जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए संशोधित विधि द्वारा अनाज बीजों से उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिप्टोम डेटा प्राप्त करना

Biochemistry
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Summary

अनाज की ट्रांसक्रिम प्रोफाइलिंग के लिए एक विधि प्रस्तुत की जाती है। माइक्रोव्यू आधारित जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग अनाज अनाज से उच्च गुणवत्ता वाले कुल आरएनए के अलगाव के साथ शुरू होती है और सीडीएनए की पीढ़ी के साथ जारी रहती है। एसआरएनए लेबलिंग और माइक्रोव्यू हाइब्रिडाइजेशन के बाद सिग्नल डिटेक्शन और क्वालिटी कंट्रोल के लिए सिफारिशें दी जाती हैं।

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Butardo Jr., V. M., Seiler, C., Sreeenivasulu, N., Kuhlmann, M. Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling. J. Vis. Exp. (159), e60602, doi:10.3791/60602 (2020).

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Abstract

जीन अभिव्यक्ति का लक्षण वर्णन आरएनए गुणवत्ता पर निर्भर है। अंकुरित, विकासशील और परिपक्व अनाज बीजों में, उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए की निकासी अक्सर उच्च स्टार्च और चीनी सामग्री द्वारा बाधित होती है। ये यौगिक निकाले गए कुल आरएनए की उपज और गुणवत्ता दोनों को कम कर सकते हैं। कुल आरएनए की मात्रा और गुणवत्ता में गिरावट का बाद में डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषणों पर महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ सकता है, जो परीक्षण किए जा रहे नमूनों के जीन अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल में स्थानिक और/या लौकिक भिन्नता को सही ढंग से प्रतिबिंबित नहीं कर सकता है । इस प्रोटोकॉल में, हम अनाज अनाज के पूरे प्रतिलेखन विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता के साथ कुल आरएनए को निकालने के लिए एक अनुकूलित विधि का वर्णन करते हैं। वर्णित विधि विकासशील, अंकुरित और परिपक्व अनाज बीजों की ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त है। माइक्रोऐरे प्लेटफॉर्म का उपयोग करके ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफाइलिंग की विधि दिखाई गई है। यह विधि विशेष रूप से वर्णित जीनोम दृश्यों के साथ अनाज की जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए डिज़ाइन की गई है। माइक्रोऐरे हैंडलिंग से लेकर अंतिम गुणवत्ता नियंत्रण तक की विस्तृत प्रक्रिया का वर्णन किया गया है। इसमें सीडीएनए संश्लेषण, एसआरएनए लेबलिंग, माइक्रोव्यूहाइब्रिडाइजेशन, स्लाइड स्कैनिंग, फीचर निष्कर्षण और डेटा गुणवत्ता सत्यापन शामिल हैं। इस विधि द्वारा उत्पन्न डेटा का उपयोग अंकुरण के दौरान अनाज के प्रतिलेखन की विशेषता, अनाज विकास के विभिन्न चरणों में, या विभिन्न जैविक या अजैविक तनाव स्थितियों पर किया जा सकता है। यहां प्रस्तुत परिणाम डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषणों के लिए उच्च गुणवत्ता वाले ट्रांसक्रिटोम डेटा उत्तरदायी हैं, जैसे कि विभेदित रूप से व्यक्त किए गए जीन (डीईजी) का निर्धारण, जीन नियामक नेटवर्क का लक्षण वर्णन, और ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन (TWAS) का आयोजन करना।

Introduction

ट्रांसक्रिप्टोम एक दिए गए समय पर और विशेष रूप से पर्यावरण और विकास की स्थिति में किसी जीव के जीनोम द्वारा व्यक्त रिबोन्यूक्लिक एसिड (आरएनए) ट्रांसक्रिप्ट के पूर्ण सेट का प्रतिनिधित्व करता है। प्रत्येक कोशिका का व्यक्तिगत प्रतिलेखन होता है, जो इसकी वर्तमान शारीरिक और मेटाबोलिक स्थिति को दर्शाता है। एक समान ऊतक या अंग से प्राप्त कोशिकाओं का संग्रह एक विशिष्ट ट्रांसक्रिप्टोम अध्ययन में उपयोग किया जाता है, लेकिन एकल-कोशिका और स्थानिक रूप से हल किए गए ट्रांसक्रिप्टोमिक्स लोकप्रिय हो रहे हैं1। ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण एक विशिष्ट समय बिंदु पर एक चयनित ऊतक से कुल आरएनए के निष्कर्षण के साथ शुरू होते हैं, और परिभाषित विकास स्थितियों में। इस उद्देश्य के लिए, हम स्टार्च या चीनी सामग्री में उच्च नमूनों से कुल आरएनए के निष्कर्षण के लिए एक नव विकसित विधि के उपयोग की सिफारिश कर रहे हैं, जैसे अनाज बीज2। विभिन्न नमूनों के बीच ट्रांसक्रिप्टोम की तुलना में विभिन्न बहुतायत के साथ आरएनए अणुओं की पहचान होती है। इन आरएनए अणुओं को विभेदित रूप से व्यक्त किए गए जीन (डीईजी) के रूप में माना जाता है। विशिष्ट मार्कर जीन से प्राप्त प्रतिलिपियों की बहुतायत तो विकास की स्थिति का अनुमान लगाने या पर्यावरण के उतार चढ़ाव के लिए एक जीव की प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अध्ययन के तहत विकासात्मक समय बिंदुओं में उनके प्रतिलिपि बहुतायत में कोई पता लगाने योग्य परिवर्तन के साथ जीन अक्सर संदर्भ या हाउसकीपिंग जीन के रूप में उपयोग किया जाता है ।

आरएनए को आमतौर पर उत्तरी ब्लॉटिंग और मात्रात्मक रिवर्स ट्रांसक्रिटेसिस पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (क्यूआरटी-पीसीआर) जैसे विभिन्न तरीकों से पता लगाया और मात्रा निर्धारित किया जाता है, लेकिन वर्तमान उच्च-थ्रूपुट ट्रांसक्रिप्शन विधियां माइक्रोसरणी तकनीक के साथ-साथ आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-एसईक्यू) का उपयोग करके न्यूक्लिक एसिड संकरण पर काफी भरोसा करती हैं। आरएनए-एसईक्यू वर्तमान में बहुत लोकप्रिय है क्योंकि यह उच्च थ्रूपुट ट्रांसक्रिप्शन अनुप्रयोगों के लिए कई फायदे प्रदान करता है जैसा कि कहीं और3,,4की समीक्षा की गई है। हालांकि एक पुरानी तकनीक, माइक्रोऐरे चिप्स का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग अभी भी व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह एक अधिक स्थापित प्रौद्योगिकी है, जो बायोइंफॉर्मेटिक्स में एक पृष्ठभूमि की कम आवश्यकता है । आरएनए-एसईक्यू की तुलना में, माइक्रोरी प्रयोगों से उत्पन्न डेटा सेट छोटे और विश्लेषण करने में आसान होते हैं। इसके अलावा, यह अधिक लागत प्रभावी है, खासकर अगर बड़े नमूना संख्या से निपटना। हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से माइक्रोसरणी प्रौद्योगिकी का उपयोग करके ट्रांसक्रिटोमिक विश्लेषणों का उपयोग करते हैं ताकि आणविक नेटवर्क और अनाज अनाज5,,6,,7,,8,9के विकास, विकास और चयापचय में शामिल रास्तों को नियंत्रित करने वाले केंद्रीय नियामक केंद्रों की भूमिका निर्धारित की जासके। हम अनाज की गुणवत्ता और पोषण11,,12के लिए जिम्मेदार जीन की पहचान करने के लिए10अनाज अनाज की प्रतिक्रिया की मशीनी समझ प्राप्त करने के लिए जीनोम-वाइड जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग अध्ययनों का संचालन करने के लिए नियमित रूप से इसका उपयोग करते हैं । अन्य समूहों,ने जौ13, चावल14,15 ,16, ज्वार17और गेहूं18में विकास-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति एटलस प्रदान करने में सूक्ष्म सरणी प्रौद्योगिकी का भी उपयोग किया है ।15

इस प्रकाशन का उद्देश्य एक संक्षिप्त पाठ्य सारांश और विधि का एक विस्तृत दृश्य विवरण प्रदान करना है जो हम वर्तमान में एक फुर्तीला माइक्रोसरणी मंच का उपयोग करके अनाज अनाज की ट्रांसक्रिप्शन प्रोफाइलिंग के लिए हमारी प्रयोगशाला में काम करते हैं। कृपया ध्यान दें कि अन्य माइक्रोरेप्लेटफॉर्म उपलब्ध हैं, लेकिन इस विधि में कवर नहीं किए जाएंगे। हम अनाज के बीजों के विकास या अंकुरित होने से आरएनए निष्कर्षण का विस्तृत विवरण पेश करके प्रोटोकॉल शुरू करते हैं। हमारे अनुभव के आधार पर, एक उच्च गुणवत्ता और उच्च मात्रा वाले ट्रांसक्रिप्टोम को डाउनस्ट्रीम ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण के लिए उत्तरदायी प्राप्त करना अक्सर अनाज बीज ऊतकों का उपयोग करते समय अड़चन होती है। हमने कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए निष्कर्षण किट की कोशिश की है, लेकिन किसी ने भी संतोषजनक परिणाम प्रदान नहीं किए हैं। इसलिए, हमने एक क्रूड आरएनए निकालने के लिए एक रासायनिक निष्कर्षण प्रोटोकॉल विकसित किया है जिसे व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करके कॉलम शुद्धि के अधीन किया जाता है। इस विधि का उपयोग करके, हम नियमित रूप से और प्रजनन रूप से उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए2 (चित्रा 1)प्राप्त करते हैं, जिसका उपयोग एक ट्रांसक्रिप्टोम प्रोफ़ाइल उत्पन्न करने के लिए विभिन्न डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है।

Protocol

1. कुल आरएनए निष्कर्षण और शुद्धि

नोट: हमेशा धुएं के हुड के तहत काम करें क्योंकि इस विधि में हानिकारक अस्थिर कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग शामिल है। प्रयोग शुरू करने से पहले 50 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में न्यूकलीज-मुक्त पानी की माइक्रोफ्यूज ट्यूब को प्री-वार्म करें। इस न्यूलीज-मुक्त पानी का उपयोग चरण 1.8 में स्पिन कॉलम से कुल आरएनए को एल्यूट करने के लिए किया जाएगा।

  1. नमूनों को अलग से जमीन, प्रत्येक के साथ कम से कम तीन जैविक प्रतिकृति, एक ठीक पाउडर में एक निष्फल मोर्टार और मूसल का उपयोग करके जो तरल नाइट्रोजन में पहले से ठंडा होते हैं।
    1. तरल नाइट्रोजन में डूबा एक छोटी धातु स्पैटुला का उपयोग करके पाउडर नमूनों को स्कूप करें और पाउडर नमूनों को 2.0 मिलीएल न्यूस्लीज-मुक्त माइक्रोफ्यूज ट्यूबों में रखें, तरल नाइट्रोजन में भी पहले से डूबा हुआ है। बैच आरएनए निष्कर्षण (स्टॉप पॉइंट) के लिए आवंटित दिन तक तुरंत अल्ट्रालो तापमान फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में नमूनों को स्टोर करें।
      नोट: बीज के नमूने के साथ या dehusking के बिना ठीक पाउडर में जमीन हो सकती है । चावल के लिए, हम नियमित रूप से बिना किसी विस्किंग के नमूनों को पीसते हैं क्योंकि भूसी में सिलिका होता है जो पीसने की प्रक्रिया के दौरान सहायता कर सकता है।
      सावधानी: यह कदम तेजी से और कड़ाई से क्रायोजेनिक स्थितियों के तहत किया जाना चाहिए । स्वचालन के लिए एक विकल्प आरएनए गिरावट और गुणवत्ता में गिरावट को कम करने के लिए क्रायोजेनिक बॉल मिल का उपयोग कर नमूनों को पीसना है।
  2. मूल पाउडर नमूने के लगभग 200 मिलीग्राम का उपयोग करके एक क्रूड आरएनए निकालने प्राप्त करें। व्यक्तिगत रूप से प्रत्येक नमूने को एनएनएएक्सट्रैक्शन बफर (100 मीटर ट्रिस, पीएच 8.0, 150 मीटर लिसीएल, 50 मीटर ईटीए, 1.5% एसडी, 1.5% 2-मर्कापेटेनॉल) और 500 माइक्रोनल फिनॉल: क्लोरोफॉर्म:आईसोआल (25:24:2) युक्त न्यूकैप्ड-फ्री माइक्रोफ्यूज ट्यूब में जोड़ें।
    1. उच्च गति पर सेट एक बहु ट्यूब भंवर मिक्सर का उपयोग कर कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए एक ही समय में सभी नमूनों को मिलाएं। तुरंत दो मिन के लिए बर्फ पर सभी ट्यूब रखें।
      सावधानी: हमेशा धूम हुड के अंदर काम करें, विशेष रूप से फिनॉल, क्लोरोफॉर्म और अन्य कार्बनिक सॉल्वैंट्स से जुड़े सभी चरणों के लिए। आदर्श रूप से, एक व्यापक धुएं हुड का उपयोग करें जो एक बेंचटॉप अपकेंद्री, भंवर मिक्सर, मल्टी-ट्यूब भंवर मिक्सर और मल्टी-ट्यूब रोटरी मिक्सर को समायोजित कर सकता है।
  3. 10 मिन के लिए 14,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज्ड द्वारा मलबे से क्रूड आरएनए निकालने को अलग करें। इस सेक्शन के लिए एक ही सेटिंग में सभी सेंट्रलाइज्ड स्टेप्स करें।
    1. सुपरनेटेंट के लगभग 800 माइक्रोन को एक नई 2.0 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1.2 एम नैल के 400 माइक्रोन और आइसोप्रोपेनॉल के 700 माइक्रोनल हैं। 5x उलटा द्वारा धीरे से समाधान मिलाएं।
    2. आरएनए को नियमित (-20 डिग्री सेल्सियस) या अल्ट्रालो तापमान फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में इनक्यूबेट करके, कम से कम 1 घंटे (या रात भर) के लिए उपजी।
      स्टॉप या ठहराव बिंदु: बस कुछ घंटों के लिए ठहराव के लिए नियमित -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नमूनों को रखें। रात भर या लंबे स्टॉप पॉइंट के लिए, नमूनों को अल्ट्रालो तापमान फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें।
  4. 15 मिन के लिए 18,800 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा एक क्रूड आरएनए गोली प्राप्त करें। अधिनायक को त्यागने के बाद, मिनी किट(सामग्रीकी तालिका) का उपयोग करके कॉलम शुद्धि द्वारा कच्चे आरएनए गोली को शुद्ध करें।
    1. आरएलटी बफर के हौसले से तैयार 450 माइक्रोन में गोली को भंग करें (उपयोग करने से पहले, आरएलटी बफर के प्रति 100 मीटर प्रति 100 माइक्रोन जोड़ें, जो दैनिक रूप से तैयार ताजा हैं)। कम से कम 5 न्यूनतम के लिए एक बहु ट्यूब भंवर मिक्सर में कमरे के तापमान पर सभी ट्यूबों मिश्रण द्वारा सभी छर्रों के विघटन को बढ़ाएं।
  5. 2 मिलीआर संग्रह ट्यूब के साथ बैंगनी मिनी स्पिन कॉलम के माध्यम से गुजरकर भंग आरएनए गोली को शुद्ध करें। 9,000 x ग्राम पर 1 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर सेंट्रलाइज और बैंगनी मिनी स्पिन कॉलम को त्यागदें।
    1. 2 मिलीएल संग्रह ट्यूब में मंजूरी दे दी lysate करने के लिए पूर्ण इथेनॉल (~ 225 μL) की 0.5 मात्रा जोड़ें। कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एक ही प्लास्टिक टिप का उपयोग कर समाधान मिलाएं।
  6. 2 mL संग्रह ट्यूब के साथ एक गुलाबी मिनी स्पिन कॉलम में समाधान को तुरंत स्थानांतरित करके शुद्ध आरएनए एकत्र करें। 15 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र गुलाबी मिन स्पिन कॉलम की सिलिका झिल्ली पर आरएनए इकट्ठा करने के लिए। प्रवाह के माध्यम से त्यागें और 15 एस के लिए 9,000 x ग्राम पर अपन्तिफेशन द्वारा बफर RW1 के 350 μL के साथ आरएनए धोलें।
  7. पतला DNase 1 के 80 μL (जमे हुए DNase स्टॉक + DNase सेट का उपयोग कर आरडीडी के 350 μL के 50 μL) सीधे झिल्ली पर और कम से कम 15 min (ठहराव बिंदु) के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेटिंग द्वारा पचाने के द्वारा जीनोमिक डीएनए दूषित निकालें।
    1. RW1 के ३५० μL जोड़कर DNase 1 धोने और 15 एस के लिए ९,००० x ग्राम पर नीचे कताई दो बार दोहराएं, लेकिन इस बार बफर आरपीई के ५०० μL के साथ धोने । एक नया 2 mL संग्रह ट्यूब पर स्थानांतरित करें और सूखने के लिए 2 मिन के लिए 9,000 x ग्राम पर स्पिन करें।
  8. सूखे स्पिन कॉलम को एक नए 1.5 एमएल न्यूलीज-फ्री कलेक्शन ट्यूब में स्थानांतरित करें। नुकलीज-मुक्त पानी (50 डिग्री सेल्सियस पर पूर्वगरम) के 50 माइक्रोन जोड़कर शुद्ध आरएनए निकालने के लिए एल्यूशन प्रक्रिया शुरू करें और 50 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक पर 3 मिन के लिए इनक्यूबेटिंग करें।
    1. इनक्यूबेशन के बाद, 1 मिन के लिए 9,000 x ग्राम पर अपकेंद्री द्वारा कुल आरएनए निकालने को कम करें। तुरंत सभी नमूनों को बर्फ पर रखें।
  9. अपने संबंधित निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग करके नैनोड्रॉप और बायोएनालाइजर में उपयुक्त कमजोर (आमतौर पर 1:10) चलाकर कुल आरएनए निकालने की मात्रा और गुणवत्ता निर्धारित करें। आरएनए अर्क में कम से कम 8.0 का आरआईएन मूल्य और 50 एनजी/μL की एकाग्रता होनी चाहिए। चित्रा 1 जौ के पत्ते और बीजों से प्राप्त आरएनए अर्क के लिए एक विशिष्ट परिणाम दिखाता है।
    स्टॉप पॉइंट: उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस में नमूनों को स्टोर करें।

2. सीआरएनए प्रतिलेखन और लेबलिंग के बाद सीडीएनए संश्लेषण

नोट: यह कदम एक साथ 24 नमूनों को संसाधित करने के लिए उपयुक्त है। सुझाव दिया जाता है कि पूरा कदम एक दिन में लगातार संचालित किया जाता है, लेकिन वैकल्पिक स्टॉप और ठहराव बिंदुओं की पहचान की जाती है। नीचे दिए गए चरणों को शुरू करने से पहले 80 डिग्री सेल्सियस, 65 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर तीन माइक्रोफ्यूज ट्यूब हीट ब्लॉक को पहले से गर्म करना सुनिश्चित करें। इन तापमान सेटिंग्स को नीचे दिए गए चरणों में नोट के रूप में बदला जाएगा। उदाहरण के लिए, स्पाइक मिक्स तैयार होने के बाद 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक 40 डिग्री सेल्सियस तक सेट हो जाएगा (या यदि यह पहले से तैयार किया गया है)। निर्माता के निर्देशों के आधार पर कम इनपुट क्विक एम्प जीन एक्सप्रेशन लेबलिंग किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके वन-कलर स्पाइक मिक्स, टी7 प्रमोटर मिक्स और सीडीएनए मास्टर मिक्स तैयार करें। यह तैयारी आरएनए अर्क शुरू करने की राशि पर निर्भर है, जो आमतौर पर कुल आरएनए या पॉलीए आरएनए के लिए 5 एनजी के लिए 10 से 200 एनजी तक होती है। हम नियमित रूप से माइक्रोसरणी संकरण2 के लिए सामग्री शुरू करने के रूप में और नीचे वर्णित विधि के लिए 50 एनजी कुल आरएनए का उपयोग करते हैं। 24 नमूनों के लिए एक मास्टर मिश्रण तैयार करने में, पाइपिंग विविधताओं के लिए खाते में 2 अतिरिक्त प्रतिक्रियाएं जोड़ें। इस स्टेप में हमेशा न्यूकलीज-फ्री माइक्रोफ्यूज ट्यूब और न्यूकलीज-फ्री वॉटर का इस्तेमाल करें।

  1. उच्च उपज के कारण, आम तौर पर 50-100 एनजी रेंज के भीतर फिट करने के लिए आरएनए निकालने 100 गुना पतला। चरण 1.9 में आरएनए क्वांटिफिकेशन परिणामों के आधार पर, 1.5 मीटर माइक्रोफ्यूज ट्यूब में न्यूकलीज-मुक्त पानी के 99 माइक्रोन को शुद्ध आरएनए निकालने के 1 माइक्रोन जोड़कर 1:100 कमजोर पड़ने का प्रयास करें। नैनोड्रॉप का उपयोग करके इस कमजोर पड़ने की वास्तविक एकाग्रता निर्धारित करें।
    1. 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में प्रत्येक कुल आरएनए नमूने का दूसरा कमजोर पड़ना 1.5 माइक्रोईएल की अंतिम मात्रा में कुल आरएनए के 50 एनजी बनाने के लिए करें। सभी नमूनों को बर्फ पर रखें।
  2. निर्माता के निर्देशों के आधार पर स्पाइक मिक्स तैयार करें। यह कदम भी Püffeld एट अल 20192में संक्षेप में है। इसके लिए 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक का इस्तेमाल करें। एक रंग स्पाइक मिश्रण सकारात्मक नियंत्रण के पहले और दूसरे कमजोर पड़ने को अल्ट्रालो तापमान फ्रीजर (-80 डिग्री सेल्सियस) में स्टोर करें और केवल आठ बार-बार फ्रीज/गल चक्रों के माध्यम से जाएं।
    1. तीसरे और चौथे कमजोर पड़ने को रोजाना तैयार करें। गल और उपयोग से पहले बर्फ पर स्पाइक मिश्रण के तीसरे और चौथे कमजोर पड़ने की दुकान ।
      नोट: 37 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक के तापमान को 40 डिग्री सेल्सियस तक परिवर्तित करें जब स्पाइक मिक्स तैयार किया गया था (या यदि यह पहले तैयार किया गया था)।
  3. उपयोग करने से पहले T7 प्रमोटर मिक्स और स्टोर बर्फ पर तैयार करें। निम्नलिखित 24 नमूनों के लिए पर्याप्त है:
    T7 प्रमोटर प्राइमर के 20.8 μL
    न्यूस्लीज-मुक्त पानी का + 26.0 माइक्रोन
    = कुल मात्रा T7 प्रमोटर मिक्स के 46.8 माइक्रोन
  4. चरण 2.1 से 50 एनजी आरएनए नमूने के 1.5 माइक्रोन युक्त प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब में T7 प्रमोटर प्राइमर मिक्स (चरण 2.3) के 1.8 माइक्रोन जोड़ें। कई बार पाइपिंग करके घटकों को ठीक से मिलाएं। 10 00 00 के लिए 65 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में इनक्यूबेटिंग करके आरएनए टेम्पलेट-प्राइमर मिक्स को विकृत करें। अगले चरण की तैयारी में तुरंत बर्फ पर माइक्रोफ्यूज ट्यूब रखें।
  5. टेम्पलेट-प्राइमर मिक्स (चरण 2.4) को डीनाटूर करते समय, कम से कम 4 मिन के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर 5x फर्स्ट स्ट्रैंड बफर को प्री-वार्म करें। निर्माता के निर्देशों के आधार पर कम इनपुट क्विक एएमपी लेबलिंग किट (सामग्री की तालिकादेखें) से सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स जल्दी तैयार करें। निम्नलिखित 24 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त है:
    52.0 माइक्रोन ऑफ प्री-वार्मेड 5x फर्स्ट स्ट्रैंड बफर (स्टेप 2.5)
    0.1 M डीटीटी का + 26.0 माइक्रोन
    + 10 एमएम डीएनटीपी मिक्स के 13.0 माइक्रोन
    RNase ब्लॉक मिक्स के + 31.2 μL
    = कुल मात्रा का 122.2 माइक्रोन सीडीएनए संश्लेषण मास्टर मिक्स
    1. बर्फ पर प्रत्येक घटक गल। प्रत्येक घटक को कोमल पाइपिंग द्वारा मिलाएं। उपयोग करने से पहले मास्टर मिक्स को कमरे के तापमान पर रखें।
      सावधानी: RNase ब्लॉक मिक्स को उपयोग के बाद तुरंत -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में वापस रखा जाना चाहिए।
  6. बर्फ पर आरएनए टेम्पलेट-प्राइमर मिश्रण (चरण 2.4) को हटा दें और कमरे के तापमान पर संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें ताकि सभी सामग्री को माइक्रोफ्यूज ट्यूब के नीचे स्पिन किया जा सके। प्रत्येक ट्यूब पर सीडीएनए मास्टर मिक्स (चरण 2.5) के 4.7 माइक्रोन को वितरित करें, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ध्यान से मिलाएं। जब सभी घटकों को जोड़ा जाता है तो कुल मात्रा 8.0 माइक्रोन होनी चाहिए।
    1. 40 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में 2 घंटे के लिए सीडीएनए का संश्लेषण करें। 2 घंटे इनक्यूबेशन के दौरान, गर्मी निष्क्रियता (चरण 2.7) की तैयारी में 65 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक के तापमान को 70 डिग्री सेल्सियस तक स्थानांतरित करें।
      वैकल्पिक ठहराव बिंदु: नमूनों को रात भर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गर्मी निष्क्रियता (चरण 2.7) के बाद प्रयोग अगले दिन जारी रखा जा सकता है।
  7. RNase ब्लॉक मिक्स को गर्म-निष्क्रिय करने के लिए 15 मिन के लिए 70 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में प्रत्येक ट्यूब को इनक्यूबेट करें। बर्फ पर ट्यूबों को तुरंत स्थानांतरित करें और कम से कम 5 मिन के लिए इनक्यूबेट करें।
  8. जबकि नमूने 5 मिन (चरण 2.7) के लिए बर्फ पर हैं, जल्दी से ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिक्स तैयार करें। सभी घटकों को कमरे के तापमान पर जोड़ा जा सकता है लेकिन बर्फ पर घटकों गल सकता है। निम्नलिखित 24 नमूनों के लिए पर्याप्त है:
    19.5 एनकेएल न्यूस्लीज-फ्री पानी
    + 5x ट्रांसक्रिप्शन बफर का 83.2 माइक्रोन
    0.1 M डीटीटी के + 15.6 माइक्रोन
    एनटीपी मिक्स के + 26.0 माइक्रोन
    T7 आरएनए पॉलीमरेज़ ब्लेंड के + 5.5 माइक्रोन
    + 6.2 माइक्रोन ऑफ सायनाइन 3-सीटीपी (Cy3)
    = कुल मात्रा प्रतिलेखन मास्टर मिक्स के 156.0 माइक्रोन
    सावधानी: T7 आरएनए पॉलीमरेज ब्लेंड को -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में रखा जाना चाहिए और उपयोग के तुरंत बाद वापस रखा जाना चाहिए। इसके अलावा, Cy3 प्रकाश संवेदनशील है । इसलिए, मिश्रण (चरण 2.9) और वितरण (चरण 2.10) कम प्रकाश स्थितियों में किया जाना चाहिए। इसके लिए आमतौर पर हम लैब बेंच के ऊपर सीधे किसी भी लाइट को बंद कर देते हैं।
  9. चूंकि ट्यूबों को अचानक हीटिंग और कूलिंग (चरण 2.7) के अधीन किया गया था, इसलिए प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब के तल पर सभी तरल एकत्र करने के लिए माइक्रोसेंटरिफ्यूज का उपयोग करके प्रत्येक नमूने की सामग्री को संक्षेप में स्पिन करें। धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके ट्रांसक्रिप्शन मास्टर मिक्स (चरण 2.8) के 6 माइक्रोन जोड़ें। इस प्रतिक्रिया की कुल मात्रा इस स्तर पर 16 μL होनी चाहिए । Cy3-लेबल वाले cRNA उत्पन्न करने के लिए 2 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों को इनक्यूबेट करें।
    वैकल्पिक स्टॉप पॉइंट: ट्यूबों को ट्रांसक्रिप्शन के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  10. एसआरएनए (स्टेप 2.9) जनरेट करते समय हीट ब्लॉक का तापमान 55 डिग्री सेल्सियस तक सेट कर दिया। हीट ब्लॉक में न्यूकलीज-फ्री पानी की कम से कम एक माइक्रोफ्यूज ट्यूब डालें। इस न्यूकलीज मुक्त पानी का उपयोग शुद्ध सीआरएनए के एल्यूशन के लिए किया जाएगा।
  11. cRNA प्रतिलेखन और लेबलिंग के बाद, चरण 3 में विस्तृत के रूप में एक RNeasy मिनी किट का उपयोग कर लेबल cRNA शुद्ध ।

3. क्रेना शुद्धि

  1. एक RNeasy मिनी किट का उपयोग कर लेबल cRNA शुद्ध (सामग्री की तालिकादेखें) । निर्माता के निर्देशों के आधार पर बफ़र्स तैयार करें। उदाहरण के लिए, बफर आरपीई को केंद्रित रूप में किट में आपूर्ति की जाती है। उपयोग करने से पहले, आणविक जीव विज्ञान ग्रेड निरपेक्ष इथेनॉल (96-100%) की 4 मात्रा जोड़ें।
  2. कुल मात्रा को 100 माइक्रोन में समायोजित करने के लिए प्रत्येक नमूने में न्यूकलीज-मुक्त पानी के 84 माइक्रोन जोड़ें। फिर प्रत्येक ट्यूब में बफर आरएलटी के 350 माइक्रोन और पूर्ण इथेनॉल के 250 माइक्रोन जोड़ें। पाइपिंग करके अच्छी तरह मिला लें।
  3. 2 mL संग्रह ट्यूब के साथ एक मिनी स्पिन कॉलम पर प्रत्येक मिश्रण के 700 μL स्थानांतरित करें। 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेंट्रलाइफेशन द्वारा झिल्ली पर लेबल किए गए cRNA को 7,534 x ग्रामपर एकत्र करें। प्रवाह के माध्यम से तरल को त्यागें।
  4. बफर आरपीई के 500 माइक्रोन में प्रत्येक नमूने को धोएं। पिछले चरण की तरह अपकेंद्रित्र और त्यागने प्रवाह के माध्यम से। इस चरण को एक बार दोहराएं, फिर अगले चरण में जाएं।
  5. मिनी स्पिन कॉलम को एक नए संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें। चरण 3.3 में केंद्रीकरण द्वारा नमूनों को सुखाएं।
  6. मिनी स्पिन कॉलम को एक न्यूलीज-फ्री 1.5 एमएल माइक्रोफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जो किट के साथ आपूर्ति की जाती है। प्रत्येक लेबल cRNA नमूना nuclease मुक्त पानी के 30 μL जोड़कर (55 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गरम) सीधे झिल्ली फिल्टर में। 60 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में इनक्यूबेटिंग करके एल्यूशन बढ़ाएं।
  7. कमरे के तापमान पर केंद्रीकरण द्वारा लेबल किए गए सीआरएनए को 7,535 x ग्रामपर 30 एस के लिए एकत्र करें। स्पिन कॉलम को त्यागें और प्रत्येक माइक्रोफ्यूज ट्यूब को बंद करें। तुरंत बर्फ पर प्रत्येक ट्यूब जगह है।
    वैकल्पिक स्टॉप पॉइंट: नमूनों को एल्यूशन के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  8. माइक्रोरेवे फीचर का उपयोग करके नैनोड्रॉप के साथ क्रेना की मात्रा निर्धारित करता है। नमूना आरएनए-40 पर सेट करें। एक स्प्रेडशीट में निम्नलिखित मूल्यों और रिकॉर्ड प्राप्त करें: साइनिन 3 डाइ एकाग्रता (pmol/μL), आरएनए अवशोषण अनुपात (२६० एनएम/280 एनएम), और cRNA एकाग्रता (एनजी/μL) ।
    स्टॉप पॉइंट: तुरंत पढ़ने के बाद -80 डिग्री सेल्सियस पर क्रेना के नमूनों को स्टोर करें।
  9. क्रेना यील्ड और विशिष्ट गतिविधि की गणना करें, जैसा कि प्यूफेल्ड एट अल 20192में विस्तृत है।

4. माइक्रोऐरे संकरण और स्कैनिंग

नोट: यह कदम केवल 3-4 घंटे लेता है और इसलिए दोपहर के भोजन के बाद 24 नमूनों का संकरण शुरू किया जा सकता है। एक ऑपरेटर आराम से 4 स्लाइड (32 नमूने) तक चला सकता है। अगले दिन की सुबह माइक्रोरे स्लाइड की धुलाई और स्कैनिंग के लिए आवंटित की जाती है। इसके बाद दूसरे दिन की दोपहर में अतिरिक्त रन किए जा सकते हैं । यह कदम तब तक दोहराया जाता है जब तक कि सभी नमूनों को संक्षेप में और स्कैन नहीं किया जाता है। स्लाइडों को संभालने और संसाधित करने के लिए रंग-मुक्त, पाउडर मुक्त लेटेक्स दस्ताने का उपयोग करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूने रंगीन वर्णक ों से दूषित न हों जो सूक्ष्मसरण विश्लेषणों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध माइक्रोरे के अलावा, निम्नलिखित कस्टम सरणी हमारे समूह द्वारा डिजाइन किए गए हैं और फुर्तीला से आदेश के लिए उपलब्ध हैं: जौ के Japonicaलिए आदेश कोड 028827(होर्डेमवल्ग),चावल के लिए 054269(ओरिज़ासटिवा उप्स), चावल के लिए 054270(ओरिज़ासिव सब्स इंडिका)और गेहूं के लिए 048923(ट्राइटिमाटिव्टम)।

  1. जीन एक्सप्रेशन हाइब्रिडाइजेशन किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके माइक्रोसरणी संकरण करें। निर्माता के विनिर्देश2के अनुसार 10x अवरुद्ध एजेंट तैयार करें। अलीकोट 10x ब्लॉकिंग एजेंट को 200 माइक्रोन भागों में संग्रहित करें और उपयोग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रत्येक एलिकोट 40 संकरण के लिए पर्याप्त है और 2 महीने तक स्थिर है।
  2. माइक्रोव्यूरी हाइब्रिडाइजेशन के लिए आवंटित दिन पर, बर्फ पर 10x अवरुद्ध एजेंट के एक 200 माइक्रोन एलिकोट गल। इसके अलावा, संकरण ओवन को 65 डिग्री सेल्सियस तक पूर्व-गर्म करें और सीपीआरएनए विखंडन के दौरान उपयोग के लिए 60 डिग्री सेल्सियस तक गर्मी ब्लॉक को पूर्व-गर्म करें।
  3. निर्माता2द्वारा वर्णित प्रत्येक नमूने के लिए विखंडन मिश्रण तैयार करें। हमारी प्रयोगशाला में, हम नियमित रूप से 8-पैक माइक्रोसरणी में संकरण के लिए 600 एनजी का उपयोग करते हैं। इस मामले में, नीचे दी गई सूची प्रति नमूने विखंडन मिश्रण के घटकों को संक्षेप में प्रस्तुत करती है:
    600 एनजी के लिल प्रवर्धित cRNA, साइनिन 3 लेबल
    + 10x अवरुद्ध एजेंट के 5 μL
    न्यूस्लीज-मुक्त पानी के साथ 24 माइक्रोन के लिए मात्रा समायोजित करें
    + 25x विखंडन बफर के 1 μL
    = कुल मात्रा विखंडन मिश्रण के 25 μL
    1. भंवर मिक्सर का उपयोग करके धीरे-धीरे नमूने मिलाएं। सभी नमूनों को संक्षेप में माइक्रोसेंटिफ्यूज का उपयोग करके स्पिन करें।
  4. 60 डिग्री सेल्सियस हीट ब्लॉक में सभी नमूनों को बिल्कुल 30 00 के लिए इनक्यूबेट करें। तुरंत एक मिन के लिए बर्फ पर प्रत्येक ट्यूब को ठंडा करें फिर जल्दी से अगले चरण में आगे बढ़ें।
  5. विखंडन प्रतिक्रिया को पूरी तरह से रोकने के लिए, प्रत्येक ट्यूब में 2x जीएक्स हाइब्रिडाइजेशन बफर हाय-आरपीएम जोड़ें। मिश्रण के दौरान किसी भी बुलबुले को पेश न करने के लिए बहुत सावधानी बरतते हुए, ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे-धीरे मिलाएं। हम नियमित रूप से 8 पैक माइक्रोसरणी प्रारूप के लिए विखंडन प्रतिक्रिया को रोकने के लिए संकरण बफर के 25 μL का उपयोग करें ।
  6. परिवेश कक्ष के तापमान में 1 5,750 x ग्राम पर 1 न्यूनतम के लिए सभी ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें। जल्दी से बर्फ पर सभी ट्यूबों जगह है और जितनी जल्दी हो सके प्रत्येक नमूने लोड।
  7. इनक्यूबेशन 17 घंटे के लिए प्रयोगशाला छोड़ने से पहले, वीडियो में विस्तृत के रूप में संकरण विधानसभा2 तैयार करें ।
    1. महत्वपूर्ण कदम: प्रत्येक संकरण मिश्रण को स्थानांतरित करें और प्रत्येक गैसकेट के केंद्र में धीरे-धीरे वितरित करें, वितरण के दौरान किसी भी बुलबुले को पेश न करने के लिए बड़ी सावधानी देख रहे हैं। हम नियमित रूप से 8 पैक माइक्रोसरणी प्रारूप के लिए संकरण मिश्रण के 44 μL का उपयोग करें। इसके अलावा किसी भी अप्रयुक्त कुओं में 1x संकरण बफर के 44 μL जगह है।
    2. तुरंत गैसकेट स्लाइड के शीर्ष पर सही अभिविन्यास के साथ माइक्रोरेयर स्लाइड डाल दें। किसी भी तरल को न गिराने के लिए इसे बहुत सावधानी से करने की आवश्यकता है। संकरण असेंबली को कसकर बंद करें और यह जांचने के लिए घुमाएं कि क्या कोई स्थायी हवा बुलबुले पेश नहीं किए गए हैं। सभी बुलबुले गैसकेट स्लाइड के भीतर जा रहा होना चाहिए।
  8. संकरण ओवन रोटेटर में संकरण कक्ष विधानसभा रखो। यदि 2x जीएक्स हाइब्रिडाइजेशन बफर का उपयोग कर रहे हैं, तो रोटेशन की गति को 10 आरपीएम पर सेट करें और बिल्कुल 17 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर संकरण करें।
  9. जीन एक्सप्रेशन वॉश बफर किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके संसंकरित माइक्रोरे धोएं। निर्माता के निर्देशों के आधार पर जीन एक्सप्रेशन वॉश बफर 1 और 2 तैयार करें दोनों बफ़र्स (विशुद्ध रूप से वैकल्पिक लेकिन अत्यधिक सूक्ष्म सरणी धोने कलाकृतियों की घटनाओं को कम करने की सिफारिश)2बफ़र्स के लिए 10% ट्राइटन एक्स-102 के 2 mL जोड़ें ।
  10. पिछले प्रकाशन2में विस्तृत रूप से तीन वॉश चैंबर विधानसभाओं को तैयार करें । प्रत्येक वॉश चैंबर का विवरण नीचे सारणीबद्ध किया जाता है(तालिका 1)।
  11. एलिकोट 500 mL वॉश बफर 1 में 1 एल रिएजेंट बोतल में और परिवेश कक्ष के तापमान पर छोड़ दें। पहले कक्ष से वॉश बफर को बचाने के लिए "वॉश बफर 1 रीयूज" के साथ एक अतिरिक्त 1 एल रिएजेंट बोतल और लेबल तैयार करें। इसके अतिरिक्त, एक अभिकर्मक बोतल में वॉश बफर 2 के 500 mL को एलिकोट करें और रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें।
    नोट: कदम 4.9 से 4.11 तैयार किए बिना प्रयोगशाला न छोड़ें। वे अगले दिन धोने के कदम के लिए आवश्यक हैं।
  12. अगले दिन, टेबल 2में विस्तृत रूप में वॉश बफ़र्स तैयार करें। प्रत्येक पकवान को उनके इसी बफर के तीन चौथाई तक भरें। प्रत्येक वॉश बफर 4-5 स्लाइड तक के लिए अच्छा है।
  13. संकरण के ठीक 17 घंटे के बाद, एक संकरण कक्ष प्राप्त करें और पिछले प्रकाशन2में विस्तृत रूप से लिंट-मुक्त कागज के साथ लाइन में लगी प्रयोगशाला पीठ पर अलग हो जाएं।
    1. महत्वपूर्ण कदम: डिश 1 के लिए माइक्रोएरे सैंडविच स्थानांतरित करें । सुनिश्चित करें कि माइक्रोऐरे बारकोड एक तिरछी स्थिति में सामना कर रहा है, और बफर में पूरी स्लाइड जलमग्न होने से बचें। प्रत्येक माइक्रोरेस्लाइड को उनके सिरों से संभालें और स्लाइड के सक्रिय पक्ष को छूने से बचें।
    2. एक संदंश2का उपयोग कर दो ग्लास स्लाइड अलग । गैसकेट स्लाइड को धीरे-धीरे डिश 1 के नीचे छोड़ दें, जबकि साथ ही यह सुनिश्चित करें कि माइक्रोरेस्लाइड अगले चरण के लिए दृढ़ता से आयोजित की जाती है।
  14. महत्वपूर्ण कदम: धीरे-धीरे माइक्रोरे स्लाइड बग़ल में उठाएं और तुरंत डिश 2 में माइक्रोरेरैक में स्थानांतरित करें जैसा कि पिछले प्रकाशन2में विस्तृत है। यह महत्वपूर्ण है कि माइक्रोरे स्लाइड कम से कम हवा के संपर्क में हैं।
    1. आठ स्लाइड रैक में होने तक चरण 4.13 और 4.14 दोहराएं। रैक के साथ समान रूप से माइक्रोरे स्लाइड वितरित करें। यह कदम 4 स्लाइड तक के लिए बिना सहायता के एक ऑपरेटर द्वारा किया जा सकता है। रैक धारक संलग्न करें और पूरे डिश 2 सेटअप को पहले चुंबकीय उभारक में स्थानांतरित करें। बिल्कुल 1 मिन के लिए धीरे से हिलाओ।
  15. 1 मिन (चरण 4.14) के लिए सरगर्मी करते हुए, मिनी 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर से डिश 3 स्थानांतरित करें और दूसरे चुंबकीय उभारक के शीर्ष पर रखें। धीरे-धीरे डिश 3 पर वॉश बफर 2 (37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान से) रखें। डालने के दौरान बुलबुला गठन से बचें।
    1. 1 मिन सरगर्मी (चरण 4.14) के बाद, धीरे और धीरे-धीरे डिश 2 से स्लाइड रैक उठाएं और डिश 3 में स्थानांतरित करें। रैक धारक को हटा दें और बिल्कुल 1 मिन के लिए हलचल करें।
  16. धीरे-धीरे और धीरे-धीरे डिश 3 से स्लाइड रैक उठाएं। बफर बूंदों के गठन से बचने के लिए सुनिश्चित करें2। लिंट-मुक्त कागज पर धीरे-धीरे छूकर प्रत्येक स्लाइड के किनारों को सुखाएं। प्रत्येक दाग-सूखे स्लाइड को स्लाइड बॉक्स में रखें और सभी माइक्रोरे स्लाइड स्लाइड बॉक्स में होने तक चरण 4.16 दोहराएं। लगभग 15 मिन के लिए सूखा।
    वैकल्पिक स्टॉप पॉइंट
  17. प्रत्येक माइक्रोरेरी स्लाइड को स्लाइड धारक में रखें, यह सुनिश्चित करें कि बारकोड का सामना करना पड़ रहा है।
    नोट: माइक्रोऐरे कमरे के अंदर ओजोन का स्तर 50 पीपीबी (100 μg/m3)या उससे कम होना चाहिए। यह विशुद्ध रूप से वैकल्पिक है लेकिन अत्यधिक अनुशंसित है: साइनिन रंगों के ओजोन-प्रेरित क्षरण से बचने के लिए ओजोन बैरियर स्लाइड कवर का उपयोग करें।
  18. इकट्ठे स्लाइड धारकों को स्कैनिंग हिंडोला में रखें। बारकोड नंबर के आधार पर नमूनों को क्रम में लोड करें। स्लाइड्स को माइक्रोरे स्कैनर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके तुरंत स्कैन करें, जैसा कि पिछले प्रकाशन2में विस्तृत है।
  19. रन के बाद, डेटा को निष्कर्षण और क्यूसी सत्यापन की सुविधा के लिए विषय दें, जैसा कि पिछले प्रकाशन2में विस्तृत है।

Representative Results

इस विधि को अनाज बीज के नमूनों को निकालने के लिए अनुकूलित किया जाता है जिसमें स्टार्च या शर्करा की महत्वपूर्ण मात्रा होती है। यह प्रति दिन 24 बीज नमूनों से कुल आरएनए निकालने के लिए डिज़ाइन किया गया है। यह एक दिन में लगातार आयोजित किया जाना चाहिए, लेकिन वैकल्पिक बंद करो और ठहराव अंक प्रोटोकॉल भर में पहचान रहे हैं । वैकल्पिक रूप से, पाठक अपने पसंदीदा आरएनए निष्कर्षण किट या मैनुअल रासायनिक निष्कर्षण विधि का उपयोग कर सकते हैं। हालांकि, हमारे पिछले अनुभव के आधार पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संयंत्र आरएनए निष्कर्षण किट स्टार्च, प्रोटीन, चीनी और/या लिपिड संदूषण की महत्वपूर्ण मात्रा के कारण बीज के लिए उपयुक्त नहीं हैं । वर्णित विधि में, कच्चे आरएनए की रासायनिक निकासी एक वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके कॉलम शुद्धि द्वारा अपनाई जाती है। यह आमतौर पर उच्च गुणवत्ता और उपज के साथ आरएनए प्रदान करता है। चित्रा 1 यहां वर्णित विधि का उपयोग करके आरएनए निष्कर्षण की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए बायोएनालाइजर रन का परिणाम दिखाता है। परिणाम जौ के पत्ते के लिए प्रस्तुत किए जाते हैं (नमूने 1 और 2 कम स्टार्च सामग्री के नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं) और जौ के बीज (नमूने 3 और 4 उच्च स्टार्च सामग्री के नमूनों का प्रतिनिधित्व करते हैं)। सभी नमूनों के लिए आरएनए अखंडता (आरआईआर) मूल्य 10 है।

चित्रा 1 शुद्ध आरएनए निकालने के एक प्रतिनिधि जेल को दिखाता है, जहां बायोएनालाइजर का उपयोग करके गुणवत्ता का परीक्षण किया गया था। नमूने 1 और 2 जौ के पत्तों जैसे कम स्टार्च सामग्री के नमूनों के लिए विशिष्ट परिणाम हैं, जहां क्लोरोप्लास्ट से अतिरिक्त rRNA बैंड स्पष्ट हैं। नमूने 3 और 4 ऐसे जौ के बीज के रूप में उच्च स्टार्च सामग्री के नमूनों के लिए प्रतिनिधि परिणाम हैं, 18S और 28S rRNA दिखा । कृपया ध्यान दें कि क्लोरोप्लास्ट rRNA के कारण, पत्तियों के नमूनों जैसे हरे पौधे के ऊतकों के लिए कोई स्वचालित आरआईएन मूल्य की गणना नहीं की जा सकती है। हालांकि, अखंडता और उच्च गुणवत्ता नेत्रहीन किसी भी गिरावट उत्पादों, जो आम तौर पर कम आणविक धब्बा के रूप में प्रकट होता है की अनुपस्थिति के लिए पता लगाया जा सकता है । जौ के बीज जैसे उच्च स्टार्च बीज ों के नमूनों के लिए आरआईनए मूल्य आमतौर पर इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके 10 होता है।

इसके अलावा, हम यहां दो कुलीन जौ नस्ल लाइनों (सोफियारा और विक्राना) के एक समय पाठ्यक्रम प्रयोग का एक प्रतिनिधि डेटा भी प्रस्तुत करते हैं जिसका उपयोग माल्टिंग गुणवत्ता19के विश्लेषण के लिए किया जाता है। माल्टिंग प्रक्रिया के दौरान, स्टार्च चीनी में परिवर्तित हो जाता है। इसलिए, नमूने स्टार्च और चीनी सामग्री के अलग-अलग अनुपात वाले ऊतकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। चूंकि औद्योगिक माल्टिंग प्रक्रिया अंकुरण प्रक्रिया के समान है, इसलिए दो जौ लाइनों के ट्रांसक्रिप्टोम, उनकी मालटिंग गुणवत्ता में भिन्न, विश्लेषण किया गया था। आरएनए को जैविक त्रिपेटिये में आत्मसात करने के बाद 2, 24, 48, 72, 120, 144 और 196 घंटे में अंकुरित बीजों से निकाला गया। आरएनए तैयारी और अनुकूलित जौ माइक्रोरे चिप के लिए संकरण के रूप में ऊपर वर्णित किया गया । चित्रा 2 गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) रिपोर्ट(चित्रा 3)और पता लगाए गए संकेतों के लिए हिस्टोग्राम भूखंड में दिए गए माइक्रोरे हाइब्रिडेशन से सामान्यीकृत ग्रिड को इंगित करता है। ग्रिड चिप के प्रत्येक कोने से व्युत्पन्न संकेतों का उदाहरण देता है, जिसमें पृष्ठभूमि और स्पाइक-इन रीड आउट अंशांकन के लिए उपयोग किए जाते हैं। हिस्टोग्राम संबंधित संकेत तीव्रता के साथ पता लगाने योग्य बिंदुओं के विचलन को इंगित करता है। एक सफल संकरण केवल मामूली आउटलियर के साथ एक व्यापक गौसियन के आकार का वक्र देता है जैसा कि आंकड़े में दिखाया गया है। विफल संकरण एक तरफ ("हरे राक्षसों") की ओर एक मजबूत बदलाव में परिणाम कर सकते हैं।

अंत में, स्वीकार्य मूल्यों का एक प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 3के कॉलम 4 में दिखाया गया है । प्रदर्शन किए गए प्रयोगों की विश्वसनीयता को इंगित करने के लिए, परिणामों का आगे जीनस्प्रिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। एकत्र किए गए डेटा को प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। पीसीए वेक्टर के रूप में चयनित डॉट्स (जीन) के मूल्यों को एकीकृत करता है। उपयोग किए जाने वाले मूल्यांकन किए गए बिंदुओं की संख्या कई सौ से पूरी चिप में भिन्न हो सकती है और उपयोग किए गए सॉफ़्टवेयर पर निर्भर है। प्रत्येक चिप (नमूना) एक मूल्य (वेक्टर) में परिणाम है कि विश्लेषण डॉट्स के लिए एकीकृत संकेत तीव्रता से हुई । इसलिए, ग्राफ (पीसीए) में सापेक्ष स्थिति नमूनों की समानता को एक दूसरे के लिए इंगित करती है। करीब नमूने हैं, और अधिक समान वे कर रहे हैं । तकनीकी प्रतिकृति जैविक लोगों की तुलना में एक साथ करीब होना चाहिए, और एक नमूने की जैविक प्रतिकृति अलग समय बिंदुओं, ऊतकों या शर्तों से नमूनों की तुलना में एक साथ करीब क्लस्टर चाहिए ।

Figure 1
चित्रा 1: बायोएनालाइजर के साथ आरएनए की गुणवत्ता की जांच करने के बाद प्राप्त इलेक्ट्रोफोरेसिस फ़ाइल रन सारांश। नमूने 1 और 2 जौ के पत्ते के ऊतक हैं जैसा कि क्लोरोप्लास्ट से अतिरिक्त राइबोसोमल बैंड द्वारा इंगित किया गया है। नमूने 3 और 4 18S और 28S rRNA बैंड के साथ जौ बीज ऊतक दिखाया गया है । एक रिन फैक्टर हमेशा पत्ती जैसे हरे ऊतकों के लिए गणना नहीं की जाती है लेकिन जेल के अनुसार, आरएनए की गुणवत्ता बहुत अच्छी है। नमूनों के लिए RIN मूल्य 3 और 4 10 है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: सफल जौ माइक्रोव्यूरे संकरण से QC रिपोर्ट। A + चिप के सभी कोनों से ग्रिड पर पता चला संकेतों को इंगित करता है। हिस्टोग्राम पृष्ठभूमि घटाव के बाद logarithm के रूप में संकेत तीव्रता (फ्लोरेसेंस) के अनुसार वर्गीकृत संकेतों की संख्या से पता चलता है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: संकरण और स्कैनिंग के बाद गुणवत्ता नियंत्रण (क्यूसी) का सारांश। हाइब्रिड स्लाइड के लिए मूल्य कॉलम 2 (मूल्य) में दिए गए हैं और स्वीकार्य मूल्यों की सीमा कॉलम 4 में दिखाई गई है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वॉश चैंबर असेंबली सामग्री और लेबल उद्देश्य
डिश 1 खाली, अगले दिन तक लैब बेंच पर छोड़ दें वॉश बफर 1 अगले दिन भरें, माइक्रोव्यूरी स्लाइड्स को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया
डिश 2 एक माइक्रोरेरी स्लाइड रैक और एक छोटा चुंबकीय हलचल बार जोड़ें; "वॉश बफर 1" के साथ लेबल, अगले दिन तक लैब बेंच पर छोड़ दें अगले दिन वॉश बफर 1 के साथ माइक्रोरेस्लाइड धोने के लिए इस्तेमाल किया
डिश 3 एक छोटा चुंबकीय हलचल बार जोड़ें, "वॉश बफर 2" के साथ लेबल और 37 डिग्री सेल्सियस मिनी इनक्यूबेटर में रखें। 37 डिग्री सेल्सियस मिनी इनक्यूबेटर के अंदर अगले दिन वॉश बफर 2 के साथ माइक्रोरेरी स्लाइड धोने के लिए इस्तेमाल किया

तालिका 1: वॉश चैंबर विधानसभाओं की तैयारी।

चरणों पकवान वॉश बफर तापमान समय
Disassembly 1 1 सब जगह जितनी जल्दी हो सके
(चरण 4.13)
पहले धोएं 2 1 सब जगह 1 मिन
(चरण 4.14)
दूसरा वॉश 3 2 37 डिग्री सेल्सियस 1 मिन
(चरण 4.15)

तालिका 2: इनक्यूबेशन तापमान और धोने कक्ष विधानसभाओं के लिए समय ।

Discussion

वर्णित विधि उच्च उपज और उच्च गुणवत्ता वाले आरएनए अर्क(चित्र ा 1)के लिए अत्यधिक प्रजनन योग्य परिणाम प्रदान करती है। हमारे अनुभव के आधार पर, हम विश्लेषण के लिए एक जीनोटाइप, चरण या स्थिति के लिए तीन जैविक प्रतिकृति की सलाह देते हैं। सांख्यिकीय रूप से सार्थक मतभेदों का पता लगाने में सक्षम होने के लिए, एमआरएनए की सामान्य बहुतायत पर विचार किया जाना चाहिए। कृपया ध्यान दें, हालांकि, आरएनए निष्कर्षण कदम के लिए ट्रिपलिकेट्स में 200 मिलीग्राम ऊतक नमूनों की शुरुआती मात्रा आवश्यक है। इसलिए, उन प्रयोगों के लिए जिनके पास आनुवंशिक रूप से संशोधित संयंत्र सामग्री जैसे सीमित मात्रा में नमूने होते हैं, यह विधि उचित नहीं हो सकती है।

माइक्रोव्यू संकरण के दौरान, निम्नलिखित चरण सबसे महत्वपूर्ण हैं: (1) नमूनों को गैसकेट स्लाइड (चरण 4.7) और (2) संकरण (चरण 4.13 और 4.14) के बाद सरणी धोने में लोड किया जाता है। बुलबुला गठन और तरल रिसाव से बचने के लिए नमूना लोडिंग बहुत सावधानी से किया जाना चाहिए। लोडेड नमूनों वाले गैसकेट स्लाइड पर माइक्रोरेस्लाइड डालते समय सावधानी आवश्यक है: डीएनए-साइड (स्पॉटेड जांच के साथ) को संकरण की अनुमति देने के लिए नीचे का सामना करना पड़ रहा होना चाहिए। माइक्रोरे को धोने के लिए, दूसरा वॉश स्टेप विशेष रूप से महत्वपूर्ण है: यहां, स्लाइड्स को वॉश बफर 2 से हटाने के लिए स्लाइड्स पर बफर कलाकृतियों से बचने के लिए बहुत धीरे-धीरे (10 एस) किए जाने की जरूरत है, जो डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण में हस्तक्षेप कर सकते हैं।

हाइब्रिडाइजेशन प्रयोग से परिणाम प्राप्त करने के लिए जो डाउन-स्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषण के लिए पात्र हैं, किसी को कुछ महत्वपूर्ण मानदंडों का पालन करना चाहिए। ऊपर प्रोटोकॉल के प्रदर्शन के बाद उत्पन्न होने वाली क्यूसी रिपोर्ट में इस बात का अच्छा विचार दिया गया है कि क्या सुधार किया जाना चाहिए, और कौन सा डेटा उपयोग करने योग्य स्थिति में है(चित्रा 3)। प्राप्त पहली जानकारी विजुअलाइज्ड ग्रिड(चित्रा 2)है। यहां, कोई सीधे देख सकता है कि क्या फ्लोरेसेंस रीड-आउट के लिए सभी क्षेत्रों को ठीक से गठबंधन किया गया है। यदि एक नेत्रहीन पता लगाने योग्य बदलाव है, तो यह अन्य सभी मूल्यों (पृष्ठभूमि, संकेत तीव्रता, आदि) को प्रभावित करेगा और इस चिप से बाहर पढ़ने का उपयोग नहीं किया जा सकता है। अवलोकन (सभी आउटलर्स का स्थानिक वितरण) पर, कोई भी आसानी से किसी भी संदूषण (जैसे, धूल या बाल) को हाजिर कर सकता है, जिसने परिणाम को प्रभावित किया। चिप को धीरे-धीरे उड़ाने और रीस्कैन करके गंदगी को हटाया जा सकता है। ऊपर उल्लिखित सिग्नल प्लॉट के हिस्टोग्राम के परिणामस्वरूप एक व्यापक गॉस के आकार का वक्र होना चाहिए, जिसमें केवल मामूली आउटलर्स(चित्रा 2)शामिल हैं। विश्लेषण किए गए ऊतक(चित्रा 1)के आधार पर, यह वक्र अलग दिख सकता है और दो चोटियों, या कंधे के साथ एक प्रमुख चोटी दिखाई दे सकता है। इससे डेटा की गुणवत्ता प्रभावित नहीं होगी। केवल एक मजबूत स्थानांतरित चोटी, या किनारों पर उच्च संकेत समस्याओं का संकेत देते हैं, जैसे "हरे राक्षस" (बहुत अधिक फ्लोरेसेंस तीव्रता), जिसे धोने से नहीं हटाया जा सकता है और चिप निर्माता को सूचित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, "मीडियन सिग्नल्स के लिए स्थानिक वितरण ग्राफ" एक सामान्य मूल्य के आसपास भिन्न होना चाहिए। यह विश्लेषण चिप की सामान्य तीव्रता readout के आधार पर, 40 और 100 के बीच सीमा में होना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण गुणवत्ता नियंत्रण डेटा में स्पाइक का मूल्यांकन है: संकेतों में स्पाइक के लिए लॉग-ग्राफ के परिणामस्वरूप रैखिक और नियमित लाइन होनी चाहिए। अंत में, "मूल्यांकन मैट्रिक्स" की तालिका प्राप्त परिणामों का एक अच्छा और विश्वसनीय दृश्य देती है। यहां निर्माता मूल्यों की एक श्रृंखला प्रदान करता है जिसे उत्कृष्ट, अच्छे और मूल्यांकन(चित्रा 3)के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। हमारे अनुभव के अनुसार, कुछ मूल्यों को हमेशा सभी चिप्स के लिए लागू नहीं किया जा सकता है। चावल कस्टम चिप्स के लिए, "नॉनकंट्रोल वैल्यू" अक्सर सीमा से बाहर था, लेकिन आगे डेटा प्रसंस्करण को काफी प्रभावित नहीं करता है। इसके अलावा, ऊतक, जीव और चिप के सामान्य उत्पादन के आधार पर "नेगकंट्रोल" के लिए सीमा को बढ़ाया जा सकता है ; 80। मूल्य E1 मेड सीवी के लिए मूल्यांकन के लिए सीमा हमारे अनुभव के अनुसार <8 के बजाय <9 तक बढ़ाई जा सकती है। इसके बाद, सभी चिप का उचित मूल्यांकन डेटा पढ़कर संभव है। सामान्य तौर पर, किसी को हमेशा ध्यान रखना चाहिए कि स्वतंत्र जैविक प्रतिकृति हमेशा सबसे विश्वसनीय परिणाम देती है।

अन्य तरीकों की तुलना में इस तकनीक का लाभ इस तथ्य में निहित है कि यह प्रतिलेखन प्रोफाइलिंग के लिए लागत प्रभावी, उच्च थ्रूपुट विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इसके अलावा, डाउनस्ट्रीम डेटा विश्लेषण पाइपलाइन आसान और अधिक स्थापित है। फायदे के बावजूद, इस तकनीक की कुछ सीमाएं हैं, जैसे जीन की संख्या जिसका विश्लेषण किया जा सकता है। माइक्रोसरणी केवल सरणी पर पहले से देखा जांच जीन के विश्लेषण की सुविधा कर सकते हैं । इसलिए, यह तकनीक केवल अनुक्रमित जीनोम और पूरी तरह से एनोटेटेड जीन वाली पौधों की प्रजातियों पर लागू होती है। हम कल्पना करते हैं कि माइक्रोव्यू-आधारित ट्रांसक्रिप्टोमिक्स न केवल जीन अभिव्यक्ति प्रोफाइलिंग के लिए बल्कि जीन नियामक नेटवर्क विश्लेषण और ट्रांसक्रिप्टोम-वाइड एसोसिएशन अध्ययन जैसे अन्य डाउनस्ट्रीम बायोइन्फॉर्मेटिक्स पाइपलाइनों के लिए भी बहुत उपयोगी और प्रासंगिक बना रहेगा ।

Disclosures

लेखकों के पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं हैं ।

Acknowledgments

इस काम को सीजीआईएआर विषयगत क्षेत्र ग्लोबल राइस एग्री-फूड सिस्टम सीआरपी, राइस, तनाव-सहिष्णु चावल फॉर अफ्रीका और दक्षिण एशिया (स्ट्रासा) फेज-3, और आईजेडएन (इंटरडिसिप्लिनरी सेंटर फॉर क्रॉप प्लांट रिसर्च, हाले (साले), जर्मनी के तहत समर्थन दिया गया है । हम उसे उत्कृष्ट तकनीकी सहायता और डॉ इसाबेल मारिया मोरा-Ramirez गेहूं चिप के साथ जानकारी और अनुभव साझा करने के लिए मैंडी Püffeld शुक्रिया अदा करता हूं । हम डॉ रहोंडा मेयेर (आरजी हेटरोसिस, आईपीके गेटरस्लेबेन, जर्मनी) को टिप्पणियों और पांडुलिपि को गंभीर रूप से पढ़ने के लिए धन्यवाद देते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ß-mercaptoethanol Roth 4227.3 Add 300 ul to 20 mL RNA Extraction Buffer immediately prior to use
Bioanalyzer 2100 Agilent Technologies To determine quality and quantity of RNA extract
Crushed ice maker Various brands To keep samples on ice during sample processing
Dewar flask Various brands Used as liquid nitrogen container
Ethanol, absolute Roth 9065.1
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242 Kit components:
2X Hi-RPM Hybridization Buffer
25X Fragmentation Buffer
10X Gene Expression Blocking Agent
Gene Expression Wash buffer Kit Agilent Technologies 5188-5325 Kit components:
Gene Expression Wash Buffer 1
Gene Expression Wash Buffer 2
Triton X-102
Heat block Various brands It is recommended to have at least one heat block for 1.5 ml tubes and another one for 2.0 ml tubes
Hybridization oven Agilent G2545A Stainless-steel oven designed for microarray hybridization From Sheldon Manufacturing, used to hybridize the sample in microarray overnight.
Hybridization gasket slide kit Agilent G2534-60014
iQAir air cleaner To ensure that the experiment is conducted in low-ozone area
Isopropanol Roth 9866.5
Lint-free paper, Kimwipes Kimberly-Clark Professional KC34155
Low Input Quick Amp Labeling Kit Agilent Technologies 5190-2305 Kit components:
T7 Primer
5x First Strand Buffer
0.1M DTT
10 mM dNTP Mix
AffinityScript RNAse Block Mix
5x Transcription Buffer
NTP Mix
T7 RNA Polymerase Blend
Nuclease-free water
Cyanine 3-CTP
Metal spatula, small Ensure that the small metal spatula can fit in the microfuge tubes to ensure easy scooping of samples.
Microarray scanner Agilent Technologies Agilent SureScan or Agilent C microarray scanner are recommended
Microfuge tubes, nuclease-free Various brands 2.0 mL and 1.5 mL volume
Microcentrifuge Eppendorf 5810 R It is recommended to have at least one ambient and cold temperature microfuge with rotors that can hold 24 each of 1.5 ml and 2.0 ml microfuge tubes
Mini incubator Labnet I5110-230V Any small incubator will do.
Mortar and pestle Any small ceramic or marble mortar and pestle that can withstand cryogenic grinding using liquid nitrogen.
NaCl Sigma-Aldrich S7653-1KG
Nanodrop 1000 Peqlab / Thermofisher
Nuclease-free water Biozym 351900302
One-Color RNA Spike-In Kit Agilent 5188-5282 Kit components:
One color RNA Spike-Mix
Dilution Buffer
Ozone barrier slide cover kit Agilent G2505-60550 Optional but highly recommended
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free Stratagene Z376426
Phenol:chloroform:isoamyl mixture (25:24:1) Roth A156.2
Pipette tips, nuclease free, filter tips Various brands To accommodate 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
Pipettor set Various brands For 2, 20, 20, 100, 200 and 1000 ul volumes
RNA Extraction Buffer 10 mM Tri-HCl pH 8.0
150 mM LiCl
50 mM EDTA
1.5% EDTA
15 ul/mL β-mercaptoethanol
We routinely use Roth or Sigma chemicals; Add β-mercaptoethanol fresh daily
RNase-free DNase set Qiagen 79254
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RW
Buffer RPE
Nuclease-free water
RNeasy Plant Mini Kit Qiagen 74904 Kit components:
RNeasy mini spin column (pink)
QIAshredder spin column (purple)
1.5 ml collection tubes
2 ml collection tubes
Buffer RLT
Buffer RLC
Buffer RW1
Buffer RPE
Nuclease-free water
Slide holders for DNA microarray scanner Agilent G2505-60525
Slide staining dish with removable rack DWK Life Sciences 900200 Fisher Scientific 08-812 We recommend DWK Life Sciences Wheaton™ Glass 20-Slide Staining Dish with Removable Rack (Complete with dish, cover, and glass slide rack)
Sodium chloride Roth P029.1
Ultralow temperature freezer Various brand Capable of storing sample at -80 °C
Vortex mixer Various brands At least one for single tube vortex-mixer and another one for that can vortex-mix multiple tubes

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References

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