Intégration des approches bioinformatiques et des validations expérimentales pour comprendre le rôle de la signalisation de l'entaille dans le cancer de l'ovaire

Cancer Research

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Summary

La bioinformatique est un moyen utile de traiter les ensembles de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre d'approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent obtenir rapidement, de manière fiable et efficace des applications perspicaces et des découvertes scientifiques. Cet article démontre l'utilisation de la bioinformatique dans la recherche sur le cancer de l'ovaire. Il valide également avec succès les résultats de la bioinformatique par l'expérimentation.

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Defreitas, S., Rowe, M., Paculis, L., Jia, D. Integration of Bioinformatics Approaches and Experimental Validations to Understand the Role of Notch Signaling in Ovarian Cancer. J. Vis. Exp. (155), e60502, doi:10.3791/60502 (2020).

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Abstract

La signalisation d'encoche est une voie réglementaire fortement conservée impliquée dans beaucoup de processus cellulaires. La dysrégulation de cette voie de signalisation conduit souvent à l'interférence avec le développement approprié et peut même avoir comme conséquence l'initiation ou la progression des cancers dans certains cas. Parce que cette voie sert des fonctions complexes et polyvalentes, elle peut être étudiée en profondeur à travers de nombreuses approches différentes. Parmi ceux-ci, la bioinformatique fournit une méthode d'étude indéniablement rentable, accessible et conviviale. La bioinformatique est un moyen utile d'extraire de plus petites informations à partir de jeux de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre de diverses approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent interpréter rapidement, de façon fiable et efficace ces grands ensembles de données, donnant des applications perspicaces et des découvertes scientifiques. Ici, un protocole est présenté pour l'intégration des approches bioinformatiques pour étudier le rôle de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire. En outre, les résultats de la bioinformatique sont validés par l'expérimentation.

Introduction

La voie de signalisation Notch est une voie très conservée qui est importante pour de nombreux processus de développement au sein des organismes biologiques. La signalisation d'encoche a été montrée pour jouer un rôle significatif dans la prolifération et l'auto-renouvellement de cellules, et les défauts dans la voie de signalisation de notch peuvent mener à beaucoup de types de cancers1,2,3,4,5,6. Dans certaines circonstances, la voie de signalisation Notch a été liée à la fois à la croissance des tissus et le cancer ainsi que la mort cellulaire et la suppression des tumeurs7. Les récepteurs de l'entaille multiple (NOTCH 1-4) et le mastermind de l'activateur co-u2012 (MAML 1-3), tous avec des fonctions diverses, ajoutent un niveau supplémentaire de complexité. Alors que la voie de signalisation Notch est sophistiquée en termes de fonctions, sa voie de base est simple sur une base moléculaire8. Les récepteurs d'entaille agissent comme protéines transmembranaires composées de régions extracellulaires et intracellulaires9. Une liaison de ligand à la région extracellulaire des récepteurs notifient facilite le clivage protéolytique, qui permet au domaine intracellulaire Notch (NICD) d'être libéré dans le noyau. NICD se lie ensuite à mastermind co-u2012activateur pour activer l'expression du gène en aval10.

Ces dernières années, notch signalisation a été montré à jouer une variété de rôles dans l'initiation et la progression de plusieurs types de cancers à travers différentes espèces6,11. Par exemple, la signalisation Notch a été liée à la tumorigénèse impliquant le gène humain NOTCH1 12. Récemment, les gènes NOTCH2, NOTCH3, Delta-like 3 (DLL3), Mastermind-u2012like protein 1 (MAML1), et un domaine de disintegrin et de métalloproteinase-u2012 contenant la protéine 17 (ADAM17) gènes se sont avérés fortement associés au cancer de l'ovaire, particulièrement avec la faible survie globale des patients13.

À mesure que la quantité de données expérimentales et associées aux patients augmente continuellement, la demande d'analyse des données disponibles augmente également. Les données disponibles sont dispersées dans les publications, et elles peuvent fournir des conclusions contradictoires, voire contradictoires. Avec le développement de nouvelles technologies au cours des dernières décennies, comme le séquençage de la prochaine génération, la quantité de données disponibles a augmenté de façon exponentielle. Bien que cela représente des progrès rapides dans la science et des possibilités de recherche biologique continue, l'évaluation de la signification des données accessibles au public pour résoudre les questions de recherche est un grand défi14. Nous croyons que la bioinformatique est un moyen utile d'extraire de plus petites informations à partir de jeux de données à grande échelle. Grâce à la mise en œuvre de diverses approches bioinformatiques, les chercheurs peuvent interpréter rapidement, de façon fiable et efficace ces grands ensembles de données, ce qui donne lieu à des découvertes perspicaces. Ces découvertes peuvent aller de l'identification de nouvelles cibles potentielles de pharmacothérapie ou de biomarqueurs de la maladie, aux traitements personnalisés des patients15,16.

La bioinformatique elle-même évolue rapidement, et les approches sont en constante évolution à mesure que les progrès technologiques balayent la science médicale et biologique. À l'heure actuelle, les approches bioinformatiques courantes comprennent l'utilisation de bases de données accessibles au public et de programmes logiciels pour analyser les séquences d'ADN ou de protéines, identifier les gènes d'une pertinence ou d'une importance particulière, et déterminer la pertinence des gènes et des produits géniques par le biais de la génomique fonctionnelle16. Bien que le domaine de la bioinformatique ne se limite certainement pas à ces approches, celles-ci sont importantes pour aider les cliniciens et les chercheurs à gérer les données biologiques dans l'intérêt de l'ensemble des patients.

Cette étude vise à mettre en évidence plusieurs bases de données importantes et leur utilisation pour la recherche sur la voie de signalisation Notch. NOTCH2, NOTCH3, et leur co-u2012activator MAML1 ont été utilisés comme exemples pour l'étude de base de données. Ces gènes ont été utilisés parce que l'importance de la voie de signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire a été validée. Des analyses systématiques des données récupérées ont confirmé l'importance de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire. En outre, parce que la signalisation Notch est bien conservé entre les espèces, il a été confirmé que la surexpression de Drosophila melanogaster NICD et Mastermind ensemble peut induire des tumeurs dans les ovaires Drosophila, soutenant les résultats de la base de données et le rôle significatif et conservé de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire.

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Protocol

1. Prévision des résultats cliniques à partir de profils génomiques (PRECOG)

REMARQUE : Le portail PRECOG (precog.stanford.edu) accède aux données accessibles au public à partir de 165 ensembles de données sur l'expression du cancer, y compris les niveaux d'expression génique et les résultats cliniques des patients17. Il fournit spécifiquement l'analyse Meta-u2012Z, qui intègre de grands ensembles de données pour fournir des scores de différents gènes dans 39 types de cancer pour indiquer la survie globale du patient. Les taux de survie médiocres et bons sont indiqués par des valeurs positives et négatives de Z-u2012score, respectivement.

  1. Créez un compte avec un e-mail affilié à un universitaire pour accéder à cette base de données. Entrez l'adresse e-mail et le mot de passe associés au compte.
  2. Cliquez sur le bouton Afficher les détails situé sous le titre d'analyse Meta-Z.
  3. Entrez le gène d'intérêt dans la barre de recherche.
  4. Utilisez la barre de défilement située en bas de l'écran pour obtenir le z-score de survie pour le type spécifique de cancer d'intérêt.

2. CSIOVDB

REMARQUE: CSIOVDB (csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html) est une base de données sur les microréseaux développée par le Cancer Science Institute de Singapour pour étudier le cancer del'ovaire 18. Cette base de données contient des données de carcinomes de différents sites tumoraux ainsi que des données normales sur les tissus des ovaires. En outre, CSIOVDB fournit des parcelles de survie de Kaplan-u2012Meier pour évaluer la survie du patient avec des niveaux différentiels d'expression de gène. CSIOVDB peut être appliqué pour étudier l'association entre les niveaux d'expression des gènes et les stades/grades du cancer de l'ovaire.

  1. Gène d'entrée d'intérêt, puis cliquez sur le bouton Recherche.
  2. Cliquez sur l'onglet État de la maladie.
    REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires de l'expression génique du gène cible d'intérêt dans les états de maladie de cancer de l'ovaire.
  3. Cliquez sur l'onglet Histologie.
    REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires de l'expression génique du gène cible d'intérêt pour les histologies majeures du cancer de l'ovaire.
  4. Cliquez sur l'onglet Paramètres clinico-pathologiques.
    REMARQUE : Cet onglet fournit une comparaison des niveaux d'expression de gène entre différents stades, grades, et réponses cliniques de cancer de l'ovaire avec des essais de Mann-Whitney.
  5. Cliquez sur l'onglet Survie.
    REMARQUE : Cet onglet fournit des parcelles Kaplan-Meier associées à la survie globale et à la survie sans maladie. Pour cette base de données, la survie sans maladie est considérée comme une survie sans progression et sans récurrence18. Des analyses multivariées pour la survie globale et la survie sans maladie se trouvent également sous cet onglet. Les analyses multivariées comparent les caractéristiques qui se rapportent aux pronostics du cancer de l'ovaire (stade, grade, débulking chirurgical, histologie, âge) et au gène d'intérêt.
  6. Cliquez sur l'onglet Sous-type.
    REMARQUE : Cet onglet fournit des statistiques sommaires et des tests Mann-Whitney pour le niveau d'expression du gène d'intérêt dans les sous-types moléculaires du cancer de l'ovaire. Cet onglet fournit également des parcelles Kaplan-Meier associées à la survie globale et à la survie sans maladie du gène d'intérêt pour les sous-types moléculaires du cancer de l'ovaire.

3. Expression génique à travers le tissu normal et tumoral (GENT)

REMARQUE : Le portail GENT (medical-u2012genome.kribb.re.kr/GENT) est développé et maintenu par l'Institut de recherche coréen en biosciences et biotechnologie (KRIBB)19. Il recueille 16 400 (U133A; 241 ensembles de données) et 24 300 (U133plus2; 306 ensembles de données) échantillons accessibles au public. Après normalisation, GENT offre des données d'expression génique à travers divers tissus, qui sont encore divisés en tumeurs et tissus normaux.

  1. Cliquez sur l'onglet Recherche en haut de l'écran.
  2. Dans la section étiquetée 1. Mot-clé, sélectionnez le symbole gène pour les Termes à partir du menu déroulant, entrez le symbole génétique du gène d'intérêt dans la zone vierge de la section Mot-clé, et sélectionnez Tissu pour l'option Type.
  3. Cliquez sur le bouton Recherche en bas de la 1. Section mot-clé. Il montre les graphiques sommaires de l'expression génique dans les tissus normaux et tumoraux de différents types de cancer basés sur les plates-formes U133A et U122Plus2.
    REMARQUE : Il est facultatif de sélectionner l'option de filtrage des données en haut du graphique récapitulatif pour sélectionner une base de données particulière à étudier.
  4. Cliquez sur le lien à côté de Result Data Download pour accéder aux informations détaillées sur les valeurs d'expression des gènes, les types de tissus et les sources de données.

4. Encyclopédie de ligne de cellules cancéreuses de l'Institut large (CCLE)

REMARQUE: CCLE (portals.broadinstitute.org/ccle) a été créé par le Broad Institute et fournit des profils génomiques et des mutations de 947 lignées cellulaires cancéreuses humaines20.

  1. Entrez les gènes désirés dans la barre de recherche, puis cliquez sur le bouton Recherche.
  2. Dans la section étiquetée Select Dataset, cliquez sur l'option expression ARNm (RNAseq) du menu déroulant.
    REMARQUE: D'autres options incluent l'expression de l'ARNm (Affy), Achilles shRNA knockdown, et le numérode copie .
  3. Cliquez sur le bouton Toggle All Traces. Sélectionnez le type de tissu d'intérêt de la boîte grise sur la droite. Faites défiler vers le bas de l'écran et cliquez sur le bouton d'expression de l'ARNm Télécharger.
  4. Ouvrez le document texte téléchargé. Copier et coller tout le texte dans la feuille 1. Copiez tout le texte dans la feuille 1.
  5. Cliquez sur la feuille dans le logiciel de tableur Feuille 2 onglet sur le bas de la feuille de calcul. Cliquez à droite sur la colonne A, sélectionnez Paste Special, puis sélectionnez l'option Transpose dans la feuille 2.
  6. Une fois que le texte est transposé en deux colonnes sur la feuille 2,cliquez sur la flèche de déclassement pour le titre d'option De tri et de filtre, puis sélectionnez l'option Filtre. Une flèche apparaîtra dans la zone de cap étiquetée Gène. Cliquez sur la flèche et tapez dans le type de tissu d'intérêt.
    REMARQUE : Cette étape filtrera toutes les données et affichera uniquement les niveaux d'expression des gènes pour le type d'intérêt tissulaire.

5. cBioPortal

REMARQUE : cBioPortal (www.cioportal.org) a été développé au Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK), et accède, analyse et visualise les données génomiques sur le cancer à grande échelle21,22. Plus précisément, ce portail permet aux chercheurs de rechercher des altérations génétiques et des réseaux de signalisation.

  1. À l'aide de la requête sur la page de destination, cliquez sur les organes/tissus d'intérêt sous la section intitulée Select Studies. Sélectionnez l'étude d'intérêt particulière, puis appuyez sur le bouton Query By Gene.
  2. Dans la section étiquetée Select Genomic Profiles, sélectionnez parmi les trois options : Mutations, modifications putatives du numéro de copie de GISTIC, ou arnarité. Sélectionnez d'autres données correspondantes à partir du menu déroulant pour Sélectionner le patient/l'ensemble de cas.
  3. Entrez le symbole du gène cible dans la boîte de requête de Enter Genes. Cliquez sur le bouton Soumettre la requête.
  4. Cliquez sur l'onglet Réseau en haut de la page pour récupérer le réseau génétique souhaité.
    REMARQUE : Le réseau de signalisation est codé en couleur. Les gènes intrants sont indiqués par des nœuds de graines avec une bordure épaisse. Chaque gène est représenté par un cercle rouge, et l'intensité de couleur du cercle rouge reflète sa fréquence de mutation. Des gènes sont reliés par des lignes de couleur différente. Les lignées brunes signifient « Dans la même composante », indiquant la participation à la même composante biologique. Les lignes bleues signifient « Réagit avec », indiquant des réactions de gène. Les lignes vertes signifient « changement d'état », suggérant qu'un gène pourrait causer un changement d'état d'un autre gène.
  5. Cliquez sur l'onglet Fichier en haut de l'image pour choisir Enregistrer comme Image (PNG) pour le téléchargement d'images réseau.

6. Dissection de Drosophila avec génotypes désirés et coloration DAPI

REMARQUE: Recueillir la Drosophila femelle avec les génotypes désirés, puis disséquer les ovaires mouche pour subir les procédures de coloration DAPI pour la formation image.

  1. Préparer les stocks de mouches tj-Gal4, Gal80ts/CyO; UAS-NICD-GFP/TM6B, w. UAS-mam.A; et w[1118] pour créer des mouches avec NICD-surexpression (tj-Gal4, Gal80ts/ UAS-NICD-GFP/ )et NICD et mam-surexpression(tj-Gal4, Gal80ts/UAS-mam.A; UAS-NICD-GFP/MD).
  2. Appliquer la technique de ciblage temporel et régional de l'expression génique (TARGET) pour contrôler l'expression du gène spatiotemporal23. Élever les mouches à 18 oC jusqu'à l'âge adulte, puis passer à 29 oC pendant 48 h avec de la levure avant la dissection.
    REMARQUE: tj-Gal4 ne peut conduire l'expression UAS sous des températures plus élevées, lorsque l'inhibition par Gal80ts est soulagé. L'ajout de levure avant la dissection agrandit les ovaires pour la récolte.
  3. Placer 3 mL de saline tamponnée de phosphate 1x (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 m KH2PO4) dans un plat de collecte d'embryons. Utilisez un tampon CO2 pour anesthésier les mouches.
  4. Choisissez une mouche femelle, puis prenez soigneusement le thorax inférieur de la mouche à l'aide d'une paire de forceps disséquants et plongez-la dans la solution 1x PBS dans un plat de collecte d'embryons. Utilisez une deuxième paire de forceps pour pincer le bas-ventre et tirer doucement pour libérer les organes internes.
  5. Identifiez et détachez la paire d'ovaires du corps de la mouche. Casser la gaine musculaire située à l'extrémité postérieure des ovaires et séparer les ovarioles.
    REMARQUE : Il faut séparer les ovarioles et briser la gaine musculaire afin d'obtenir des résultats de coloration de meilleure qualité.
  6. Placer les ovaires dans un tube centrifugeuse de 1,5 ml qui contient 500 L de 1x PBS. Le tube doit rester sur la glace jusqu'à ce que tous les ovaires soient recueillis.
  7. Retirez le 1x PBS et placez 0,5 ml de solution fixe (4% de formaldéhyde) dans le tube. Placer le tube sur le diteur pendant 10 min.
  8. Retirez la solution de fixation du tube et jetez-la dans un contenant de déchets approprié. Utilisez 1 ml de 1x PBT (1x PBS complété avec 0,4% Triton™ X-100) pour laver les ovaires 3x pendant 15 min.
  9. Jetez le lavage PBT final et ajoutez 1 mL de PBTG (0,2 % d'albumine bovine de sérum, 5 % de sérum de chèvre normal en 1x PBT) pour empêcher la liaison non spécifique.
    REMARQUE: Cette étape pourrait être ignorée pour la coloration DAPI, mais il est essentiel pour la coloration des anticorps. La coloration d'immunohistochimie détaillée peut être trouvée dans Jia et autres24.
  10. Placer 150 oL de DAPI (10 g/mL) dans le tube pendant 10 à 15 minutes de noix. Jeter le DAPI et laver les ovaires 1x pendant 10 min en utilisant 1 ml de 1x PBT. Retirer le PBT et laver 2x pendant 10 min à l'aide de 1x PBS.
  11. Enlever l'excès de PBS jusqu'à ce qu'environ 300 L de PBS restent dans le tube avec les ovaires. Pipet les ovaires de haut en bas plusieurs fois à l'aide d'une pipette de 200 l, afin de libérer les chambres d'oeufs.
  12. Faites tourner doucement le tube et retirez soigneusement autant de solution 1x PBS que possible sans enlever les ovaires. Placer 120 oL de solution de montage (1 g de gallate n-propyl, 5 ml de 10X PBS, 40 ml de glycérol et 5 ml de dH2O) dans le tube.
    REMARQUE : La solution de montage est collante, il est donc difficile de transférer exactement 120 L de solution de montage dans un tube. Pour atténuer ce problème, une pointe de pipette de 1 000 l peut être utilisée pour ajouter trois gouttes de solution de montage dans le tube.
  13. Retirez environ 0,33 mm d'une pointe de pipette de 200 l et utilisez la pointe de pipette nouvellement coupée pour placer la solution de montage sur une lame de verre au microscope.
  14. Placez délicatement le verre de couverture sur la solution de montage et scellez les bords de la glissière de couverture avec le vernis à ongles transparent.
    REMARQUE : Sceller les bords du verre de couverture est nécessaire pour empêcher les chambres d'oeuf s'écouler à l'intérieur de la solution de montage en prenant des images confocales.
  15. Acquérir des images avec un microscope confocal en utilisant les paramètres suivants: objectif de l'objectif - grossissement 10x; ouverture numérique 0,8; Longueur d'onde des émissions de DAPI 410 à 513 nm.

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Representative Results

L'utilisation de la procédure mentionnée à l'étape 1 à l'aide du portail PRECOG, les scores Z de NOTCH2, NOTCH3et MAML1 dans le cancer de l'ovaire ont été obtenus (1,3, 2,32, 1,62, respectivement). Les valeurs négatives de Z-u2012score indiquent la faible survie globale des patients présentant des niveaux d'expression élevés des trois gènes. À l'aide du formatage conditionnel du logiciel de tableur, les valeurs de Z-u2012score sont affichées dans un graphique à barres colorés dans la figure 1.

La base de données CSIOVDB a été utilisée pour confirmer les résultats. Les instructions de l'étape 2, NOTCH2, NOTCH3et MAML1 ont été saisies de façon séquentielle dans la zone de recherche de la base de données CSIOVDB, et les données de survie des patients situées sous l'onglet Survie ont été récupérées. En plus des données globales de survie, CSIOVDB fournit la survie sans maladie. CSIOVDB sépare davantage les patients pour présenter les données de survie basées sur Le Q1 vs Q4 (quartile inférieur par rapport au quartile supérieur) des niveaux d'expression génique. Conformément aux résultats antérieurs, l'expression élevée de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 est en corrélation avec une faible survie globale et une survie sans maladie (Figure 2A,B). Pendant ce temps, l'onglet Paramètres clinico-pathologiques de CSIOVDB fournit également une comparaison des niveaux d'expression des gènes entre les différents stades, grades et réponses cliniques du cancer de l'ovaire avec les tests Mann-Whitney. Les résultats montrent que des niveaux d'expression plus élevés de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont associés à des stades avancés de cancer de l'ovaire (Figure 2C).

Puisque NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont critiques pour la survie globale du patient, les niveaux d'expression génique dans les tumeurs ovariennes et les lignées de cellules cancéreuses ont été étudiés plus loin. Les données d'expression de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans les tissus ovariens normaux et tumoraux ont été téléchargées à partir de la plate-forme U133A en utilisant les instructions de l'étape 3 pour GENT. Les scientifiques peuvent traiter les données téléchargées en fonction de leur propre objectif de recherche. Ici, nous avons utilisé les données pour produire la boîte et les parcelles de moustaches en utilisant GraphPad Prism (version 8). D'autres tests de permutation ont suggéré que NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont fortement exprimés dans les tissus tumoraux (Figure 3A). Ensuite, les données d'expression de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans les lignées cellulaires du cancer de l'ovaire ont été téléchargées selon l'étape 4 du protocole, à l'aide de CCLE. Les niveaux d'expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses sont indiqués par la boîte et les parcelles de moustaches (figure 3B). Même si les niveaux d'expression de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont élevés dans les lignées de cellules cancéreuses, les conclusions ne peuvent pas être tirées en raison de l'absence de contrôles normaux de la lignée cellulaire dans la base de données CCLE. Cependant, les scientifiques peuvent identifier l'origine des lignées cellulaires cancéreuses, et comparer les niveaux d'expression basés sur différentes catégories, stades, et d'autres paramètres clinicopathologiques.

Une fois que l'importance de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans le cancer de l'ovaire ont été confirmées, le cBioPortal a été utilisé pour étudier leur réseau de signaux associé. À l'aide de l'étape du protocole 5, Ovary/Fallopian Tube a été sélectionné pour Select Studies, puis l'ensemble de données Ovarian Serous Cystadenocarcinoma (TCGA, Nature 2011) a été choisi pour l'analyse. Pour la section étiquetée Select Genomic Profiles, l'arnar expression a été sélectionnée, et enfin son profil nrna expression Z-scores (tous les gènes). Pour la section Sélectionner le patient/l'ensemble de cas, l'option Échantillons avec données d'ARNm (microarray agilent) (489) a été choisie à partir du menu déroulant. À la fin, les gènes NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 ont été sélectionnés pour soumettre la requête. Sur la base des trois gènes de base, un réseau de signalisation a été créé pour fournir les 50 gènes voisins les plus fréquemment modifiés, qui sont également dans la même voie avec les taux de mutation les plus élevés (Figure 4).

Parce que la signalisation Notch est bien conservé entre les espèces, il a été étudié dans le cancer de l'ovaire Drosophila. La signalisation d'encoche a été précédemment rapportée pour réguler la prolifération de cellules follicules25,différenciation26,27, et la régulation de cycle cellulaire28,29. La surexpression de NICD seule n'a pas induit des tumeurs dans Drosophila (figure 5A), car l'épithélium des chambres d'oeufs de Drosophila est resté intact avec une seule couche. Cependant, la surexpression de NICD et de Mam ensemble a induit des tumeurs dans Drosophila (figure 5B), qui est démontrée par les couches épithéliales multiples et les cellules accumulées.

Figure 1
Figure 1 : L'expression de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans le cancer de l'ovaire est associée à une faible survie globale. Les scores De survie de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 chez les patients atteints de cancer de l'ovaire sont présentés. Une faible survie est indiquée par des valeurs négatives de Z-u2012score. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Des niveaux élevés de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans le cancer de l'ovaire sont associés à une survie globale médiocre, une survie pauvre sans maladie, et des stades avancés de cancer. La base de données sur les microréseaux CSIOVDB fournit à Kaplan-Meier des parcelles de survie globales et sans maladie de NOTCH2, NOTCH3et MAML1 chez les patients atteints de cancer de l'ovaire, ainsi que des niveaux d'expression génique à différents stades du cancer. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont fortement exprimés dans les tumeurs ovariennes et les lignées de cellules cancéreuses. Les valeurs De P sont indiquées pour comparer l'expression de gène dans les ovaires normaux et les tumeurs ovariennes correspondantes. (Abbreviations: Ovary-N - tissus ovaires normaux; Ovary-C - tissus du cancer de l'ovaire). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Les gènes NOTCH2/NOTCH3/ MAML1 et leur réseau de signalisation associé aux 50 gènes voisins les plus fréquemment modifiés. Le réseau de signalisation est codé en couleur. Les gènes intrants sont indiqués par des nœuds de graines avec une bordure épaisse. Chaque gène est représenté par un cercle rouge, et l'intensité de couleur du cercle rouge reflète sa fréquence de mutation. Des gènes sont reliés par des lignes de couleur différente. Les lignées brunes signifient « Dans la même composante », indiquant la participation à la même composante biologique. Les lignes bleues signifient « Réagit avec », indiquant des réactions de gène. Les lignes vertes signifient « changement d'état », suggérant qu'un gène pourrait causer un changement d'état d'un autre gène. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : LE NICD et la mam dans Drosophila induisaient également des tumeurs ovariennes. R. La surexpression de nicD seule n'induit pas la formation de tumeur dans Drosophila. B. La surexpression de NICD et de mam induise ensemble des tumeurs dans Drosophila. Barre d'échelle de 50 m S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Comme il existe d'innombrables approches et méthodes pour l'utilisation de la bioinformatique, il existe de nombreuses bases de données disponibles en ligne pour le grand public. Une abondance d'informations peut être extraite de chacune de ces bases de données, mais certaines sont les mieux adaptées à des fins particulières, telles que l'évaluation de la survie des patients en fonction de certaines entrées. Des analyses systématiques des données récupérées à partir de différentes bases de données individuelles peuvent produire de manière convaincante des résultats scientifiques importants.

L'analyse actuelle se concentre sur le rôle de la signalisation Notch dans le cancer de l'ovaire par l'utilisation d'approches bioinformatiques. Par exemple, l'analyse Meta-Z sur la base de données du portail PRECOG a été utilisée pour obtenir des scores Z qui indiquent les résultats de survie des patients dans les études cliniques sur le cancer. CSIOVDB est une autre base de données de méta-analyse qui a été utilisée pour étudier les résultats de survie des patients atteints de cancer de l'ovaire. Les données de CSIOVDB ont validé avec succès les résultats du portail PRECOG que NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont essentiels pour la survie globale du patient. Plus tard, les applications des bases de données GENT et CCLE ont en outre démontré que NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 sont fortement exprimés dans les tumeurs ovariennes et les lignées cellulaires cancéreuses. La combinaison de ces bases de données a systématiquement révélé les rôles importants de NOTCH2, NOTCH3, et MAML1 dans le cancer de l'ovaire. Cette utilisation de méthodes de bioinformatique a fourni un moyen efficace de faire de la recherche sur le cancer de façon rentable et montre comment elle peut produire des résultats importants pour de futures applications expérimentales et cliniques.

La bioinformatique permet au public d'accéder aux résultats de milliers d'expériences à la fois. L'information provenant des bases de données publiques fournit un moyen rentable et efficace d'établir une conception expérimentale avant d'effectuer des expériences. En outre, il est important de noter que les données accessibles au public peuvent être dispersées dans les publications et peuvent fournir des résultats contradictoires, voire contradictoires, ce qui nécessite des méta-analyses à effectuer par des approches bioinformatiques. Les scientifiques peuvent concevoir et réaliser des expériences à partir des données trouvées grâce à de grandes bases de données bioinformatiques pour valider des hypothèses scientifiques spécifiques. Les résultats de l'expérience Drosophila ont confirmé les résultats des bases de données bioinformatiques et ont soutenu l'idée que les composants de la voie Notch devraient continuer à être étudiés en tant que cibles thérapeutiques potentielles de médicaments. La validation réussie des résultats de la bioinformatique par l'expérimentation suggère également l'importance des approches bioinformatiques pour les découvertes scientifiques.

Il peut y avoir quelques limites de la bioinformatique. Tout d'abord, certains sites Web/outils peuvent ne pas mettre à jour leurs constatations en raison des efforts de temps ou des coûts associés à la maintenance. Deuxièmement, certains sites Web/outils ne constamment mettre à jour, mais la mise à jour avec des entrées supplémentaires pourrait modifier les résultats précédemment obtenus. Troisièmement, les développeurs de certains sites Web/outils réservent des droits d'auteur et restreignent l'utilisation de leur contenu. Quatrièmement, les analyses ou algorithmes de certains sites Web/outils peuvent ne pas toujours être exacts.

Pour surmonter ces limitations, certaines étapes ou modifications et dépannage pour de meilleures applications futures sont suggérés. Premièrement, certains sites Web/outils permettent aux chercheurs de charger manuellement de nouvelles données aux fins d'analyse. Si ce n'est pas le cas, les chercheurs peuvent télécharger et analyser eux-mêmes les données les plus récentes. Deuxièmement, les chercheurs doivent faire leurs analyses à plusieurs reprises et tenir des registres des dates. Si les résultats changent considérablement, les chercheurs devront peut-être utiliser l'apport supplémentaire de données pour en déterminer les raisons. Troisièmement, les chercheurs peuvent trouver un autre site Web ou un outil pour exécuter leurs analyses afin d'éviter d'éventuels problèmes de droit d'auteur. Quatrièmement, les chercheurs peuvent obtenir d'autres sites Web/outils pour valider leurs résultats importants. S'il y a des problèmes avec les analyses ou les algorithmes, les chercheurs peuvent télécharger et réanalyser les données pour corriger les erreurs ou utiliser d'autres sites Web/outils avec les paramètres appropriés.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par Start-Up Funding, College of Science and Mathematics Research Grant, Summer Research Session Award et Research Seed Funding Award de la Georgia Southern University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306 1:1000 Dilution
PBS, Phosphate Buffered Saline, 10X Powder, pH 7.4 ThermoFisher FLBP6651 Dissolved with ddH2O to make 1X PBS
Goat serum Gibco 16210064 Serum
Embryo dish Electron Microscopy Sciences 70543-45 Dissection Dish
Nutating mixers Fisherbrand 88861041 Nutator
tj-Gal4, Gal80ts/ CyO; UAS-NICD-GFP/ TM6B Dr. Wu-Min Deng at Florida State University N/A Fly stock
w*; UAS-mam.A Bloomington Drosophila Stock Center #27743 Fly stock
w[1118] Bloomington Drosophila Stock Center #5905 Fly stock
The PRECOG portal Stanford University precog.stanford.edu Publicly accessible database of cancer expression datasets
CSIOVDB Cancer Science Institute of Singapore csibio.nus.edu.sg/CSIOVDB/CSIOVDB.html Microarray database used to study ovarian cancer
The Gene Expression across Normal and Tumor tissue (GENT) Portal Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB) medical–genome.kribb.re.kr/GENT Publicly accessible database of gene expression data across diverse tissues, divided into tumor and normal tissues.
Broad Institute Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE) Broad Institute and The Novartis Institutes for BioMedical Research portals.broadinstitute.org/ccle Provides genomic profiles and mutations of human cancer cell lines
cBioPortal Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) cioportal.org Portal that allows researchers to search for genetic alterations and signaling networks
Zeiss 710 Inverted confocal microscope Carl Zeiss ID #M 210491 Examination and image collection of fluorescently labeled specimens

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