माउस से सेरेब्रल पेरिसाइट्स को अलग करने के लिए एक उच्च आउटपुट विधि

Biology
 

Summary

हम मूत्र सेरेब्रल पेरिसाइट्स की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एंटीबायोटिक-मुक्त संवर्धन उन्मुख पेरिसाइट निष्कर्षण के आधार पर, यह प्रोटोकॉल उच्च शुद्धता और उच्च उपज प्रदान करने वाले इन विट्रो अध्ययनों के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, इस प्रकार उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या कम हो जाती है।

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Mehra, A., Dehouck, L., Vandenhaute, E., Fatar, M., Fenart, L., Gosselet, F. A High Output Method to Isolate Cerebral Pericytes from Mouse. J. Vis. Exp. (155), e60588, doi:10.3791/60588 (2020).

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Abstract

हाल के वर्षों में, सेरेब्रल पेरिसाइट्स संवहनी जीव विज्ञान और विकृति में व्यापक अनुसंधान का केंद्र बन गए हैं। रक्त मस्तिष्क बाधा गठन और शरीर विज्ञान में pericytes के महत्व को अब प्रदर्शन किया है, लेकिन इसके आणविक आधार काफी हद तक अज्ञात रहता है । चूंकि न्यूरोलॉजिकल विकारों में सेरेब्रल पेरिसाइट्स की रोगविज्ञानी भूमिका पेचीदा है और बहुत महत्वपूर्ण है, इन विट्रो मॉडल न केवल पर्याप्त रूप से उपयुक्त हैं बल्कि इन अध्ययनों के लिए विभिन्न तकनीकों को शामिल करने में भी सक्षम हैं। सेरेब्रल पेरिसाइट्स की निकासी के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में कई तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, हालांकि उच्च उत्पादन के साथ एक एंटीबायोटिक मुक्त प्रोटोकॉल वांछनीय है। सबसे महत्वपूर्ण बात, एक विधि है कि निष्कर्षण प्रति उत्पादन में वृद्धि हुई है और अधिक जानवरों के उपयोग को कम कर देता है ।

यहां, हम पर्याप्त रूप से उच्च उत्पादन के साथ मस्तिष्क पेरिसाइट्स निकालने के लिए एक सरल और कुशल विधि का प्रस्ताव करते हैं। माउस मस्तिष्क ऊतक समरूप ऊतक मलबे और माइक्रोवैस्कुलर गोली के पृथक्करण के लिए बीएसए-dextran समाधान के साथ मिलाया जाता है। हम एक माइक्रोवेसल रिच फिल्ट्रेट प्राप्त करने के लिए निस्पंदन के बाद तीन कदम जुदाई का प्रस्ताव करते हैं । इस विधि के साथ, 10 चूहों से प्राप्त माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों की मात्रा 6-अच्छी प्लेट के 9 कुओं (9.6 सेमी2 प्रत्येक) को बीज करने के लिए पर्याप्त है। सबसे दिलचस्प इस प्रोटोकॉल के साथ, उपयोगकर्ता 2 पैसेज 2 में 27 पेरिसाइट रिच वेल्स (9.6 सेमी2 प्रत्येक) प्राप्त कर सकता है। पेरिसाइट संस्कृतियों की शुद्धता शास्त्रीय पेरिसाइट मार्कर की अभिव्यक्ति के साथ पुष्टि की जाती है: NG2, PDGFR-और CD146। यह विधि पेरिसाइट्स पर शारीरिक और रोगविज्ञानी अध्ययनों के लिए एक कुशल और व्यवहार्य इन विट्रो उपकरण को दर्शाती है।

Introduction

सेरेब्रल पेरिसाइट्स न्यूरोवैस्कुलर यूनिट (एनवीयू) का एक अनिवार्य घटक है, जिसमें रक्त मस्तिष्क बाधा (बीबीबी), ग्लियल कोशिकाओं, बाह्य मैट्रिक्स और न्यूरॉन्स की मस्तिष्क एंडोथेलियल कोशिकाओं के साथ एक कार्यात्मक इकाई शामिल है। पेरिसाइट्स केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) के विनियमित कामकाज में एक महत्वपूर्ण हिस्सा हैं क्योंकि वे आणविक और सेलुलर जानकारी के आदान-प्रदान के लिए इंटरफेस में से एक के रूप में काम करते हैं।

मस्तिष्क माइक्रोवेसके अदम्य पक्ष में सेरेब्रल पेरिसाइट्स एम्बेडेड होते हैं, और1 की स्थापना औरबीबीबी फिजियोलॉजी को बनाए रखने के लिए आवश्यक हैं। हाल के कई कार्यों में एंजियोजेनेसिस3 और पोत परिपक्वता4, एंडोथेलियल मॉर्फोजेनेसिस5 और अस्तित्व6और मस्तिष्क कोलेस्ट्रॉल चयापचय7को नियंत्रित करने में सेरेब्रल पेरिसाइट्स की भूमिका पर भी प्रकाश डाला गया है । महत्वपूर्ण बात यह है कि इनमें से किसी भी प्रक्रिया में डिस्रेगुलेशन न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारियों की एटिलॉजिकल पहचान है ।

दरअसल, पेरिकेट्स सामान्य बीबीबी कामकाज और कई न्यूरोलॉजिकल रोगों की प्रगति के खिलाफ इसकी सुरक्षा के लिए एक कार्यात्मक आवश्यकता है। शरीर विज्ञान और पेरिसाइट्स की हानि अल्जाइमर रोग8की प्रगति में आम भाजक हैं, सफेद पदार्थ शिथिलता के दौरान न्यूरोनल हानि9,मल्टीपल स्क्लेरोसिस10,सेप्टिक एंसेफेलोपैथी11,तीव्र चरण इस्कीमिक स्ट्रोक12 और अन्य न्यूरोलॉजिकल विकारों में। पेरिकेट्स ट्यूमर मेटास्टेसिस13में भी महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । दिलचस्प बात यह है कि न्यूरोलॉजिकल आघात और विकारों के बाद बचाव की भूमिका प्रदर्शित करने के लिए पेरिकेट्स को भी दिखाया गया है: मस्तिष्क में रेमिनेशन में1,इस्कीमिक स्ट्रोक, रीढ़ की हड्डी की चोट14 और एंजियोजेनेसिस15को बढ़ावा देना। न्यूरोलॉजिकल आघात और विकारों की रोगविज्ञानी अभिव्यक्ति को सुदृढ़ करने के लिए पेरिकेट्स की संवेदनशीलता उन्हें एक संभावित चिकित्सीय लक्ष्य16बनाती है ।

बीबीबी में पेरिसाइट्स के इन विट्रो अनुसंधान मॉडल व्यापक अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण उपकरण हैं। ये मॉडल बीबीबी और अधिक के कामकाजी मॉडलों का प्रतिनिधित्व करके अधिक विस्तृत अध्ययन के लिए एक मंच प्रदान करते हैं। उदाहरण के लिए, इन मॉडलों का उपयोग पेरिसाइट्स के भीतर और एनवीयू के अन्य सेल प्रकारों के बीच सेलुलर फिजियोलॉजी को समझने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, इन विट्रो मॉडल पेरिसाइट्स पर नई दवाओं और अणुओं के औषधीय प्रभाव का परीक्षण करने के लिए firsthand जांच उपकरण हैं। इन मॉडलों का उपयोग न्यूरोलॉजिकल विकारों के संबंध में पेरिसाइट्स की पैथोफिजियोलॉजिकल भूमिका को समझने के लिए भी किया जा सकता है। फिर भी, इन विट्रो मॉडल के विकास के लिए प्रायोगिक स्वतंत्रता को सक्षम करने के लिए उत्पादन में वृद्धि की आवश्यकता होती है। इन मॉडलों को आसान और त्वरित होना चाहिए, और उपयोग किए जाने वाले प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या को कम करना चाहिए। इसके अलावा, इस तरह के मॉडल को डबल और ट्रिपल सेल कल्चर मॉडल में विकसित करने की क्षमता वांछनीय है।

ऐसे कई प्रोटोकॉल तैयार किए गए हैं। टिग्जेस एट अल.17,चेन एट अल.18,थॉमसन एट अल19,यामासाकी एट अल.20,और क्राउच और डोएट्सच21 द्वारा प्रस्तावित प्रोटोकॉल सराहनीय दृष्टिकोण हैं जो अधिकांश आवश्यकताओं को पूरा करते हैं। इन तरीकों के सभी प्रभावी परिणाम उपज, लेकिन प्रयोगात्मक जानवरों की एक बड़ी संख्या पर निर्भरता इन प्रोटोकॉल के लिए एक आम भाजक रहता है । इसलिए, एक उच्च आउटपुट विधि विकसित करना अनिवार्य हो जाता है जो अधिकतम संभव दक्षता के साथ पेरिसाइट्स को अलग और शुद्ध कर सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक दूसरे मार्ग के बाद प्राप्त कोशिकाओं की शुद्धता कई pericytes मार्कर के साथ सत्यापित किया जाता है। हमने प्लेटलेट-व्युत्पन्न ग्रोथ फैक्टर रिसेप्टर-ए (PDGFR-a) की जांच की, जिसका उपयोग पेरिसाइट्स17के शास्त्रीय मार्कर के रूप में और एनजी 2 (न्यूरॉन-ग्लियल एंटीजेन 2) के लिए किया जाता है, जो पेरिसाइट मध्यस्थता संवर्कुलर मॉर्फोजेनेसिस22 और संवहनी23का मार्कर है। हमने भेदभाव 146 (सीडी 146) के समूह की भी जांच की, जिसे पेरिसाइट्स17,18में व्यक्त अणुओं में से एक के रूप में सूचित किया गया है।

यहां, हम चूहों (जंगली प्रकार या ट्रांसजेनिक्स) से प्राथमिक पेरिसाइट्स की निकासी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो उच्च उत्पादन के साथ उपरोक्त सभी आवश्यकताओं को पूरा करेगा। हम प्राथमिक मस्तिष्क पेरिसाइट्स के लिए प्रसार की एक एंटीबायोटिक और इम्यूनोफेनिंग मुफ्त चयन-आधारित विधि को नियोजित करते हैं, जो इन विट्रो अध्ययन ों के संचालन के लिए खुद को एक कुशल मॉडल साबित करेगा।

Protocol

पशु उपयोग और हैंडलिंग के लिए संस्थान के दिशा-निर्देशों के बाद सभी प्रयोग किए गए । फ्रांसीसी कानून के अनुसार, आर्टोइस विश्वविद्यालय में पशु सुविधा को स्थानीय अधिकारियों (संदर्भ: B62-498-5) द्वारा अनुमोदित किया गया है। यूरोपीय संघ के कानून (निर्देश 2010/63/EU) के अनुपालन में, सभी प्रक्रियाओं को स्थानीय पशु देखभाल और उपयोग समिति (Comité d'Ethique en Expérimentation Animale du Nord-Pas-De-Calais, संदर्भ: C2EA 75) और फ्रांसीसी अनुसंधान मंत्रालय (संदर्भ: 201509011541252) द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. समाधान की तैयारी

  1. वाशिंग बफर ए (डब्ल्यूबीए) के 500 मिली0 मीटर तैयार करें: हैंक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में 10 mM HEPES समाधान। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  2. एचबीएसएसएस में 10 एमएम हेप्स सॉल्यूशन के साथ वाशिंग बफर बी (डब्ल्यूबीबी): 0.1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 500 मीटर तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. कमरे के तापमान पर रात भर समाधान मिलाकर डब्ल्यूबीए में 30% dextran समाधान के 300 मीटर तैयार करें। उपयोग से पहले 30 मिन के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर समाधान को ऑटोक्लेव करें। ऑटोक्लेव करने के बाद, समाधान को कमरे के तापमान पर 2-3 घंटे के लिए आराम करें। समाधान को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. कोल्ड डीट्रान सॉल्यूशन में 01% बीएसए सॉल्यूशन का 100 मीटर तैयार करें। 3-4 मिन के लिए सख्ती से हिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  5. बेसल डीएमईएम मीडिया में 20% बछड़े सीरम, 2 मीटर ग्लूटामाइन, 50 माइक्रोन/एमएल जेंटामाइसिन, 1% विटामिन, 2% अमीनो एसिड बेसल मीडियम ईगल (बीएमई) को भंग करके पूर्ण Dulbecco का संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) संस्कृति मीडिया तैयार करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग करने से पहले 1 एनजी/एमएल बेसिक फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) जोड़ें।
  6. पेरिसाइट कल्चर बेसल मीडिया और स्टोर में पेरिसाइट ग्रोथ सप्लीमेंट (पेरिसाइट मीडिया के साथ प्रदान) और 20% भ्रूण बछड़ा सीरम (एफसीएस) जोड़कर पूर्ण पेरिसाइट मीडिया तैयार करें।

2. मस्तिष्क ऊतक वसूली और मेनिंग्स को हटाने

  1. स्थिरता के लिए, निष्कर्षण के हर बैच में समान उम्र और एक ही लिंग के चूहों का उपयोग करें। रोगजनक मुक्त पशु आश्रय का उपयोग करें और पानी के लिए विज्ञापन libitum का उपयोग प्रदान करते हैं। जानवरों की दक्षता और न्यूनतम उपयोग सुनिश्चित करने के लिए, ऊतक सामग्री के नुकसान से बचें।
  2. Euthanize C57BL/6J, 4-6 सप्ताह पुराना, पुरुष चूहों (Janvier प्रयोगशालाओं, Le Genest-सेंट-टापू, फ्रांस) ।
  3. जल्दी से बाँझ स्थितियों में मस्तिष्क के ऊतकों को उत्पादित करें, ऊतक को किसी भी नुकसान से बचें। ध्यान से ठंडे फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) के 40 मिली0 में ऊतक रखें।
  4. ठंडे पीबीएस में मस्तिष्क के ऊतकों को पेट्री डिश (100 मिमी x 15 मिमी) में स्थानांतरित करें।
  5. मस्तिष्क के ऊतकों को बाँझ सूखी लिंट-मुक्त पोंछपर रखें और घुमावदार टिप संदंश के साथ, सेरिबैलम, स्ट्रेटम और ऑक्सीपिटल नसों को हटा दें।
    1. एक कपास झाड़ू के साथ सभी दिखाई meninges निकालें। मस्तिष्क के ऊतकों को उल्टा रखें और जावक प्रकाश स्ट्रोक का उपयोग करके सूती झाड़ू के साथ पालि खोलें। सभी दिखाई देने वाली रक्त वाहिकाओं को हटा दें।
    2. मेनिंग्स फ्री ब्रेन टिश्यू को पेट्री डिश (100 एमएम x 15 एमएम) में 15 मिलील कोल्ड डब्ल्यूबीबी के साथ रखें।

3. समरूपता

  1. ऊतक को एक डौंप ऊतक ग्राइंडर मोर्टार ट्यूब में स्थानांतरित करें और संदंश के साथ डब्ल्यूबीबी के 3-4 मिलील जोड़ें।
  2. ऊतक को 55 बार 'ढीला' मूसल के साथ कीमा दें। WBB के साथ 'ढीला' मूसल कुल्ला। अब एक "तंग" मूसल 25 बार के साथ घोल कीमा ।
  3. घोल को समान रूप से दो 50 मिलील ट्यूबों में विभाजित करें और ठंड की 1.5x मात्रा जोड़ें 30% बीएसए-dextran, तेजी से घोल मिश्रण करने के लिए ट्यूबों मिलाते हुए।

4. संवहनी अंश का अलगाव

  1. ट्यूबों को जोरदार ढंग से मिलाने के बाद 25 मिन के लिए ट्यूबों को 3,000 एक्स जी और 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित करें।
  2. सुपरनेटेंट (शीर्ष मायलिन परत के साथ) को 2 नई ट्यूबों में स्थानांतरित करें, और 25 मिन के लिए ट्यूबों को 3,000 x ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रित करें। पहले सेंट्रलाइजेशन से छर्रों को ठंडा डब्ल्यूबीबी के 3 मिलील (4 डिग्री सेल्सियस पर पैलेट रखें) जोड़कर संरक्षित करें।
  3. चरण 4.2 दोहराएं और 2nd केंद्रीकरण से छर्रों को सावधानीपूर्वक संरक्षित करें।
  4. चरण 4.3 से ट्यूबों से ऊतक मलबे के साथ dextran और myelin त्यागें। ठंडडब्ल्यूबी में छर्रों को संरक्षित करें।
  5. चरण 4.1 से ट्यूब 1 और ट्यूब 2 की सामग्री पूल और ठंड WBB के साथ 10 mL की अंतिम मात्रा तक बनाते हैं।
  6. चरण 4.2 और चरण 4.3 से ट्यूबों के लिए इस कदम को दोहराएं।
    नोट: अंत में, 3 सेंट्रलाइज्ड से 3 ट्यूब हैं।
  7. एक 10 मीटर पाइप का उपयोग कर 6 ऊपर और नीचे स्ट्रोक के साथ गोली अलग, जब तक छर्रों का कोई दिखाई झुरमुट शेष हैं ।
  8. वैक्यूम फिल्टर असेंबली और नायलॉन जाल फिल्टर की मदद से, प्रत्येक ट्यूब के सेल निलंबन को फ़िल्टर करें।
    नोट: यह निस्पंदन कदम जाल फिल्टर के माध्यम से लंबे समय तक/बड़े जहाजों को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  9. कमरे के तापमान पर डब्ल्यूबीबी में फ्लैट टिप संदंश या स्क्रैपर की मदद से फिल्टर को स्क्रैप करके केशिकाओं को ठीक करें और फिर से निलंबित करें। अधिक केशिकाओं को ठीक करने के लिए एक ताजा फिल्टर के साथ निलंबन फ़िल्टर करें
  10. फिल्ट्रेट को समान रूप से दो ट्यूबों में विभाजित करें और 1,000 एक्स जी और आरटी पर 7 मिन के लिए अपकेंद्री रखें।
    नोट: इस केंद्रीकरण चरण के दौरान, एंजाइमैटिक समाधान तैयार करें। उपयोग किए गए जानवरों की संख्या के अनुसार आवश्यक डब्ल्यूबीबी की मात्रा निर्धारित करें (सामग्री की तालिकादेखें)। डब्ल्यूबीबी में टोसिल-एल-लिसिल-क्लोरोमीथेन हाइड्रोक्लोराइड (टीएलसी) (सामग्री की तालिकादेखें) के DNase 1 और 1x के 1x जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस से पूर्व गर्म करें।
  11. एंजाइमों के साथ पूर्व गर्म WBB के साथ एक ट्यूब में चरण 4.10 से छर्रों ले लीजिए। पूर्व गरम 1x कोलेजेनेज/dispase जोड़ें । ट्यूब को 33 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते हुए टेबल वाटर बाथ में ट्यूब को ठीक 33 मिन के लिए रखें।
  12. ठंड WBB के 30 mL जोड़कर एंजाइम प्रतिक्रिया बंद करो। 1,000 x जी और आरटी पर 7 मिन के लिए निलंबन केंद्राधीक्षक।
  13. सुपरनेट को ध्यान से त्यागें और 10 मीटर पाइपेट का उपयोग करके 6 अप और डाउन स्ट्रोक के साथ डब्ल्यूबीबी में पैलेट को अलग करें। यह कदम कम कठोर और तुलनात्मक रूप से तेज होना चाहिए।
  14. 1,000 x जी और आरटी पर 7 मिन के लिए निलंबन केंद्राधीक्षक।
    नोट: इस चरण के दौरान, संस्कृति व्यंजनों से कोटिंग को त्यागें और कमरे के तापमान पर डीएमईएम के साथ एक बार उन्हें कुल्ला करें। कोट सेल संस्कृति आरटी में कम से कम 1 घंटे के लिए व्यंजन।
  15. चरण 4.14 पर प्राप्त ट्यूब से अधिनायक को त्यागें, और नए पूर्ण डीएमईएम मीडिया में गोली को अलग करें, 6-वेल प्लेट (9.6 सेमी2 प्रत्येक के 9 कुओं में कोशिकाओं (दिन 0, पी0) को प्लेट करें।

5. सेरेब्रल पेरिसाइट्स का प्रसार

  1. सेल संस्कृतियों को 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ2 पर बाँझ इनक्यूबेटर में बनाए रखें। ध्यान से मलबे को हटाने के द्वारा कोशिकाओं चढ़ाना के 24 घंटे (दिन 1) के बाद संस्कृति मीडिया की जगह । 1 दिन के बाद, हर ४८ घंटे में संस्कृति मीडिया बदल जाते हैं ।
  2. कम से कम 7-8 दिनों के लिए सेल संस्कृति का निरीक्षण करें। इस समय तक, एंडोथेलियल यूनिलेयर के शीर्ष पर सेलुलर वृद्धि नमूदार होनी चाहिए।
  3. जिलेटिन लेपित संस्कृति प्लेटों पर 1 (P1) पारित करने के लिए पेरिसाइट संस्कृति माध्यम में 8-10 दिन (प्रवाह के आधार पर) पर कोशिकाओं को पारित करना। हर 2 दिन में कल्चर मीडिया बदलें। कोशिकाओं को 6-7 दिनों तक देखें। कोशिकाओं को लगातार 17 दिन पर 2 (P2) पारित होने के लिए फिर से विभाजित कर रहे है [और मार्ग 3 (P3) 24 दिन पर ही आवश्यक हो], जिलेटिन लेपित प्लेटों में pericyte माध्यम में उगाया ।
    नोट: कोशिकाएं लगभग 80-90% संबलता पर प्रयोगों/अवलोकन के लिए तैयार होंगी ।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल(चित्रा 1)पी0 में सीडिंग के समय 9 कुओं (6-अच्छी प्लेटों की) कुशलतापूर्वक पैदावार करता है(चित्रा 2 (P0: दिन 1))।

P0 से P2 तक, विशिष्ट रूपात्मक विशेषताएं हैं जिनके द्वारा एंडोथेलियल कोशिकाएं (सफेद तीर द्वारा इंगित) और पेरिसाइट्स (काले तीरों द्वारा इंगित) में क्रमिक वृद्धि देखी जा सकती है। P0 में, माइक्रोवेसल्स से विकसित होने वाली विस्तारित एंडोथेलियल कोशिकाएं बहुतायत में हैं(चित्रा 2ए,पी0: दिन 3), जबकि ऐसी लम्बी कोशिकाओं की बहुतायत पी 1 में कम हो जाती है और पी 2 में अनुपस्थित होती है। इसके विपरीत, पेरिसाइट्स चतुर्भुज कोशिकाओं के रूप में दिखाई देते हैं जो पी 2 में प्रचुर मात्रा में हैं(चित्रा 2ए,पी 2: दिन 18)।

पी 2 में पेरिसाइट संस्कृति की शुद्धता की पुष्टि करने के लिए, हमने मात्रात्मक पीसीआर(चित्रा 2बी),इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री(चित्रा 2सी),और पश्चिमी धब्बा(चित्रा 3)का उपयोग करके पेरिसाइट मार्कर के रूप में NG2, CD146 और PDGFR-बीटा की अभिव्यक्ति की जांच की। P2 में Pericytes सीडी 146, NG2 और PDGFR-के उच्च स्तर को व्यक्त करते हैं, जब कुल माउस मस्तिष्क (एमएस बीआर) निकालने में अभिव्यक्ति की तुलना में। नियंत्रण के रूप में, एंडोथेलियल मार्कर ओक्क्लूडिन और सीडी 31 की अभिव्यक्ति, एस्ट्रोसाइट्स मार्कर ग्लियल फिब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन (जीएफएपी) और माइक्रोग्लिया मार्कर सीडी11बी को भी पी 2 में अनुपस्थित देखा गया।

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का सारांश। यह रूपरेखा पेरिसाइट निष्कर्षण के लिए महत्वपूर्ण चरणों का प्रतिनिधित्व करती है जो ग्लास मूसल ग्राइंडर के साथ ऊतक विघटन के साथ शुरू होती है और इसके बाद dextran और निस्पंदन में 3-चरण अलगाव होता है। यह प्रोटोकॉल 33 मिन एंजाइम पाचन चरण को नियोजित करता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कोशिकाओं आकृति विज्ञान और मार्कर अभिव्यक्ति। (A)चरण विपरीत प्रसार के पी0, पी 1 और पी 2 चरणों में पेरिसाइट्स की छवियां । पी0 में प्रचुर मात्रा में एंडोथेलियल कोशिकाओं को सफेद तीर से इंगित किया जाता है। P1 में उनकी संख्या में कमी आई और वे P2 में गायब हो गए हैं । पेरिसाइट्स काले तीर से इंगित होते हैं। (ख)पी 1 में पेरिसाइट्स और माउस ब्रेन (एमएस बीआर) नमूनों के साथ पी 2 में पेरिसाइट्स में पीसीआर द्वारा CD146, NG2 और PDGFR-अभिव्यक्ति का विश्लेषण । (ग)पी 2 में पेरिसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां सीडी 146, पीडीजीएफआर-ए और एनजी 2 की सकारात्मक इम्यूनोस्टेनिंग का प्रदर्शन कर रही हैं । स्केल बार: 50 माइक्रोन (20x आवर्धन) और 20 माइक्रोन (40x आवर्धन)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल संस्कृतियों की प्रतिनिधि शुद्धता। पी 2 और माउस ब्रेन (एमएस बीआर) नमूनों में पेरिसाइट्स में वेस्टर्न ब्लॉटिंग द्वारा CD146, PDGFR-a, NG2, Occludin, GFAP, CD31, CD11b और Tubulin अभिव्यक्ति का विश्लेषण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: ऊतक विघटन, शुद्धिकरण, संवर्धन और एंजाइमैटिक पाचन के विभिन्न तरीकों की प्रतिनिधि तुलना। प्रत्येक प्रकाशित प्रोटोकॉल प्रत्येक प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले जानवरों की संख्या पर संकेतों के साथ संक्षेप में प्रस्तुत किया जाता है। सीडिंग पर प्राप्त कुओं की संख्या के संबंध में आउटपुट भी दर्शाया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

सेरेब्रल पेरिसाइट्स एनवीयू का अभिन्न अंग हैं और बीबीबी24को शामिल करने और रखरखाव में सक्रिय भूमिका निभाते हैं । इसी तरह, विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों और संवहनी विकृतियों में इन कोशिकाओं की भूमिका पेचीदा है। इसलिए, एक कुशल उच्च उत्पादन प्राथमिक पेरिसाइट सेल मॉडल इन विट्रो अध्ययन के लिए एक कुशल मंच प्रदान करेगा।

प्राथमिक पेरिसाइट्स(चित्रा 4)के अलगाव के लिए विभिन्न प्रोटोकॉल प्रस्तावित किए गए हैं। टिगजेस एट अल17 ने मेनिंग्स के साथ कॉर्टिकल टिश्यू सहित एक विधि का सुझाव दिया। यह दृष्टिकोण 6 चूहों (एक 37 डिग्री सेल्सियस, 70 मेंपिन/DNase एंजाइमों के साथ पाचन) से ऊतक का निविदाकरण है जिसके बाद 21 जी और 18 जी सुइयों के माध्यम से विघटन कदम है। इस प्रोटोकॉल से पता चलता है एक कदम जुदाई (22% बीएसए/PBS समाधान में केंद्रीकरण) है कि पैदावार कम से 2 कोलेजन मैं एक 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं लेपित । कोशिकाओं को एंडोथेलियल सेल ग्रोथ मीडियम (ईसीजीएम) में 3 पारित होने तक और बाद में पेरिसाइट प्रसार को बढ़ावा देने के लिए पासिंग कोशिकाओं के लिए पेरिसाइट ग्रोथ मीडियम (पीजीएम) में बनाए रखा जाता है । इसी तरह के एक अन्य दृष्टिकोण में, चेन एट अल18 ने ऊतक को एक निष्फल रेजर ब्लेड और ऊतक पाचन के साथ कोलेजेनेस/DNase के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर ९० डिग्री सेल्सियस पर एक निष्फल रेजर ब्लेड और ऊतक पाचन के साथ dicing द्वारा ऊतक विच्छेदन का प्रस्ताव रखा । कोशिकाओं के एक कदम जुदाई (22% बीएसए में केंद्रीकरण) के बाद, मायलिन परत हटा दी जाती है और पेलेट को ईसीजीएम में दो बार धोया जाता है। माइक्रोवेसल्स को एक कोलेजन के 3 कुओं में चढ़ाया जाता है जिसे मैं 6-अच्छी प्लेटों को लेपित करता हूं। संगम पहुंचने के बाद कोशिकाओं को दो बार पैसेज किया जाता है और बाद में पीजीएम में रखा जाता है। अंत में, यदि कोशिकाओं को 3 के अनुपात में पारित किया जाता है, तो हम प्रोटोकॉल की शुरुआत में केवल 10 चूहों के उपयोग पर 6-अच्छी प्लेटों के 27 कुओं को प्राप्त कर सकते हैं।

थॉमसन एट अल में, लेखकों को एक दो कदम एंजाइम पाचन19के माध्यम से मस्तिष्क pericytes के अलगाव का सुझाव है । मेनिंग्स और सफेद पदार्थ को हटा दिया जाता है, और मस्तिष्क के नमूनों को छोटे टुकड़ों में काटा जाता है। ऊतक के टुकड़े 20% बीएसए में अलगाव के एक कदम के बाद, 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिन के लिए कोलेजेनेज़/DNase I में पहले एंजाइम प्रतिक्रिया से गुजरना। गोली को एकत्र किया जाता है और आगे कोलेजेनेज/डिस्पास/DNase I में ३७ डिग्री सेल्सियस पर ५० मिन के लिए पचा या पच जाता है । इस कदम के बाद माइक्रोवेसल जुदाई एक 33% Percoll ढाल में है और आगे एक बार धोया। माइक्रोवेसल्स कोलेजन चतुर्थ/फाइब्रोनेक्टिन लेपित 35 मिमी व्यंजनों पर वरीयता प्राप्त हैं। पेरिसाइट्स का प्रसार 10 दिनों के लिए डीएमईएम में 10% एफसीएस और जेंटेमिसिन सल्फेट द्वारा इष्ट है। एक और दो कदम एंजाइम पाचन दृष्टिकोण में, Yamazaki एट अल ठंड DMEM20में उत्पादित ऊतक की कीमा का सुझाव है । पहले एंजाइम रिएक्शन में नमूनों का इलाज 37 डिग्री सेल्सियस पर 75 मिन के लिए कोलेजेनेज/डीनासे आई से किया जाता है। एक कदम केंद्रीकरण के बाद, गोली को फिर से एक बार धोया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिन के लिए कोलेजेनेज/डिस्पा में एक दूसरा एंजाइम प्रतिक्रिया शुरू की जाती है। एक कदम जुदाई के बाद, गोली फिर से निलंबित कर दिया है और 22% बीएसए समाधान में केंद्रीकृत । अंत में, माइक्रोवैस्कुलर गोली को फिर से निलंबित कर दिया जाता है और 6-अच्छी प्लेट में चढ़ाया जाता है। 5 माउस दिमाग के लिए, 6-अच्छी प्लेट के 1 कुएं को चढ़ाया जा सकता है। पेरिकेट्स प्राप्त करने के लिए, एंडोथेलियल संस्कृतियों को माउस ब्रेन एंडोथेलियल सेल (एमबीईसी) मध्यम II में बनाए रखते हुए तीन बार मार्गित किया जाता है। क्राउच और डोएट्सच20 FACS द्वारा पेरिसाइट शुद्धि विधि का सुझाव देते हैं। कॉर्टेक्स और वेंट्रिकुलर-माउस मस्तिष्क के उपवेंट्रिकुलर क्षेत्र से ऊतक के नमूने माइक्रो-विच्छेदित और स्केलपेल के साथ अच्छी तरह से कीमा बनाया जाता है। 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिन के लिए कोलेजेनेज/डिस्पे एंजाइम ऊष्मायन के बाद, पचाए गए ऊतक को मायलिन और मलबे से अलग किया जाता है जो 22% v/v Percoll समाधान में केंद्रित होता है। सेल निलंबन तो FACS विश्लेषण और छंटाई के लिए फ्लोरोसेंटी conjugated एंटीबॉडी में इनक्यूबेटेड है । हल कोशिकाओं को 24 अच्छी तरह की प्लेट के कोलेजन कोटेड कुओं में चढ़ाया जाता है। यह सुझाव दिया जाता है कि एक कॉर्टेक्स 24-अच्छी प्लेट के 1 अच्छी तरह से चढ़ाना के लिए पर्याप्त कोशिकाओं की पैदावार करता है।

यहां तक कि अगर उत्पादक, इन तरीकों को कई सीमाओं के साथ आते हैं, एक बैच अलगाव के लिए जानवरों की उच्च संख्या के उपयोग से उत्पादन की एक बहुत ही सीमित राशि के लिए ।

इस प्रस्तावित प्रोटोकॉल के विकास के दौरान, हम उच्च उत्पादन प्राप्त करने में सफल रहे: 10 चूहों के रूप में कुछ से एक 6 अच्छी तरह से थाली के 9 कुओं । इस उद्देश्य के लिए, मेनिंग्स को हटाना ऊतक से बड़े जहाजों को हटाने के लिए एक कदम सुनिश्चित करता है। डाउंस ऊतक ग्राइंडर मस्तिष्क जैसे नरम ऊतकों के लिए अधिक उपयुक्त है। यह ढीले मूसल, तंग मूसल के साथ समरूपता के साथ नमूना कमी सुनिश्चित करता है, और अनावश्यक सेलुलर क्षति को रोकता है। प्राथमिक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल में मुख्य उद्देश्यों में से एक ऊतक की न्यूनतम बर्बादी और मस्तिष्क वैस्कुलचर की विस्तारित पुनर्प्राप्ति है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल में, यह dextran-बीएसए संचार ऊतक समरूप के दोहराव केंद्रीकरण द्वारा प्राप्त किया जाता है। तीन-चरण का केंद्रीकरण दृष्टिकोण ऊतक होमोजेनेट से बड़ी मात्रा में वैक्यूलेचर को ठीक करने में मदद करता है। यह माइक्रोवेसल्स की 3x बढ़ी हुई रिकवरी प्रदान करता है। अलगाव के बाद, निस्पंदन अगला आवश्यक कदम है, जो बड़े जहाजों से जुड़े चिकनी मांसपेशी सेल के बहिष्कार का पक्षहै। जैसा कि एंजाइमों के संयोजन से पहले उल्लेख किया गया है, एंजाइमों पाचन के लिए प्रस्तावित किया गया है। जबकि DNase और कोलेजेनेज़/dispase कोशिकाओं के झुरमुट को कम करने और क्रमशः एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपयोग किया जाता है, यह बहुत महत्वपूर्ण है इस तरह के एक आक्रामक वातावरण में सेल मौत को रोकने के लिए और यह TLCK द्वारा रोका जाता है, जो इस तरह अंतिम उपज बढ़ जाती है । प्रारंभ में, पहले मार्ग को एंडोथेलियल मोनोलेयर विकसित करने की अनुमति है, जो बाद में यूनिलेयर पर संलग्न पेरिसाइट्स के विकास का समर्थन करता है। चूंकि प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं का अस्तित्व पासिंग पर कम हो जाता है, इसलिए यह पेरिसाइट पुनर्प्राप्ति की संभावना को बढ़ाता है। इसके अलावा, यह प्रोटोकॉल एक और पासिंग को नियोजित करता है जो एंडोथेलियल सेल संदूषण से बचना सुनिश्चित करता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पी 2 से कोशिकाओं की अधिक संख्या के साथ, कोशिकाओं के आगे की कमी पर निर्भरता कम हो जाती है। इसके अलावा, यह चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं द्वारा पेरिसाइट विकास से आगे निकल जाने की संभावना को कम कर देता है, जो बहुत अधिक दर पर पैदा होता है।

उच्च आउटपुट प्राप्त करने के लिए, कई कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं और तापमान और समय के संबंध में सही प्रदर्शन किया जाना चाहिए। बीएसए-ड्डेलिन में टिश्यू होमोजेनेट का मिश्रण तेज होना चाहिए। केंद्रीकरण चरणों के बाद पैलेट विसोजन कोशिका मृत्यु को रोकने के लिए जल्दी होना चाहिए। इसके अलावा, 33 मिन एंजाइमैटिक पाचन परिशुद्धता और देखभाल के साथ किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल के लिए सीमाओं में से एक 7-8 दिन की अवधि है कि एंडोथेलियल यूनिलेयर को बढ़ने और पेरिसाइट्स के विकास को और सुगम बनाने की अनुमति है। जाहिर है, माइक्रोवेसल्स का अलगाव बीटीटर है, यूनिलेयर का विकास तेजी से होता है, और इसलिए पेरिसाइट्स की संख्या में वृद्धि होती है। पेरिसाइट विकास को आगे बढ़ाने के लिए पर्याप्त संख्या में माइक्रोवैस्कुलर अंश सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक निष्कर्षण में 10 से कम चूहों का उपयोग न करने की सिफारिश की जाती है। यदि उपरोक्त बिंदुओं का सावधानीपूर्वक पालन किया जाता है, तो सेरेब्रल पेरिसाइट संस्कृति के लिए वांछित सेल घनत्व आसानी से प्राप्त किया जा सकता है।

इन विट्रो मॉडल न्यूरोलॉजिकल विकारों के दौरान एनवीयू की अन्य कोशिकाओं के बीच रोगविज्ञानी प्रासंगिकता और संचार के बारे में अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए व्युत्पन्न मॉडलके विकास के लिए एक व्यवहार्य मंच प्रदान करते हैं। अलग पेरिसाइट्स को द्वि-सेलुलर संस्कृति (एंडोथेलियल या ग्लियल कोशिकाओं के साथ) और त्रि-सेलुलर संस्कृति (एंडोथेलियल और ग्लियल कोशिकाओं) मॉडल में शामिल किया जा सकता है। यहां इन मॉडलों के विकास पर चर्चा नहीं हुई है। निष्कर्ष निकालने के लिए, यह प्रोटोकॉल उच्च उत्पादन के साथ प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक दृष्टिकोण प्रदान करता है और सेरेब्रल पेरिसाइट जीव विज्ञान से संबंधित इन विट्रो अनुसंधान के लिए एक बेहतर मंच प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेफ्टिनेंट और एफजी को एग्नेस नेशनल डे ला रेचे (एएनआर, एएनआर-15-जेपीडब्ल्यूजी-0010) द्वारा परियोजना स्नोबॉल के लिए यूरोपीय संघ के संयुक्त कार्यक्रम - न्यूरोडीजेनेरेटिव डिजीज रिसर्च (जेपीएनडी) के ढांचे में प्रदान किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amino acids BME Sigma B-6766 Store at 4 °C.
Basal DMEM media Invitrogen 316000083 Store at 4 °C.
Basic fibroblast growth factor Sigma F-0291 Store at -20 °C.
BSA Sigma A-8412 Store at 4 °C.
Collagenase dispase Sigma 10269638001 Prepare a 10x stock solution in sterile PBS-CMF. Filter the solution with a 0.22 μm syringe filter and store at -20 °C. Note: For the enzyme digestion step of the protocol, for every set of 10 mice for extraction, 300 µL of 10x collagenase dispase is required.
Dextran Sigma 31398
DNase I Sigma 11284932001 Prepare a 1000X stock solution by dissolving 100 mg in 10 ml sterile water and store at -20°C.
Gelatin Sigma G-2500 Prepare the working coating by making a 0.2% gelatin solution in sterile PBS-CMF (8 g/L NaCl, 0.2 g/L KCl, 0.2 g/L KH2PO4, 2.86 g/L NaHPO4 (12 H2O), pH 7.4). Autoclave the solution for minimum 20 minutes at 120 °C and store at room temperature. Culture dishes to be coated for at least 4 hours at 4 °C.
Gentamycin Biochrom AG A-2712 Store at 4 °C.
Glutamine Merck I.00289 Store at -20 °C.
HBSS Sigma H-8264 Store at 4 °C.
HEPES Sigma H-0887 Store at 4 °C.
Matrigel BD Biocoat 354230 Prepare a working coating solution of Matrigel by diluting stock in cold DMEM at 1:48 ratio with its final concentration to be 85 µg/cm2. Cell culture dishes should be coated at least for 1 hour at room temperature.
Pericyte Medium-mouse Sciencell research laboratories 1231 Store at 4 °C.
Tosyl Lysin Chloromethyl Ketone Sigma T-7254 Prepare a 1000X stock solution in WBA by dissolving 16 mg in 10.88 mL of WBA to make a 4 mM solution and store at 4 °C.
Vitamins Sigma B-6891 Store at -20 °C.
Equipment Requirements
Filtration tools Sefar, Nylon mesh, 60-micron porosity
Laboratory equipment Swing bucket rotor centrifuge
Water bath with agitator
Laminar Flow Hood : BSL2
Glassware (all components to be heat sterilized) Dounce Tissue Grinder With Glass Pestle
Pestle I: 0.0035 - 0.0065 inches
Pestle II: 0.0010 - 0.0030 inches
Vacuum filter assembly with coarse porosity fritted glass filter support base
Surgical dissection tools (all components to be heat sterilized) Forceps, scissors, Bunsen burner, cotton swabs, gauge

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References

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