अत्यधिक रोगजनक एच5एन1 और एवियन एच7एन9 वायरस से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ उच्च टिटर संक्रामक इन्फ्लूएंजा स्यूडोटाइप कणों का उत्पादन

Immunology and Infection

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Summary

यह प्रोटोकॉल दो इंफ्लूएंजा ए उपभेदों से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ उच्च-टिटर संक्रामक वायरल छद्म कणों (पीपी) का उत्पादन करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का वर्णन करता है और उनकी संक्रामकता को कैसे निर्धारित किया जाता है। यह प्रोटोकॉल विभिन्न लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन के साथ किसी भी अन्य प्रकार के लिफाफे वाले वायरस के पीपीएस को विकसित करने के लिए अत्यधिक अनुकूलनीय है।

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Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).

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Abstract

अत्यधिक रोगजनक एवियन इंफ्लूएंजा ए वायरस H5N1 (HPAI H5N1) और मनुष्यों के लिए H7N9 और उनकी घातकता के सामयिक प्रत्यक्ष संचरण गंभीर सार्वजनिक स्वास्थ्य के मुद्दों और एक महामारी की संभावना का सुझाव है । हालांकि, वायरस के बारे में हमारी आणविक समझ प्रारंभिक है, और यह चिकित्सकीय लक्ष्यों के रूप में अपने लिफाफा प्रोटीन के जैविक गुणों का अध्ययन करने के लिए और संक्रमण को नियंत्रित करने के लिए रणनीतियों को विकसित करने के लिए आवश्यक है । हमने एवियन इन्फ्लूएंजा वायरस का अध्ययन करने के लिए एक ठोस वायरल छद्म कण (पीपी) मंच विकसित किया, जिसमें इसके हेमग्ग्लूटिनिन (एचए) और न्यूरामिनिड्स (एनए) लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन, एचएएस और एनआईएस की पुनर्वर्गीकरण विशेषताओं का कार्यात्मक विश्लेषण शामिल है, दवा विकास और वैक्सीन डिजाइन के प्रयोजनों के लिए रिसेप्टर्स, ट्रोपिज्म, एंटीबॉडी, निदान, संक्रमितता को बेअसर करना। यहां, हम दो इंफ्लूएंजा ए उपभेदों (HAPI H5N1 और 2013 एवियन एच7एन9) से लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (एचए, एनए) के साथ पीपीएस स्थापित करने के लिए एक प्रायोगिक प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। उनकी पीढ़ी कुछ वायरस की क्षमता पर आधारित है, जैसे कि मूत्र ल्यूकेमिया वायरस (एमएलवी), लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन को पीपी में शामिल करने के लिए। इसके अलावा, हम यह भी विस्तार करते हैं कि इन पीपीएस को आरटी-क्यूपीसीआर के साथ कैसे निर्धारित किया जाता है, और एचएएस और एनआईएस की उत्पत्ति के आधार पर देशी और बेमेल वायरस पीपीएस का संक्रमितता का पता लगाया जाता है। यह प्रणाली अत्यधिक लचीला और अनुकूलनीय है और इसका उपयोग लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन के साथ वायरल पीपीएस स्थापित करने के लिए किया जा सकता है जिसे किसी अन्य प्रकार के वायरस में शामिल किया जा सकता है। इस प्रकार, इस वायरल कण मंच कई शोध जांच में जंगली वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

एक वायरल कण का मिशन संक्रमित मेजबान कोशिका से अपने जीनोम को गैर-संक्रमित मेजबान कोशिका तक ले जाना और इसे प्रतिकृति-सक्षम रूप1में साइटोप्लाज्म या नाभिक में वितरित करना है। यह प्रक्रिया शुरू में सेल रिसेप्टर्स की मेजबानी के लिए बाध्यकारी द्वारा ट्रिगर की जाती है, जिसके बाद विरोन और सेलुलर झिल्ली का संलयन होता है। इन्फ्लूएंजा वायरस की तरह लिफाफे वाले वायरस के लिए, स्पाइक ग्लाइकोप्रोटीन रिसेप्टर बाइंडिंग और फ्यूजन1,2के लिए जिम्मेदार हैं। वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (उदाहरण के लिए, पायजेन्स, एंटीजन), वायरस लाइफसाइकिल दीक्षा (बाध्यकारी और संलयन), वायरल रोगजनन, इम्यूनोजेनिकिटी, होस्ट सेल एपोप्टोसिस और सेलुलर ट्रोपिज्म, सेलुलर एंडोसाइटिक पाथवे, साथ ही इंटरस्पीट्स ट्रांसमिशन और रेसॉर्टमेंट1,3,4,5,6,7जैसे कई महत्वपूर्ण गुणों और घटनाओं में शामिल हैं । वायरल लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन पर शोध से हमें वायरल इंफेक्शन प्रक्रिया के कई पहलुओं को समझने में मदद मिलेगी। छद्म टाइप किए गए वायरल कण (पीपी), जिसे छद्म विग्रह या छद्म लेख भी कहा जाता है, को छद्म टाइपिंग तकनीक8,9,10के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है। इस तकनीक का उपयोग हेपेटाइटिस सी11,12,हेपेटाइटिस बी13,वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीएसवी)14,15और इन्फ्लूएंजा वायरस16,17, 18,19सहित कई वायरसों के छद्म कणों को विकसित करने के लिए किया गया है । यह तकनीक लेंटिवायरस या अन्य रेट्रोवायरस के गैग-पोल प्रोटीन पर आधारित है।

छद्म टाइप किए गए वायरल कणों को वायरल लिफाफे ग्लाइकोप्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड, एक रेट्रोवायरल पैकेजिंग प्लाज्मिड को लिफाफा एनवी जीन गायब करके तीन-प्लाज्मिड सिस्टम का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है, और पीपी निर्माता कोशिकाओं में एक अलग रिपोर्टर प्लाज्मिड। रेट्रोवायरस अपने गैग प्रोटीन द्वारा इकट्ठा किया जाता है, और यह एक संक्रमित कोशिका झिल्ली से कलियों को व्यक्त करता है जो वायरस लिफाफा प्रोटीन1को व्यक्त करता है। इसलिए, इन्फ्लूएंजा एचए और एनए व्यक्त करने वाली सेलुलर झिल्ली पर कलियों का उत्पादन करने के लिए रेट्रोवायरस गैग प्रोटीन का उपयोग करके उच्च टिटर इन्फ्लूएंजा पीपीएस प्राप्त करना संभव है। हमारे पिछले अध्ययनों में, सभी संयोजनों में एचएएस/एनआईएस कार्यात्मक थे और वायरल जीवन चक्र16,17,18,20, 21में अपने इसी कार्यों को करने में सक्षम थे । इन पीपीएस का उपयोग इन्फ्लूएंजा जैविक विशेषताओं की जांच करने के लिए किया जाता है, जिसमें हेमग्ग्लूटिनेशन, न्यूरामिनिड्स गतिविधि, एचए-रिसेप्टर बाध्यकारी ट्रोपिज्म और संक्रमितता शामिल हैं। क्योंकि एचए और एनए वायरल जीवन चक्र में महत्वपूर्ण सतह कार्यात्मक प्रोटीन हैं, इंफ्लूएंजा के विभिन्न उपभेदों से प्राप्त बेमेल हास और नास आंशिक रूप से उनदोनों के बीच पुनर्वर्गीकरण प्रदर्शित कर सकते हैं । यहां, हम तीन-प्लाज्मिड छद्म टाइपिंग सिस्टम का उपयोग करके दो एचए और दो एनआईए (एचपीएआई एच5एन1 स्ट्रेन और एच7एन9 दाग से व्युत्पन्न) के संयोजन से आठ प्रकार के इन्फ्लूएंजा पीपीएस उत्पन्न करते हैं। इन आठ प्रकार के पीपीएस में दो देशी पीपीएस, एच5एन1पीपी, एच7एन9पीपी शामिल हैं; दो बेमेल पीपीएस, (H5 +N9) पीपी, (H7 +N1) पीपी; और चार पीपीएस केवल एक ही ग्लाइकोप्रोटीन (एचए या एनए), एच5पीपी, एन1पीपी, एच7पीपी, एन9पीपी को शरण देते हैं । एच5एन1 और एच7एन9 जैसे इंफ्लूएंजा वायरस पर अध्ययन, जैव सुरक्षा आवश्यकताओं द्वारा सीमित हैं । जंगली इन्फ्लूएंजा वायरस उपभेदों के सभी अध्ययनों को जैव सुरक्षा स्तर 3 (बीएसएल-3) प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए। छद्म टाइप वायरल पार्टिकल तकनीक का उपयोग बायोसेफ्टी लेवल 2 (बीएसएल-2) सेटिंग में कृत्रिम विरियन को पैकेज करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, पीपीएस अपने दो प्रमुख ग्लाइकोप्रोटीन के आधार पर इन्फ्लूएंजा वायरस प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक सुरक्षित और उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं: हेमैगग्लूटिनिन (एचए) और न्यूरामिनिडसे (एनए)।

यह प्रोटोकॉल तीन-प्लाज्मिड कॉट्रांसफेक्शन रणनीति (चित्रा 1में अवलोकन), पीपीएस की मात्रा कैसे निर्धारित करना है, और संक्रमण का पता लगाने के साथ इन पीपीएस की पीढ़ी का वर्णन करता है। पीपी उत्पादन में तीन प्रकार के प्लाज्मिड(चित्रा 1)शामिल हैं। गैग-पोल जीन, जो रेट्रोवायरस गैग-पोल प्रोटीन को एन्कोड करता है, को रेट्रोवायरस पैकेजिंग किट से क्लोन किया गया था और पीसीडीएनए ३.१ प्लाज्मिड में डाला गया था और pcDNA-Gag-Pol नाम दिया गया था । उन्नत ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) जीन, जो ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन को एन्कोड करता है, को PTRE-EGFP वेक्टर से क्लोन किया गया था, जिसे पीसीडीएनए 3.1 प्लाज्मिड में डाला गया था, और जिसे पीसीडीएनए-जीएफपी कहा जाता है। क्लोनिंग के दौरान, एक प्राइमर के माध्यम से एक पैकेजिंग सिग्नल () अनुक्रम जोड़ा गया था। एचए और एनए जीन को क्रमशः पीवीआरसी प्लाज्मिड में क्लोन किया गया, जिसका नाम क्रमश पीवीआरसी-एचए और पीवीआरसी-एनए था । पिछले प्लाज्मिड फ्यूजन प्रोटीन को एन्कोड करता है और इसे ब्याज के किसी अन्य फ्यूजन प्रोटीन के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। हमारे छद्म टाइपिंग प्लेटफॉर्म में दो ग्लाइकोप्रोटीन एक्सप्रेशन प्लाज्मिड्स शामिल हैं: पीवीआरसी-एचए और पीवीआरसी-एनए। यह बीएसएल-2 सेटिंग में विभिन्न वायरस उपभेदों के बीच पुनर्वर्गीकरण पर अनुसंधान को सरल बना सकता है।

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Protocol

1. दिन 1: सेल संस्कृति और सीडिंग

  1. मानव भ्रूण गुर्दे (HEK) 293T/17 कोशिकाओं में 60 मिमी व्यंजन ों में Dulbecco संशोधित आवश्यक माध्यम (DMEM) के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 100 U/mL पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (DMEM पूरा माध्यम, डीसीएम) 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)इनक्यूबेटर में लगभग 80% तक।
    नोट: HEK 293T/17 कम मार्ग कोशिकाओं की सिफारिश कर रहे हैं ।
  2. ध्यान से फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस) 1x के 5 मिलील के साथ कोशिकाओं को धोलें।
    नोट: HEK 293T/17 कोशिकाओं की मैनुअल हैंडलिंग बहुत कोमल होना चाहिए, क्योंकि वे आसानी से अलग ।
  3. पीबीएस निकालें और 0.25% ट्राइप्सिन-एथिलीन डायमाइन टेट्राएटिक एसिड (EDTA) समाधान के 1 mL के साथ कोशिकाओं को अलग करें। डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 5% से अधिक 5 मिन के लिए रखें जब तक कि कोशिकाओं को विप्रेरित न किया जाए।
  4. डीसीएम के 5 एमएल जोड़कर ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करें। कोशिकाओं को कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एकल-सेल निलंबन में तितर-बितर करें।
  5. सेल निलंबन को एक प्रीचिलग्ड 15 मिलीआर सेंट्रलाइज ट्यूब पर स्थानांतरित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 250 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  6. जितना संभव हो उतना अधिस्थान के रूप में Decant । डीसीएम मीडियम के 6 mL के साथ सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें और कोशिकाओं की गिनती करें। कोशिकाओं को डीसीएम माध्यम के साथ 1 x 106 कोशिकाओं/mL तक पतला करें।
  7. कोशिकाओं को 6 अच्छी तरह से प्लेट में बीज करें जिसमें प्रति अच्छी तरह से सेल निलंबन के 1 mL के साथ। धीरे-धीरे कोशिकाओं को समान रूप से वितरित करने के लिए प्लेट को थपथपाएं। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर (14-16 घंटे) इनक्यूबेट करें।

2. दिन 2: चार प्लाज्मिड कोट्रांसफेक्शन Lipofection द्वारा मध्यस्थता

  1. एक उल्टे प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान और घनत्व की जांच करें। आदर्श रूप से, कोशिकाओं को ट्रांसफेक्शन में लगभग 85% अनुकूल होना चाहिए। मध्यम को प्रति अच्छी तरह से सीरम-मुक्त DMEM माध्यम के 1 mL के साथ बदलें, और फिर प्लेट को वापस इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: HEK 293T/17 कोशिकाओं की मैनुअल हैंडलिंग बहुत कोमल होना चाहिए, क्योंकि वे आसानी से अलग ।
  2. सुसंस्कृत कोशिकाओं के प्रत्येक कुएं के लिए ट्रांससंक्रमित होने के लिए, ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान के 8 μL को कम सीरम मीडियम (ट्यूब 1) के साथ 150 माइक्रोन की मात्रा में पतला करें। कमरे के तापमान (आरटी, लगभग 20 डिग्री सेल्सियस) पर 5 न्यूनतम के लिए धीरे-धीरे और इनक्यूबेट मिलाएं।
    नोट: प्रत्येक ट्रांसफेक्शन नमूने के लिए, दो 1.5 मिलीस माइक्रोसेंट्रोफ्यूज ट्यूब, गिने 1 और 2 तैयार करें।
  3. ट्यूब 2 में, कम सीरम माध्यम के 150 माइक्रोन में प्लाज्मिड डीएनए के 2.5 μg पतला।
    नोट: ट्यूब 2 में, तालिका 1में दिखाए गए प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए को पतला करें। एक प्लाज्मिड एन्कोडिंग वेसिकुलर स्टोमेटाइटिस वायरस (वीवीएसवी) जी ग्लाइकोप्रोटीन (प्लाज्मिड एलपीपी-वीएसवीजी) का उपयोग सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया जाता था, क्योंकि वीवीएस कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को संक्रमित करने में सक्षम है। पीसीडीएनए-गैग-पोल और पीसीडीएनए-जीएफपी प्लाज्मिड्स का उपयोग करके इन्फ्लूएंजा लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (पीपीएस) की कमी वाले नकारात्मक नियंत्रण कण उत्पन्न किए गए थे।
  4. 5 मिन ऊष्मायन के बाद, पतला डीएनए को पतला ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के साथ मिलाएं। धीरे मिश्रण और आरटी में एक और 15 मिन के लिए इनक्यूबेट ।
  5. कोशिकाओं और सीरम मुक्त माध्यम युक्त इसी अच्छी तरह से डीएनए लिपिड परिसर जोड़ें । प्लेट को आगे-पीछे हिलाकर धीरे-धीरे मिलाएं।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस में 4-6 घंटे के लिए ऊष्मायन के बाद, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर, माध्यम को हटा दें, और डीएमईएम के 2 एल के साथ बदलें। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में एक और 36-48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर।
    नोट: सीरम मुक्त और एंटीबॉडी मुक्त DMEM के साथ बदलें । इस प्रोटोकॉल में, दो एचए और दो एनआईएस का उपयोग आठ प्रकार के पीपीएस (तालिका 1में दिखाए गए) उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है।

3. 3 दिन: अतिसंवेदनशील कोशिकाओं सीडिंग

  1. संक्रमितपरेता परख के लिए, एक 96 अच्छी प्लेट में 1 x 104 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से प्रत्येक प्रकार की अतिसंवेदनशील कोशिकाओं को बीज करें।
    नोट: इस लेख में संक्रमितपर्य परख करने के लिए दो प्रकार के लक्ष्य सेल का उपयोग करें: एक अल्वेलर-व्युत्पन्न मानव कोशिका रेखा (A549 कोशिकाएं) और मैडिन-डार्बी कैनाइन किडनी (एमडीकेसी) कोशिकाएं। एमडीसीके कोशिकाओं का व्यापक रूप से इन्फ्लूएंजा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है और यह एक अच्छा नियंत्रण हो सकता है। यह कदम लचीला है। किसी भी अन्य लक्ष्य सेल लाइनों अनुसंधान आवश्यकताओं के अनुसार इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रात भर (14-16 घंटे) इनक्यूबेट करें।

4. 4 दिन: छद्म टाइप वायरल कण संग्रह, परिमाणीकरण, और संक्रामक परख

  1. छद्म टाइप वायरल कण संग्रह
    1. माध्यम के रंग की जांच करें। आदर्श रूप से, यह हल्का गुलाबी या थोड़ा नारंगी होना चाहिए। 440-460 एनएम के तहत एक उल्टे फ्लोरोसेंट बायोलॉजिकल माइक्रोस्कोप के साथ कोशिकाओं की जांच करें।
    2. 36-48 घंटे पोस्टट्रांसफेक्शन में, सेल मलबे को खत्म करने के लिए 0.45 माइक्रोन पॉलीविनिलिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली फिल्टर के माध्यम से पासिंग करके पीपीएस की फसल करें।
    3. पीपीएस को छोटी मात्रा में विभाजित करें।
    4. पीपीएस को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: प्रोटोकॉल यहां रोका जा सकता है । हालांकि, इसे प्रोत्साहित नहीं किया जाता है, क्योंकि ठंड और विगलन के बाद पीपीएस की संक्रमितता में तेजी से गिरावट आएगी।
  2. छद्म टाइप वायरल कण मात्राकरण
    1. शुद्ध पीपीएस के 20 μL को 1.5 mL रिबोरकलीज (RNase) - मुफ्त माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    2. 0.24 यू/एमएल बेंजोनेज़ न्यूलीज के 1 माइक्रोन जोड़ें। किसी भी डीएनए और आरएनए संदूषण को खत्म करने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: लक्ष्य आरएनए, आमतौर पर डाउनरेटिव साइटोमेगालोवायरस (सीएमवी) - जीएफपी आरएनए, पीपीएस में पैक किया जाता है और बेंजोनेज़ न्यूकलीज द्वारा अपमानित होने से बच सकता है।
    3. बेंजोनेज न्यूलीज को निष्क्रिय करने के लिए -70 डिग्री सेल्सियस पर नमूना फ्रीज करें।
    4. लिफाफा प्रोटीन पचाने और सीएमवी-जीएफपी आरएनए को छोड़ने के लिए 30 मिन के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रोटीनके इनक्यूबेट के 2 माइक्रोन जोड़ें। प्रोटीन के को 3 मिन के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर निष्क्रिय करें।
    5. वास्तविक समय मात्रात्मक रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन (क्यूआरटी) द्वारा पीपीएस की मात्रा निर्धारित करना- पीसीआर एक सार्वभौमिक जांच के साथ एक कदम आरटी-qPCR किट, फॉरवर्ड प्राइमर 5'-AAAAAGCTGCTCTTTAA-3', रिवर्स प्राइमर 5'-GGGTCTCCCCGTGTGTTAGAC-3', और जांच 5'-FAM-CCCCCAATGAAGCCGAG-TAM-3', एक वास्तविक समय पीसीआर थर्मोसाइकिलर पर । संक्रमितहोने से पहले आरएनए कॉपी नंबर के लिए पीपीएस को सामान्य करें।
  3. संक्रमितता परख
    1. क्यूआरटी-पीसीआर डेटा के हिसाब से हर तरह के पीपीएस को 4 x 105 कॉपी/एमएल (पीपी नॉर्मलाइजेशन) के हिसाब से पतला करें।
    2. Tosyl-Phenylalanine क्लोरोमेथिल-कीटोन (TPCK)- पीपीएस में ४० μg/mL की अंतिम एकाग्रता के लिए ट्रिप्सिन जोड़ें कि बंदरगाह H7N9 HA । 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट अपनी कार्यात्मक उपइकाइयों HA1 और HA2 बनाने के लिए।
      नोट: पीपीएस का इलाज करने की कोई आवश्यकता नहीं है जो टीपीके-ट्राइप्सिन के साथ H5 बंदरगाह है, क्योंकि उनके पास HA1-HA2 दरार साइट पर कई आर्जिनिन और लाइसेन अवशेष हैं। इस बहु-बुनियादी दरार साइट को सर्वव्यापी सेलुलर प्रोटीज़ द्वारा क्लीव किया जा सकता है।
    3. डीएमईएम माध्यम (सीरम-मुक्त) के साथ सामान्यीकृत पीपीएस को 1:1 अनुपात (मात्रा/मात्रा) पर मिलाएं।
    4. जैव सुरक्षा कैबिनेट के लिए अतिसंवेदनशील कोशिकाओं युक्त थाली लाओ ।
    5. अलौकिक Aspirate और पूर्वगरम PBS के 0.1 mL के साथ एक बार कोशिकाओं को धोने।
    6. एक अच्छी तरह से पीपीएस-DMEM मिश्रण के 0.1 mL जोड़ें। प्रत्येक प्रकार के पीपीएस के संक्रमितता परीक्षणों को एक अतिसंवेदनशील सेल लाइन (चित्र ा 2में अवलोकन) में ट्रिपलीकेट करें।
    7. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 4-6 घंटे के लिए 96 वेल प्लेट इनक्यूबेट करें।
    8. अधिवनात को एस्पिरेट करें और डीसीएम के 0.1 एमएल से बदलें।
    9. एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में एक और 24-36 घंटे के लिए 96 अच्छी प्लेट इनक्यूबेट करें।

5. दिन 5 या 6: संक्रमितता का पता लगाने

  1. बायोसेफ्टी कैबिनेट में 96 वेल प्लेट लाएं।
  2. अधिष्णकय और पूर्वगरम PBS के 0.2 मिलील के साथ कोशिकाओं 1x धोने।
  3. पीबीएस निकालें और 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA समाधान के 0.1 mL के साथ कोशिकाओं को अलग करें।
  4. डिश को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर को 3 मिन के लिए तब तक रखें जब तक कि कोशिकाओं को विसेक्टोरी न हो जाए।
    नोट: 5 से अधिक मिन के लिए इनक्यूबेटिंग से बचें, क्योंकि इससे सेल झुरमुट हो जाएगा।
  5. डीसीएम के 0.4 mL जोड़कर ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करें।
  6. कोशिकाओं को कई बार ऊपर और नीचे पाइपिंग करके एकल-सेल निलंबन में फैलाएं।
  7. सेल निलंबन को ठंडा 1.5 मिलीस माइक्रोसेंरिफ्यूज ट्यूब पर स्थानांतरित करें।
  8. फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) के साथ जीएफपी रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं का निर्धारण करें।
    नोट: GFP रिपोर्टर-सकारात्मक लक्ष्य कोशिकाओं के अनुपात का निर्धारण करने के लिए, नियंत्रण नमूनों (पीपीएस-अनुपचारित A549 कोशिकाओं या MDCK कोशिकाओं) का उपयोग कर प्रवाह साइटोमीटर फाटक सेट, और फिर प्रति नमूना १०,००० कोशिकाओं की GFP रिपोर्टर सकारात्मक कोशिकाओं की गिनती ।

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Representative Results

ऊपर वर्णित सामान्य प्रक्रिया के आधार पर, हमने दो समूह एचएएस/एनआईएएस या वीवीएस-जी ग्लाइकोप्रोटीन या नो-लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (टेबल 1में दिखाए गए) के संयोजन से 10 प्रकार के पीपीएस उत्पन्न किए हैं। उनमें से सात संक्रामक हैं । पीपीएस कि बंदरगाह कोई लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन या केवल बंदरगाह ना यहां किसी भी संक्रमितता नहीं दिखा था । इन्फ्लूएंजा पीपी उत्पादन प्रक्रिया का अवलोकन चित्रा 1में किया जाता है । पीपीएस के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ (जैसे, एच5एन1पीपी) को चित्रा 3में दिखाया गया है। इन पीपीएस के संक्रमित परख ों के परिणाम चित्र 4में दिखाए गए हैं । सात प्रकार के पीपीएस की संक्रमण का मूल्यांकन प्रति कोशिका (जीसीपी) प्रति जीनोम प्रतियों [संक्रमण की बहुलता (एमओआई)] 20 के मूल्य के समान किया गया था। पीपीएस समूह में H5 शरण, H5N1 की संक्रामकता, (H5 +N9), और H5 क्रमशः एमडीके के लिए 90.05 ± 4.05%, 17.78 ± 1.58%, 10.15 ± 2.85% सेल लाइन A549 और 40.37 ± 4.92%, 5.24 ± 1.32%, 4.88 0± 27% था। पीपीएस समूह में H7 शरण, H7N9 की संक्रामकता, (H7 +N1), और H7 क्रमशः एमडीके के लिए 10.45 ± 2.35%, 6.75 ± 1.37%, 1.23 ± 0.33% और 7.61 ± 1.04%, 4.12 ± 1.29%, 1.08 ± 0.02% था। पीपीएस के संक्रमित परखों के लिए, विशेष रूप से HApp (H5pp, H7pp), बहिर्जात neuraminidase नहीं जोड़ा गया था । इस संक्रमित परख में, एमडीसीके कोशिकाओं को पीपीएस संक्रामकता का परीक्षण करने के लिए नियंत्रण सेल लाइन के रूप में भी उपयोग किया गया था। वीएसवीजीपीपी की संक्रामकता A549 के लिए 20.9 ± 2.00% और एमडीसीके कोशिकाओं के लिए 16.02 ± 2.41% थी। डेल्टा-लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन पीपी (एजेनवी पीपी) ने हमारे अध्ययन में कोई संक्रामकता नहीं दिखाई । इन आंकड़ों से यह भी पता चला है कि विविध वायरस उपभेदों से HAs/NAs सफलतापूर्वक संक्रामक वायरल कणों उत्पन्न करने में सक्षम हैं । एक साथ लिया, हमारे छद्म टाइपिंग मंच संक्रामक छद्म टाइप वायरल इंफ्लूएंजा अनुसंधान में इस्तेमाल कणों का विकास कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1: इन्फ्लूएंजा पीपी उत्पादन प्रक्रिया का अवलोकन। (A)पैकेजिंग प्लाज्मिड pcDNA-Gag-pol, रिपोर्टर प्लाज्मिड pcDNA-GFP, और लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन अभिव्यक्ति प्लाज्मिडपी-एचए और पीवीआरसी-एनए, पीपी उत्पादक HEK 293/17 कोशिकाओं में प्रतिमानवसंक्रमित हैं । (ख)एचईके 293/17 कोशिकाओं में, गैग-पोल पॉलीप्रोटीन को एक अज्ञात तंत्र द्वारा कोशिका झिल्ली में संश्लेषित और ले जाया जाता है । ग्लाइकोप्रोटीन एचए और एनए को गुप्त मार्ग के माध्यम से कोशिका झिल्ली पर ले जाया जाता है और लंगर डाला जाता है। रिपोर्टर प्लाज्मिड पीसीडीएनए-जीएफपी को सिंगल-फंसे हुए जीएफपी जीनोमिक आरएनए में लिखा गया है । (ग)परिवहन के दौरान या बाद में, गैग-पोल प्रोटीन साई-आरएनए पैकेजिंग संकेतों के माध्यम से एकल फंसे हुए जीएफपी जीनोमिक आरएनए की भर्ती करता है, जिससे पूर्व नवोदित परिसरों का निर्माण होता है । (D)इकट्ठे हुए गैग-पोल-आरएनए परिसर झिल्ली वक्रता को प्रेरित करता है, जिससे कली का गठन होता है। नवोदित के दौरान, वायरल लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन हास/नास नवजात कणों में शामिल कर रहे हैं । नवोदित कोशिका झिल्ली से कण चुटकी के रूप में पूरा हो गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: संक्रमित परख में समग्र व्यवस्था । प्रत्येक प्रकार के पीपीएस से लेकर एक अतिसंवेदनशील सेल लाइन के संक्रामक परीक्षणों को ट्रिपलकेट में मापा गया। अल्वेलर-व्युत्पन्न मानव कोशिकाएं A549 और एमडीसीके का उपयोग अतिसंवेदनशील कोशिकाओं के रूप में किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: पीपीएस के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोग्राफ। अकेंद्रित (बाएं) और केंद्रित (दाएं) अलौकिक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: सामान्यीकृत पीपीएस की संक्रामकता। संक्रमित कोशिकाओं (एन = 3) के औसत ± मानक विचलन (एसडी) प्रतिशत के रूप में संक्रमितता प्रस्तुत की जाती है। पीपीएस की संक्रमितता का आकलन दो सेल लाइनों, A549 और MDCK कोशिकाओं में किया गया था । सात प्रकार के पीपीएस ने दो लक्ष्य कोशिकाओं में विभिन्न संक्रमितता प्रोफाइल प्रदर्शित किए। पीपीएस कि केवल बंदरगाह एनए यहां नहीं दिखाया गया है क्योंकि वे किसी भी संक्रमितता प्रकट नहीं किया । पीपीएस कि बंदरगाह कोई लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (Τenv) भी हमारे अध्ययन में कोई संक्रामकता दिखाया । संक्रमितता के प्रतिशत ने प्रति नमूना १०,००० कोशिकाओं में जीएफपी रिपोर्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं के अनुपात को दर्शाया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्लाज्मिड तैयारी
प्लाज्मिड (μL, 0.1 μg/μL) एच5एन1 (H5+N9) H7N9 (H7+N1) H5 N1 H7 N9 वीएसवीजी अविन्दव
पीसीडीएनए-गैग-पोल 10.53 10.53 10.53 10.53 11.43 11.43 11.43 11.43 11.43 12.5
पीसीडीएनए-जीएफपी 10.53 10.53 10.53 10.53 11.43 11.43 11.43 11.43 11.43 12.5
पीवीआरसी-एचए 1.98 1.98 1.98 1.98 2.14 - 2.14 - - -
पीवीआरसी-एनए 1.98 1.98 1.98 1.98 - 2.14 - 2.14 - -
पीसीडीएनए-वीएसवीजी - - - - - - - - 2.14 -

तालिका 1: एच5एन1 और एच7एन9 वायरस से प्राप्त एचए और एनए प्रोटीन के संयोजन और 6 अच्छी प्लेट के एक अच्छी तरह से ट्रांसफेक्शन के लिए प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यक मात्रा (मात्रा)। प्लाज्मिड तैयारी की एकाग्रता के अनुसार, प्रत्येक प्लाज्मिड डीएनए की आवश्यक मात्रा की गणना करें। एक कुएं के ट्रैंफेक्शन के लिए प्लाज्मिड डीएनए की कुल मात्रा 2.5 माइक्रोन है। उच्चतम ट्रांसफेक्शन दक्षता और सबसे कम गैर-विशिष्ट प्रभाव प्राप्त करने के लिए, हमने प्लाज्मिड डीएनए और ट्रैंफेक्शन पुनरुत्थान सांद्रता को अलग करके ट्रांसफेक्शन की स्थिति को अनुकूलित किया। अनुकूलन के बाद, चार प्लाज्मिड मात्रा का अनुपात 16:16:1:1 के रूप में सेट किया गया था। 6 अच्छी प्लेट के एक अच्छी तरह से ट्रांसफेक्शन में उपयोग किए जाने वाले ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान की मात्रा 8 माइक्रोन (तालिका में नहीं दिखाया गया है)। एच5एन1 और एच7एन9 वायरस से दो एचए और दो एनआईएस का उपयोग आठ प्रकार के पीपीएस उत्पन्न करने के लिए किया जा सकता है: एच5एन1पीपी, (H5 + N9) पीपी, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) पीपी, H7pp और N9pp । पीपीएस जो नो-लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन (एजेनिव) या केवल बंदरगाह ना ग्लाइकोप्रोटीन को हमारे अध्ययन में कोई संक्रामकता नहीं दिखाता है।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, हम बीएसएल-2 सेटिंग में इन्फ्लूएंजा वायरस छद्म कणों (पीपी) का उत्पादन करने की विधि का वर्णन करते हैं। रिपोर्टर प्लाज्मिड pcDNA-GFP पीपीएस में शामिल है और एक संक्रमित परख में FACS द्वारा पीपीएस की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हमने दो प्रकार की अतिसंवेदनशील सेल लाइनों को चुना क्योंकि उनका व्यापक रूप से इन्फ्लूएंजा अनुसंधान में उपयोग किया जाता है। एमडीसीके कोशिकाएं इन अध्ययनों में उपयोग की जाने वाली चर अमर मानव कोशिकाओं को एक अच्छा नियंत्रण प्रदान करेंगी।

यह प्रोटोकॉल रेट्रोवायरस एमएलवी पर आधारित है, जो एक जीएफपी रिपोर्टर को शामिल कर सकता है और सेलुलर झिल्ली पर कलियों का उत्पादन कर सकता है। इस तकनीक को इन्फ्लूएंजा वायरस कणों4,22,23,24पैकेजिंग के लिए व्यापक रूप से विकसित किया गया है . कुछ अन्य प्रणालियां लेंटिवायरल एचआईवी - 1 छद्म टाइपिंग प्रणाली19,25,26 या बेसक्यूलोवायरस - कीट कोशिका अभिव्यक्ति प्रणाली27, 28,29पर आधारित हैं . कई अन्य रिपोर्टर जीन का उपयोग छद्म कण उत्पादन के लिए भी किया गया है, जैसे ल्यूसिफ़ेरेज (ल्यूमिनेसेंस)30,31,32,33,'गल/लैक्ज़ (लोरीमेट्री द्वारा)34,35,और स्रावित क्षारीय फॉस्फेटेज़36,37। बाजरा एट अल. कोरोनावायरस छद्म टाइप कणों33के संक्रमितता की मात्रा निर्धारित करने के लिए लूसिफ़ेरेज़ परख का इस्तेमाल किया। लूसिफ़ेरेज़ की तुलना में, जीएफपी की हरी फ्लोरेसेंस आसानी से उल्टे फ्लोरोसेंट जैविक माइक्रोस्कोप के साथ देखी जाती है। यह ट्रांसफेक्शन और संक्रमण क्षमता की जांच करने का एक सुविधाजनक तरीका है। इस अध्ययन के लिए, संक्रमितता सीधे FACS के साथ GFP-सकारात्मक कोशिकाओं का पता लगाकर निर्धारित किया जा सकता है।

इस विधि में, कई कदम परिणामों को गंभीर रूप से प्रभावित करते हैं। अनुकूलित सेल घनत्व सफल ट्रांसफेक्शन के लिए एक महत्वपूर्ण कारक है। इस प्रोटोकॉल में, 80-90% कन्फ्लोरेंट की सीमा में एक सेल घनत्व इन्फ्लूएंजा वायरस पीपी उत्पादन के लिए इष्टतम पाया गया था। उच्च या कम सेल घनत्व के परिणामस्वरूप कम ट्रांसफेक्शन दक्षता होगी। उच्च कण उत्पादन के लिए उत्पादक कोशिकाओं की अच्छी शारीरिक स्थिति भी बहुत महत्वपूर्ण है। यही कारण है कि कम सेल पैसेज HEK 293T/17 कोशिकाओं को इस प्रोटोकॉल में पीपीएस का उत्पादन करने की सिफारिश कर रहे हैं । इसके अलावा ट्रांसफेक्शन रिएजेंट की मात्रा और चार प्लाज्मिड ्स मात्राओं का अनुपात ट्रांसफेक्शन दक्षता को भी प्रभावित कर सकता है। उच्चतम ट्रांसफेक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए, इन कारकों को अलग-अलग और उनकी राशि का परीक्षण करके अनुकूलित करने की सिफारिश की जाती है। हम 16:16:1:1 के रूप में चार प्लाज्मिड मात्रा का अनुपात निर्धारित करते हैं और 6 अच्छी प्लेट में एक अच्छी तरह से ट्रैंफेक्शन के लिए 8 माइक्रोन के रूप में ट्रांसफेक्शन पुनरुत्थान की मात्रा निर्धारित करते हैं। एक और मुद्दा कोशिकाओं की हैंडलिंग है । HEK 293T/17producer कोशिकाओं कम आसंजन कर रहे हैं, तो कोशिकाओं की मैनुअल हैंडलिंग बहुत कोमल होना चाहिए । लिपोफेक्शन से कोशिका परगम्यता बढ़ सकती है, और मध्यम में सीरम और एंटीबॉडी साइटोटॉक्सिटी बढ़ा सकती है। ट्रांस-ट्रांस-ट्रांस-ट्रांससंक्रमित एचईसी 293T/17 कोशिकाओं को संस्कृति के लिए सीरम-मुक्त और एंटीबॉडी-मुक्त डीएमईएम का उपयोग करना सबसे अच्छा है। इसके अलावा, संग्रह का समय महत्वपूर्ण है। 36-48 घंटे के बाद ट्रांसफेक्शन पर, सेल सुपरनेटेंट के रंग की जांच की जानी चाहिए ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि यह पीपी संग्रह से पहले गुलाबी या नारंगी-गुलाबी है। पीला अधिनेता इंगित करता है कि माध्यम सेल विकास का समर्थन करने के लिए बहुत अम्लीय है और आमतौर पर खराब पीपी पैदावार की ओर जाता है।

हम एक 6 अच्छी थाली में ट्रांसफेक्शन परख प्रदर्शन किया । अधिक पीपी मात्रा प्राप्त करने के लिए ट्रांसफेक्शन कुओं की संख्या में वृद्धि की जा सकती है और एक ही पीपीएस वाले सुपरनेटेंट को एक साथ पूल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, पीपी उपज बढ़ाने के लिए किसी अन्य प्रकार के जहाजों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 18 माइक्रोन और प्लाज्मिड डीएनए के 5.5 μg का उपयोग एक 60 मिमी डिश में 2.2 x 106 कोशिकाओं के साथ ट्रांसफेक्शन करने के लिए किया जा सकता है। इसी तरह, एक संक्रमित परख एक 24 अच्छी थाली में किया जा सकता है ।

इस तकनीक की सफलता कई कारकों से प्रभावित हो सकती है। इसलिए, प्रक्रिया को विभिन्न प्रकार के वायरस की कण पैकेजिंग के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।

इस प्रोटोकॉल में, एचपीएआई एच5एन1 और एच7एन9 के छद्म वायरल कणों के साथ-साथ उनके पुनश्चन भी उत्पन्न किए गए थे। इस विधि में, हम ऊतक संस्कृति संक्रामक खुराक 50 (TCID50) या पारंपरिक MOI23,38,39के बजाय एकल कोशिका स्तर (प्रति कोशिका जीनोम प्रतियां) पर संक्रमितपरेमें जीएफपी-आरएनए के क्यूआरटी-पीसीआर का उपयोग करते हैं। वायरस संक्रामकता titration तरीकों पट्टिका परख या TCID50 परख, जो दोनों समय लेने वाली और श्रम गहन है पर आधारित हैं । दोनों परख कोशिका रेखाओं में वायरस संक्रमण के कारण दृश्यमान साइटोपैथिक प्रभाव (सीपीई) के माप पर भरोसा करते हैं, इसलिए कम संक्रमण के वायरस को टिटकरना मुश्किल हो सकता है (यानी, इस अध्ययन में H7pp)। हमें लगता है कि यह इंफ्लूएंजा पीपीएस में निहित GFP आरएनए के क्यूआरटी-पीसीआर के साथ पीपीएस को सामान्य करने के लिए एक सुविधाजनक, प्रभावी और तेजी से विधि है।

एक साथ लिया, हमारी तकनीक सुरक्षित और अनुकूलनीय है, और उनके रिसेप्टर्स, ट्रोपिज्म, लिफाफा ग्लाइकोप्रोटीन समारोह, एंटीबॉडी, एंटीवायरस दवा विकास, निदान, और वैक्सीन डिजाइन बेअसर सहित लिफाफे वायरस का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और मूल्यांकन.

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को झेजियांग प्रांतीय चिकित्सा और स्वास्थ्य विज्ञान और प्रौद्योगिकी योजना (अनुदान संख्या, २०१७KY538), हांग्जो म्यूनिसिपल मेडिसिन एंड हेल्थ साइंस एंड टेक्नोलॉजी प्लान (ग्रांट नंबर, OO20190070), हांग्जो मेडिकल साइंस और से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था प्रौद्योगिकी प्रमुख परियोजना (ग्रांट नंबर, 2014Z11) और हांग्जो नगरपालिका स्वायत्त अनुप्रयोग सामाजिक विकास और वैज्ञानिक अनुसंधान (ग्रांट नंबर, 20191203B134) की स्वायत्त अनुप्रयोग परियोजना।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Millipore 70664 Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) Corning 3599 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) Costar 3516 Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) Gibco 11965092 A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum Excell FND500 fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Beckman coulter cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells ATCC CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells ATCC CRL-11268 A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope Olympus BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope Olympus CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019 Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB E3006L Will withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Axygen MCT-150-C 33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF Millipore SLHV033RS an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058021 The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL) Corning 430791 a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K Beyotime ST532 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm) Corning 430166 Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin Sigma T1426 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056

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