淋巴结冷冻科肿瘤细胞粘附的定量

Cancer Research

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Summary

在这里,我们描述了一种简单而廉价的方法,它允许将粘结肿瘤细胞量化到淋巴结(LN)冷冻片。LN粘附肿瘤细胞通过光显微镜很容易识别,并通过荧光法进行确认,提供粘附指数,揭示肿瘤细胞结合亲和力与LN帕伦奇马。

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Jandrey, E. H. F., Kuroki, M. A., Camargo, A. A., Costa, E. T. Quantification of Tumor Cell Adhesion in Lymph Node Cryosections. J. Vis. Exp. (156), e60531, doi:10.3791/60531 (2020).

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Abstract

肿瘤排出淋巴结(LUN)不仅仅是肿瘤产生的废物的过滤器。它们是不同类型的癌症患者中传播肿瘤细胞临时居住的最常见区域部位之一。这些LN驻留肿瘤细胞的检测是与预后不良和辅助治疗决策相关的重要生物标志物。最近的小鼠模型表明,LN驻留肿瘤细胞可能是远距离转移的恶性细胞的重要来源。量化肿瘤细胞对LN帕伦奇马的粘附性的能力是实验研究的一个关键指标,该指标侧重于识别与淋巴/转移传播相关的基因或信号通路。由于 LUN 是复杂的 3D 结构,根据截面的不同,在组织部分中具有各种外观和组合物,因此其基质很难以完全控制的方式在体外实验复制。在这里,我们描述了一种简单而廉价的方法,它允许将粘结肿瘤细胞量化到LN冷冻片。使用同一LN的串行部分,我们调整由Brodt开发的经典方法,使用非放射性标签,并直接计算每个LN表面积的粘附肿瘤细胞的数量。LN粘附肿瘤细胞通过光显微镜很容易识别,并通过荧光法进行确认,给出一个粘附指数,显示细胞结合亲和力到LN帕伦奇马,这是分子改变的分子改变的亲基结合与其相关的LN-ligand。

Introduction

癌症转移是治疗失败的主要原因,也是癌症的主要威胁生命方面。正如130年前所假设的,当传播的肿瘤细胞(DTC,"种子")的精英获得特定的生物能力,使他们能够避开原址,并在遥远的部位("土壤")1建立恶性生长时,转移传播的结果。最近,关于"种子和土壤"关系出现了几个新的概念,如诱导预转移利基(概念化为"种子"茁壮成长所需的"肥沃土壤"),由DTC自行播种原发性肿瘤,二级器官的"种子"休眠和转移2的平行进展模型。

对于大多数固体恶性肿瘤,DTC可以驻留并检测在许多间质器官,如骨髓和淋巴结(LUN)的患者有或没有临床转移的证据。由于肿瘤排出的LN是DTC区域传播的第一个位置,LN状态是一个重要的预后指标,并且通常与辅助治疗决策3相关。对于一些肿瘤类型,LN状态和坏结局之间的相关性很强,包括头颈部4、5、乳腺6、前列腺7、8、9、结肠直肠10、11和甲状腺癌12。

LAN 是淋巴系统的小卵器官,覆盖有视网膜细胞,并封闭着淋巴血管。这些器官是绝对必要的免疫系统的功能13。LN作为免疫循环细胞的吸引平台,将淋巴细胞和抗原呈现细胞结合在一起14。然而,LN也吸引循环肿瘤细胞。几十年来,LUN被描绘成转移性肿瘤细胞的被动运输路线。然而,最近的研究表明,肿瘤细胞也可以通过化学战术(化学基因)和/或haptoin(细胞外基质元素)线索引导到LN,这些线索由淋巴内皮15分泌。例如,肿瘤细胞中CCR7受体的过度表达有助于转移性黑色素瘤细胞对肿瘤排泄的16的引导。此外,细胞外LN蛋白为循环肿瘤细胞的招募和存活提供了粘合支架17。事实上,肿瘤排泄的LN为DTC的播种提供了肥沃的土壤,通过特定的LN微环境信号18,DTC可以维持在增殖或休眠状态。这些LN驻留DTC的最终命运是有争议的;一些工作表明,这些细胞是转移性进展19的被动指标,而另一些则提出,它们更有可能是抵抗的创始者(通过自种原位)和/或作为转移的细胞储存库(传播"种子"三级癌症生长)20,21。最近,使用临床前模型,已经证明,这些LN驻DTC的一小部分积极侵入血管,进入血液循环和殖民肺21。

考虑到在LN中癌细胞的存在是癌症攻击性和侵入性的标志,在这项研究中,我们优化了Brodt22开发的经典方法,定量测量肿瘤细胞在体外对LUN的附着力。使用基于荧光的测定,使我们能够开发一种低成本、快速、敏感和环保(非放射性)协议,用于检测肿瘤细胞和LN冷冻细胞之间的胶粘剂变化。利用表达不同水平的NDRG4基因表达和大鼠LN冷冻节的MCF-7乳腺癌细胞,证明该方案在体外肿瘤细胞粘附与LN转移之间具有良好的相关性,在乳腺癌患者中观察到的LN转移24。

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Protocol

从因宫颈脱位而牺牲的健康成年威斯塔大鼠的新鲜尸体中找到了LN。我们遵循了NIH《实验室动物疼痛和痛苦指南》,所有程序都通过了西里奥-利巴尼亚医院研究与教育研究所伦理委员会和动物研究(CEUA P 2016-04)。

注:所有新鲜冷冻组织均被视为生物危害,应采取适当的生物安全预防措施处理。

1. 淋巴切除术和冷冻切除术

  1. 将成年威斯塔大鼠(180-220克)的新鲜尸体(180-220克)放在室温下干净的解剖板上。
    注:安乐死后,必须收集长达 30 分钟的 LUN。
  2. 用70%的等丙醇喷洒大鼠尸体,并使用灭菌仪器进行LN收获。
  3. 提起腹部皮肤,借助钳子,用中腔切开腔,而不会损坏底层组织,暴露腹部内脏。拉出肠道,胸腔和腹部 LUN 变得可见 (图1)。
  4. 小心地用钝头剪刀从每只大鼠中去除LUN,以避免伤害后面上流的动脉。
    注:根据切除的淋巴结的位置,有必要清洁粘附在它上的其他组织,如淋巴组织。
  5. 将 LUN 收获到含有 5 mL 无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 的 15 mL 锥形管中。
  6. 正确丢弃大鼠尸体。
  7. 从 PBS 中取出新鲜的 LUN,在干滤纸上滚动并干燥节点。将其放入小培养皿中,为冷冻组织标本(O.C.T.)添加嵌入溶液2分钟。
  8. 将 LN 面向下移至低温底部的所需位置,只需足够的 O.C.T 来覆盖它。避免组织附近的气泡。截面是低温的底部。
  9. 立即将冷冻在带干冰的泡沫塑料冷却器中冷冻。当仍有少量未冷冻的 O.C.T.(±20-35 s)时,将样品转移到铝箔中,并将其放入带干冰的冷却器中,同时继续冻结其他样品。最后,将所有样品储存在-80°C,直到切片。
  10. 将截面的LN将截面厚度调整到5-8微米。将哭断面转移到显微镜幻灯片上。
    注:在切片前,从-80°C冷冻箱中取出冷冻样品,使其与-22°C低温微体室的温度平衡约30分钟。

2. 带荧光染料的蜂窝标签

注:荧光染料在细胞生物学中广泛使用。我们更喜欢使用长链旋钮卡博卡亚宁标签(DiI(C18),激励549nm,排放565nm,因为它们明亮、稳定,可直接添加到培养基中,不影响细胞活力或细胞粘合特性25,26。

  1. 分离细胞在理想条件下生长(即,在完全培养基中),并在无血清培养基中重新悬浮,密度为106细胞/mL。
  2. 在15 mL锥形管中加入1 mL细胞悬浮液(106个细胞),并贴上Dil(C18)(2微克/mL)标签,在37°C下10分钟。
    注:5分钟后,轻轻搅拌管,避免细胞沉淀和沉积细胞的染色。密度越大,均匀染色的孵育时间就越长。细胞染色的最佳孵育时间随细胞系的不同而变化。使用传统的FL2流式细胞检测通道(2A),可以更好地量化。
  3. 将标记的悬架管在 300 x g下离心 4 分钟。
  4. 去除上清液,在10mL无血清培养基中洗涤两次。恢复细胞作为红色颗粒。在无血清培养基中,用0.1%牛血清白蛋白(BSA)在106细胞/mL处重新悬浮细胞。

3. 预涂洗碗,使用聚-L-莱辛溶液或BSA作为播种控制(可选)

注:我们使用预涂有PLL的细胞培养皿作为正载荷控制表面,以确保不同实验组肿瘤细胞以相同数量播种,以及BSA涂层表面作为阴性对照。

  1. 在无菌条件下,要制备 PLL 或 BSA 涂层孔,将 300 μL 的 PLL(H2O 中的 0.1% w/v)或 BSA(在 H2O 中,在 24 孔中以 2.5% 的 w/v 稀释)直接添加到 24 孔板中,并在 4°C 下孵育过夜。
  2. 通过吸气去除溶液,用无菌 PBS 轻轻冲洗表面,并在组织培养罩室温下在室温下对板进行空气干燥,然后再进行细胞播种。
    注:PLL 或 BSA 的最终体积必须根据不同孔板的面积进行调整。

4. 在LN冷冻科或PLL/BSA涂层井上播种荧光标记肿瘤细胞

注:作为实验控制,我们使用 (1) 细胞培养皿预涂有 PLL 或 BSA 和 (2) 每个实验相同 LN 的连续部分(参见图 2D中的此详细信息),其中后者将最小化每个 LN 部分细胞外基质 (ECM) 成分的区域变化,这反过来又可以决定细胞粘附率。对于以下肿瘤细胞粘附测定,选择高质量和顺序的LN冷冻切片。

  1. 用PBS轻轻清洗两次冷冻部分,并在室温下用PBS补充水合15分钟。
  2. 在37°C下用2.5%BSA阻断未特异性附着力30分钟。使用免疫性化学洗脸室和拉米纳摇篮,以确保整个O.C.T在洗涤和孵育过程中被移除。
  3. 在干纸巾上排空多余的 BSA,用棉签擦干 LN 部分的轮廓,并使用 PAP 笔包围这些部分。
  4. 对于肿瘤细胞粘附测定,在24孔PLL涂层板中,在每个包围的LN部分或良好处添加100μL细胞悬浮液(从步骤2.4开始),并将其置于传统细胞培养培养箱中37°C的加湿室机架中1-2小时。
    注:细胞悬浮液的最终体积需要根据不同包围的局域网的面积进行调整。
  5. 用PBS轻轻冲洗非粘附细胞四次。在室温下,将剩余的附着荧光细胞在PBS中用3.7%甲醛修复15分钟。

5. 胶粘剂指数的手动量化

注:粘合指数(即肿瘤细胞/LN mm2)是使用10倍目标并手动计数肿瘤细胞数量实现的,通过光显微镜很容易识别,并通过荧光显微镜(图2D)确认),每个淋巴结区域的几个独立领域(使用国家卫生研究院的ImageJ/FIJI软件获得)。

  1. 使用具有10倍目标的荧光显微镜,在两个通道中拍摄单独的TIFF图像,对应于明亮的和红色的荧光场(2D)。系统地命名和保存这些图像。
  2. 启动 ImageJ/FIJI,打开图像并设置比例。有必要使用校准刻度(例如,微尺 1 mm)(图 2C)。
  3. 打开微量标尺(或阶段千分尺)的照片,选择直线工具并绘制一条定义已知距离的直线。
  4. 在"分析"菜单中,选择"设置比例"。"距离"(以像素为单位)将根据步骤 5.3 中绘制的线的长度(以像素为单位)填充。已知距离将用长度单位字段中的实际距离(在本例中,以毫米为单位)和长度单位(在本例中以毫米为单位)填充。
  5. 单击"全局"(此校准适用于此 ImageJ/FIJI 会话中打开的所有图像),然后按"确定"。
  6. 淋巴节点区域量化:选择魔杖工具,通过双击,打开魔杖工具设置。将模式设置为8 连接。在照片中单击并设置容差,直到选择照片中的所有淋巴结,然后按"确定"。要测量区域,请打开"分析" |测量 (CTRL = M)。区域以前面设置的单位表示。
  7. 肿瘤细胞定量:在FIJI软件中打开光显微镜/荧光图像。选择插件 |分析 |细胞计数器 |细胞计数器.单击要量化的照片,然后按单元格计数器窗口中的"初始化"按钮。选择计数器类型 (1-8),然后单击照片中的单元格。要初始化下一张照片,请按单元格计数器窗口中的"重置"按钮,打开新照片并重复所有步骤。
    注:LN粘附指数表示为每个LN覆盖区域粘附性肿瘤细胞的数量(细胞/毫米2)。

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Representative Results

通过评估表达不同级别的NDRG4基因(称为NDRG4阳性和NDRG4阴性细胞)的红色荧光MCF-7乳腺癌细胞的LN粘合电电位,通过检查大鼠LN粘附肿瘤细胞的含量,在细胞表面24处的β1-integrin聚类的负调制器,来说明该测定。此协议的原始映像示例如图2所示。如图2B所示,附着细胞的形态呈形四舍五入,并且在整个LN中异质分布。NDRG4 负 MCF-7 细胞(877 × 124 细胞/mmLN)的 LN 粘合指数比相应的 NDRG4 阳性 MCF-7 细胞(LN 的 412 × 76 细胞/mm2,p = 0.03)高 2 倍(图 2D)。

Figure 1
图1:分步分离大鼠肠子LN。A) 肠内中线皮肤切口:安乐死大鼠被置于背端再液位置,在中腹皮肤上进行30-50 mm中线切口,露出腹部内脏(肝、小肠、胆囊和膀胱)。(B) 小肠从腹腔中轻轻拉出,露出嵌在内脏脂肪组织中的大鼠肠子。(C) 切除后解剖的胃肠道的总解剖结构。(D) 从连接的脂肪组织中切除淋巴淋巴结。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:肿瘤细胞粘附到大鼠淋巴结部分的代表性结果。A) 说明性流式细胞分析,显示与非标记细胞(下象限)相比 DiI(C18)标记的强度(上象限)。(B) 洗涤步骤后附着在LN部分的红色标记MCF-7细胞的光(左)和荧光(右)显微镜图像。(C) 粘附测定后,使用校准量程手动量化盖玻片上的附着细胞,以估计淋巴结面积和荧光显微镜以直接计算细胞。(D) NDRG4敲除MCF-7乳腺肿瘤细胞增加淋巴结粘附。红色荧光MCF-7细胞(NDRG4阳性或NDRG4阴性DiIC18标记细胞)在5μm大鼠淋巴结部分播种30分钟后的代表性图像。LN 粘合指数表示为每个 LN 覆盖区域粘附性肿瘤细胞的数量(细胞/mm2)。刻度条 = 200 μm.\p < 0.05。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

癌细胞淋巴系统传播需要各种复杂的细胞驱动事件。它们与原发性肿瘤的细胞分离和细胞外基质 (ECM) 架构的重塑一起启动,并通过进入哨点 LUN 的淋巴淋巴细胞进行持续化疗和主动迁移。如果癌细胞在局域网中粘附并存活,它们很容易扩散到其他辅助器官。在这里,我们描述了一种快速和低成本地分析肿瘤细胞和冷冻LUN之间特定粘合剂相互作用的简单方法。

在结构上,LAN 是 ECM 纤维的密集和广泛网络的离散海绵状质量,通常被称为"视网膜纤维",作为细胞迁移的路径,并作为在 LN parenchyma27内快速传递可溶性因子(抗原和/或化学因子)的管道。测定的冷冻LUN的保存的视网膜纤维支持haptoad信号,并为肿瘤细胞在体外粘附提供支架。这些纤维主要由结构蛋白组成,如胶原蛋白I和III,以及二次ECM元素,如纤维素、泰那辛、拉米宁、体外素和硫酸肝蛋白28、29。在细胞粘附后,大多数LN衍生的ECM因子提供分子线索,通过一元介导信号确定细胞存活(增殖或休眠状态)或细胞死亡(阿诺基斯)。

在这里,我们演示了使用异种基因大鼠LAN和人类乳腺肿瘤细胞系的测定。或者,可以使用其他 LUN 源。大鼠、小鼠或人类LUN的组成包括作为原生哺乳动物ECM一部分的相同结构和功能蛋白,所有蛋白质都保留了细胞粘附所需的类似结合位点23。重要的是,唯一的关键步骤是在每个实验中使用同一LN的连续切片,以尽量减少每个LN部分ECM成分的区域变化,这反过来又会决定细胞粘附率。

测定的缺点是,它不重述淋巴传播的第一步,只反映肿瘤细胞对LUN的粘合强度。例如,在LN部分(如MCF-7(图2)或T47D肿瘤细胞系24)上播种攻击性较低的乳腺肿瘤细胞,在体外对LN部分有很强的附着力,其水平与高腐蚀性MDA-MB-231肿瘤细胞(未显示的数据)相似。然而,众所周知,正交MCF-7异种移植肿瘤不能到达哨点LUN,而MDA-MB-231肿瘤自发转移给他们30。显然,MCF-7细胞LN转移形成的主要瓶颈发生在到达并粘附在LN之前的步骤,如MCF-7细胞无法有效地从原发肿瘤中逃逸。因此,本文描述的测定强度不是与LN转移电位建立直接相关性,而是一种在更逼真的ECM体外量化肿瘤细胞粘合特性的简单方法。通过使用冷冻组织,冷冻节代表LAN在结构和组成方面的自然复杂性,不可能使用合成技术,特别是那些使用纯化ECM蛋白的技术重新创建。

该方法的其他限制是 (1) 它不允许评估 LN 分泌的因子的化学分析电位,并且 (2) 它不告知细胞对 LN 部分的特异性粘附是否是与 ECM 蛋白质、细胞或 LN 部分中存在的任何其他结构的优待结合的结果。然而,我们认为,这种方法可能是相关的,必须认真考虑特定的申请,但超出了本特定手稿的范围。例如,在最近的一项研究中,我们确定N-Myc下游调控基因4(NDGR4)是乳腺肿瘤LN转移的机械生物标志物24。从机制上讲,缺乏NDRG4表达的肿瘤细胞通过倾向于在乳腺肿瘤细胞前沿组装β1-integrin受体来增加对LNs冷冻节的附着力。此外,使用额外的控制,如涂有纯化ECM蛋白的菜肴,我们发现对LN部分的微分粘附是选择性与体外内蛋白24关联的结果。

最后,值得注意的是,这种方法并不限于LNs部分,可以设置以评估细胞粘附到不同的活器官,如脾脏或肺的冷冻节。转移性细胞在体外不同器官的冷冻部分表现出器官和粘合强度的测量,可能是预测器官特异性癌症传播的有用手段。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

我们感谢罗莎娜·德利马·帕加诺博士和阿纳·卡罗莱纳·皮涅罗·坎波斯博士的技术援助。这项工作得到了来自:FAPESP - 圣保罗研究基金会(2016/07463-4)和路德维希癌症研究所(LICR)的资助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL Conical Tubes Corning 352096
2-propanol Merck 109634
Benchtop Laminar Flow Esco Cell Culture
Bin for Disc Leica 14020139126
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A9647-100
Cell culture flask T-25 cm2 Corning 430372
Cryostat Leica CM1860 UV
Cryostat-Brush with magnet Leica 14018340426
DiIC18 Cell Traker Dye Molecular Probes V-22885
Fetal Bovine Serum (FBS) Life Technologies 12657-029
Fluorescence microscope Nikon Eclipse 80
Forma Series II CO2 incubator Thermo Scientific
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
High Profile Disposable Razor Leica 14035838926
Incubation Cube (IHC) KASVI K560030
Inverted microscope Olympus CKX31
Isofluran 100 mL Cristália
Liquid Bloquer Super Pap Pen Abcam, Life Science Reagents ab2601
Optimal Cutting Temperature "OCT" compound Sakura 4583
Phosphate-buffered Saline (PBS) Life Technologies 70011-044
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P8920
RPMI Gibco 31800-022
Serological Pipettes 1 mL Jet Biofil GSP010001
Serological Pipettes 10 mL Jet Biofil GSP010010
Serological Pipettes 2 mL Jet Biofil GSP010002
Serological Pipettes 5 mL Jet Biofil GSP010005
Serological Pipettes 50 mL Jet Biofil GSP010050
Serological Pipettor Easypet 3 Eppendorf
Tissue-Tek cryomold Sakura 4557
Trypan Blue 0.4% Invitrogen T10282
Trypsin Instituto Adolfo Lutz ATV

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References

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