancer cellelinjer. P-værdier er indiceret til at sammenligne genekspression i normale æggestokke og tilsvarende ovarietumorer. (Forkortelser: ovarie-N = normal ovarie væv; Ovarie-C = æggestokkene Cancer væv). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: NOTCH2/NOTCH3/MAML1 gener og deres tilhørende signalerings netværk med 50 hyppigst ændrede tilstødende gener. Signalering-netværket er farvekodet. De indtastede gener er indikeret af frønoder med en tyk kant. Hvert gen repræsenteres af en rød cirkel, og den røde cirkels farveintensitet afspejler dens mutationsfrekvens. Gener er forbundet med forskelligt farvede linjer. Brune linjer betyder "i samme komponent", hvilket indikerer involvering i samme biologiske komponent. Blå linjer betyder "reagerer med", indikerer genreaktioner. Grønne linjer betyder "tilstandsændring", hvilket tyder på, at et gen kan forårsage en tilstandsændring af et andet gen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: NiCd og Mam i Drosophila inducerer også ovarietumorer. A. overekspression af NiCd alene inducerer ikke tumordannelse i Drosophila. B. overekspression af NiCd og Mam sammen fremkalde tumorer i Drosophila. Scale bar = 50 μm Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Da der er utallige tilgange og metoder til udnyttelse af bioinformatik, er der mange databaser tilgængelige online til offentligheden. En overflod af oplysninger kan udvindes fra hver af disse databaser, men nogle er bedst egnet til særlige formål, såsom vurdering af patientens overlevelse baseret på visse input. Systematiske analyser af indhentede data fra forskellige individuelle databaser kan på overbevisende måde give vigtige videnskabelige resultater.

Den aktuelle analyse fokuserer på rollen af notch signalering i kræft i æggestokkene gennem udnyttelse af Bioinformatik tilgange. For eksempel, meta-Z analyse på PRECOG Portal database blev brugt til at opnå Z-scores, der indikerer patientens overlevelse resultater i kliniske kræft undersøgelser. CSIOVDB er en anden meta-analysedata base, der blev brugt til at studere overlevelse resultater af æggestokkene cancerpatienter. CSIOVDB-dataene validerede resultaterne fra PRECOG-portalen, som NOTCH2, NOTCH3og MAML1 er afgørende for patientens samlede overlevelse. Senere, ansøgningerne fra GENT og CCLE databaser yderligere påvist, at NOTCH2, NOTCH3, og MAML1 er stærkt udtrykt i æggestokkene tumorer og kræft cellelinjer. Kombinationen af disse databaser afslørede systematisk de betydelige roller NOTCH2, NOTCH3og MAML1 i kræft i æggestokkene. Denne brug af Bioinformatik metoder gav en effektiv måde at gøre kræftforskning omkostningseffektivt og viser, hvordan det kan give vigtige resultater for fremtidige eksperimentelle og kliniske anvendelser.

Bioinformatik giver offentligheden mulighed for at få adgang til resultater fra tusindvis af eksperimenter på én gang. De oplysninger, der stammer fra offentlige databaser, giver en omkostningseffektiv og effektiv måde at etablere et eksperimentelt design på, før der udføres eksperimenter. Desuden er det vigtigt at bemærke, at offentligt tilgængelige data kan spredes på tværs af publikationer og kan levere usammenhængende eller endog modstridende resultater, hvilket kræver, at der udføres metaanalyser gennem Bioinformatik tilgange. Forskerne kan designe og udføre eksperimenter baseret på de data, som findes i store Bioinformatik databaser for at validere specifikke videnskabelige hypoteser. Resultaterne fra Drosophila -eksperimentet bekræftede resultaterne fra Bioinformatik databaserne og støttede yderligere idéen om, at komponenter i notch pathway fortsat skal undersøges som potentielle terapeutiske stofmål. Den vellykkede validering af Bioinformatik resultater gennem eksperimenter tyder også på betydningen af Bioinformatik tilgange til videnskabelige opdagelser.

Der kan være visse begrænsninger i bioinformatik. For det første vil nogle websites/værktøjer muligvis ikke opdatere deres resultater på grund af tids tiltag eller omkostninger i forbindelse med vedligeholdelse. For det andet, nogle hjemmesider/værktøjer konstant opdatere, men opdateringen med yderligere input kan ændre tidligere opnåede resultater. For det tredje, udviklere af nogle hjemmesider/værktøjer forbeholde ophavsret og begrænse brugen af deres indhold. For det fjerde er analyser eller algoritmer af visse websites/værktøjer måske ikke altid nøjagtige.

For at overvinde disse begrænsninger foreslås nogle trin eller modifikationer og fejlfinding for bedre fremtidige applikationer. For det første tillader nogle websites/værktøjer forskerne manuelt at indlæse nye data til analyse. Hvis ikke, kan forskerne downloade og analysere de nyeste data på egen hånd. For det andet, forskere har brug for at gentagne gange køre deres analyser, og holde referat af datoerne. Hvis resultaterne væsentligt ændrer sig, kan forskerne nødt til at bruge den ekstra input af data til at finde ud af årsagerne. For det tredje, forskerne kan finde en alternativ hjemmeside/værktøj til at køre deres analyser for at undgå potentielle Copyright spørgsmål. Fjerde, forskere kan få yderligere hjemmesider/værktøjer til at validere deres vigtige resultater. Hvis der er problemer med analyser eller algoritmer, kan forskerne downloade og analysere dataene for at rette fejlene eller bruge andre websteder/værktøjer med de relevante indstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af start-up-finansiering, College of Science og matematik forskningstilskud, sommer forskning session Award, og forskning seed finansiering Award fra Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bocchicchio, S., Tesone, M., Irusta, G. Convergence of Wnt and Notch signaling controls ovarian cancer cell survival. Journal of Cellular Physiology. (2019).
  2. Hibdon, E. S., et al. Notch and mTOR Signaling Pathways Promote Human Gastric Cancer Cell Proliferation. Neoplasia. 21, (7), 702-712 (2019).
  3. Kucukkose, C., Yalcin Ozuysal, O. Effects of Notch signalling on the expression of SEMA3C, HMGA2, CXCL14, CXCR7, and CCL20 in breast cancer. Turkish Journal of Biology. 43, (1), 70-76 (2019).
  4. Lan, G., et al. Notch pathway is involved in the suppression of colorectal cancer by embryonic stem cell microenvironment. OncoTargets and Therapy. 12, 2869-2878 (2019).
  5. Lian, H., et al. Notch signaling promotes serrated neoplasia pathway in colorectal cancer through epigenetic modification of EPHB2 and EPHB4. Cancer Management and Research. 10, 6129-6141 (2018).
  6. Salazar, J. L., Yamamoto, S. Integration of Drosophila and Human Genetics to Understand Notch Signaling Related Diseases. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1066, 141-185 (2018).
  7. Bray, S. J. Notch signalling in context. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, (11), 722-735 (2016).
  8. Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138, (17), 3593-3612 (2011).
  9. Brou, C., et al. A novel proteolytic cleavage involved in Notch signaling: the role of the disintegrin-metalloprotease TACE. Molecular Cell. 5, (2), 207-216 (2000).
  10. Oswald, F., et al. p300 acts as a transcriptional coactivator for mammalian Notch-1. Molecular and Cellular Biology. 21, (22), 7761-7774 (2001).
  11. Xiu, M. X., Liu, Y. M. The role of oncogenic Notch2 signaling in cancer: a novel therapeutic target. American Journal of Cancer Research. 9, (5), 837-854 (2019).
  12. Allenspach, E. J., Maillard, I., Aster, J. C., Pear, W. S. Notch signaling in cancer. Cancer Biololgy & Therapy. 1, (5), 466-476 (2002).
  13. Jia, D., Underwood, J., Xu, Q., Xie, Q. NOTCH2/NOTCH3/DLL3/MAML1/ADAM17 signaling network is associated with ovarian cancer. Oncology Letters. 17, (6), 4914-4920 (2019).
  14. Weng, J. T., et al. Novel bioinformatics approaches for analysis of high-throughput biological data. Biomed Research International. 2014, 814092 (2014).
  15. Readhead, B., Dudley, J. Translational Bioinformatics Approaches to Drug Development. Advances in Wound Care (New Rochelle). 2, (9), 470-489 (2013).
  16. Bayat, A. Science, medicine, and the future: Bioinformatics. BMJ. 324, (7344), 1018-1022 (2002).
  17. Gentles, A. J., et al. The prognostic landscape of genes and infiltrating immune cells across human cancers. Nature Medicine. 21, (8), 938-945 (2015).
  18. Tan, T. Z., et al. CSIOVDB: a microarray gene expression database of epithelial ovarian cancer subtype. Oncotarget. 6, (41), 43843-43852 (2015).
  19. Shin, G., et al. GENT: gene expression database of normal and tumor tissues. Cancer Informatics. 10, 149-157 (2011).
  20. Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483, (7391), 603-607 (2012).
  21. Gao, J. J., et al. Integrative Analysis of Complex Cancer Genomics and Clinical Profiles Using the cBioPortal. Science Signaling. 6, (269), (2013).
  22. Cerami, E., et al. The cBio Cancer Genomics Portal: An Open Platform for Exploring Multidimensional Cancer Genomics Data. Cancer Discovery. 2, (5), 401-404 (2012).
  23. McGuire, S. E., Mao, Z., Davis, R. L. Spatiotemporal gene expression targeting with the TARGET and gene-switch systems in Drosophila. Science's STKE. 2004, (220), 6 (2004).
  24. Jia, D., Huang, Y. C., Deng, W. M. Analysis of Cell Cycle Switches in Drosophila Oogenesis. Methods in Molecular Biology. 1328, 207-216 (2015).
  25. Lo, P. K., Huang, Y. C., Corcoran, D., Jiao, R., Deng, W. M. Inhibition of Notch signaling by the p105 and p180 subunits of Drosophila chromatin assembly factor 1 is required for follicle cell proliferation. Journal of Cell Science. 132, (2), (2019).
  26. Keller Larkin, M., et al. Role of Notch pathway in terminal follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. Development Genes and Evolution. 209, (5), 301-311 (1999).
  27. Sun, J., Deng, W. M. Notch-dependent downregulation of the homeodomain gene cut is required for the mitotic cycle/endocycle switch and cell differentiation in Drosophila follicle cells. Development. 132, (19), 4299-4308 (2005).
  28. Jia, D., et al. A large-scale in vivo RNAi screen to identify genes involved in Notch-mediated follicle cell differentiation and cell cycle switches. Scientific Reports. 5, 12328 (2015).
  29. Shcherbata, H. R., Althauser, C., Findley, S. D., Ruohola-Baker, H. The mitotic-to-endocycle switch in Drosophila follicle cells is executed by Notch-dependent regulation of G1/S, G2/M and M/G1 cell-cycle transitions. Development. 131, (13), 3169-3181 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics