Produksjon av høy titer smittsomme influensa pseudotyped partikler med konvolutt glykoproteiner fra svært patogene H5N1 og avian H7N9 virus

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver en eksperimentell prosess for å produsere høy-titer smittsomme viral pseudotyped partikler (PP) med konvolutt glykoproteiner fra to influensa A stammer og hvordan du kan bestemme deres infectivity. Denne protokollen er svært tilpasningsdyktig til å utvikle PPS av andre typer innhyllet virus med forskjellige konvolutt glykoproteiner.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Zhang, F., Wang, Y., Shang, X., Wang, S., Xiao, R., Zhou, H., Cai, L. Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses. J. Vis. Exp. (155), e60663, doi:10.3791/60663 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En og annen direkte overføring av det svært patogene fugleinfluensa A-viruset H5N1 (HPAI H5N1) og H7N9 til mennesker og deres dødelighet er alvorlige folkehelseproblemer og tyder på muligheten for en epidemi. Men vår molekylære forståelse av viruset er elementær, og det er nødvendig å studere de biologiske egenskapene til sin konvolutt proteiner som terapeutiske mål og å utvikle strategier for å kontrollere infeksjonen. Vi utviklet en solid viral pseudotyped partikkel (PP) plattform for å studere fugleinfluensaviruset, inkludert funksjonell analyse av sin hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA) konvolutt glykoproteiner, de reassortment egenskapene til HAs og NAs, reseptorer, tropisms, nøytralisere antistoffer, diagnose, infectivity, i forbindelse med narkotika utvikling og vaksine design. Her beskriver vi en eksperimentell prosedyre for å etablere PPS med konvolutten glykoproteiner (HA, NA) fra to influensa A stammer (HAPI H5N1 og 2013 avian H7N9). Deres generasjon er basert på kapasiteten til enkelte virus, for eksempel murine leukemi virus (MLV), å innlemme konvolutt glykoproteiner inn i en PP. I tillegg har vi også detalj hvordan disse PPS er kvantifisert med RT-qPCR, og infectivity påvisning av Native og ikke-samsvarende virus PPS avhengig av opprinnelsen til har og NAs. Dette systemet er svært fleksibelt og tilpasningsdyktig og kan brukes til å etablere viral PPS med konvolutt glykoproteiner som kan innlemmes i en annen type innhyllet virus. Dermed kan denne viral partikkel plattform brukes til å studere vill virus i mange forsknings undersøkelser.

Introduction

Oppdraget av en viral partikkel er å transportere sine Genova fra en infisert vert celle til en ikke-infisert vert celle og å levere den inn i cytoplasma eller kjernen i en replikering-kompetent form1. Denne prosessen er i utgangspunktet utløst av binding til vert celle reseptorer, etterfulgt av fusjon av virionet og cellulære membraner. For innhyllet virus, som influensa virus, Spike glykoproteiner er ansvarlig for reseptor binding og Fusion1,2. Viral konvolutt glykoproteiner (f. eks pyrogener, antigener), er involvert i mange viktige egenskaper og hendelser, for eksempel virus livssyklus initiering (binding og Fusion), viral patogenesen, immunogenisitet, Host Cell apoptose og mobilnettet tropism, mobilnettet endocytic Pathway, samt interspecies overføring og reassortment1,3,4,5,6,7. Forskning på viral konvolutt glykoproteiner vil hjelpe oss å forstå mange aspekter av viral infeksjon prosessen. Pseudotyped viral partikler (PP), også betegnet pseudovirions eller pseudoparticles, kan genereres gjennom en pseudotyping teknikk8,9,10. Denne teknologien har blitt brukt til å utvikle pseudotyped partikler av mange virus, inkludert hepatittC 11,12, hepatitt B13, flytande stomatitt virus (VSV) 14,15, og influensa virus16,17,18,19. Denne teknologien er basert på gag-Pol protein av lentiviruses eller andre retroviruses.

Pseudotyped viral partikler kan fås ved hjelp av en tre-plasmider system ved å cotransfecting en viral konvolutt glykoprotein uttrykk plasmider, en retroviral emballasje plasmider mangler konvolutten env genet, og en egen reporter plasmider i PP produsent celler. Retrovirus er satt sammen av sin gag protein, og det knopper fra en infisert celle membran som uttrykker viruset konvolutt protein1. Derfor er det mulig å oppnå høy titer influensa PPS bruke retrovirus gag protein å produsere knopper på en mobilnettet membran uttrykker influensa HA og NA. I våre tidligere studier, har/NAs i alle kombinasjoner var funksjonelle og i stand til å utføre sine tilsvarende funksjoner i viral livssyklus16,17,18,20,21. Disse PPS brukes til å undersøke influensa biologiske egenskaper, inkludert hemagglutination, neuraminidase aktivitet, HA-reseptor bindende tropism, og infectivity. Fordi HA og NA er begge viktige overflaten funksjonelle proteiner i viral livssyklus, samsvarer ikke har og NAs avledet fra ulike stammer av influensa kan delvis demonstrere reassortment mellom dem. Her genererer vi åtte typer influensa PPS ved å kombinere to har og to NAs (avledet fra HPAI H5N1 belastning og H7N9 flekken), ved hjelp av en tre-plasmider pseudotyping system. Disse åtte typer PPS inkluderer to innfødte PPS, H5N1pp, H7N9pp; to ikke-samsvarende PPS, (H5 + N9) PP, (H7 + N1) PP; og fire PPS bare harboring en enkelt glykoprotein (HA eller NA), H5pp, N1pp, H7pp, N9pp. studier på influensa viruset, slik som H5N1 og H7N9, er begrenset av biosafety krav. Alle studier av vill influensa virusstammer bør utføres i et biosafety nivå 3 (BSL-3) laboratorium. Pseudotyped viral partikkel teknologi kan brukes til å pakke en kunstig virionet i en biosafety nivå 2 (BSL-2) innstilling. Derfor PPS representerer et tryggere og nyttig verktøy for å studere influensa viruset prosesser avhengig av sine to store glykoproteiner: hemagglutinin (HA) og neuraminidase (NA).

Denne protokollen beskriver generering av disse PPS med en tre-plasmider cotransfection strategi (leses i figur 1), hvordan å kvantifisere PPS, og infectivity deteksjon. PP-produksjonen omfatter tre typer plasmider (figur 1). Den gag-Pol genet, som koder for retrovirus gag-Pol protein, ble klonet fra en retrovirus emballasje Kit og settes inn i pcDNA 3,1 plasmider og oppkalt PcDNA-gag-pol. Den forbedrede grønne fluorescerende protein (eGFP) genet, som koder Green fluorescerende protein, ble klonet fra pTRE-EGFP vektor, settes inn i pcDNA 3,1 plasmider, og kalte pcDNA-GFP. Under kloning, en emballasje signal (ψ) sekvensen ble lagt til via en primer. HA og NA gener ble klonet i en pVRC plasmider, oppkalt pVRC-HA og pVRC-NA, henholdsvis. Den siste plasmider koder Fusion protein og kan erstattes med andre Fusion protein av interesse. Vår pseudotyping plattform inkluderer to glykoprotein uttrykk plasmider: pVRC-HA og pVRC-NA. Dette kan forenkle forskningen på reassortment mellom ulike virusstammer i en BSL-2 innstilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. dag 1: Cell kultur og seeding

  1. Dyrke menneskelige embryonale nyre (HEK) 293T/17 celler i 60 mm retter med Dulbecco er modifisert essensielle medium (DMEM) supplert med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 100 U/mL penicillin-Streptomycin (DMEM Complete medium, DCM) i en 37 ° c, 5% karbondioksid (CO2) inkubator til om 80% confluent.
    Merk: HEK 293T/17 lav passasje celler anbefales.
  2. Vask forsiktig cellene med 5 mL fosfat bufret saltvann (PBS) 1x.
    Merk: Manuell håndtering av HEK 293T/17-cellene må være svært milde, fordi de enkelt løsner.
  3. Fjern PBS og distansere cellene med 1 mL 0,25% Trypsin-etylen diamin Tetraacetic acid (EDTA) løsning. Plasser fatet i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator for ikke mer enn 5 min til cellene er dissosiert.
  4. Deaktiver Trypsin ved å legge til 5 mL DCM. Spre cellene til en enkelt celle suspensjon ved pipettering opp og ned flere ganger.
  5. Overfør celle suspensjonen til en prechilled 15 mL sentrifuge slange. Samle cellene ved sentrifugering ved 250 x g i 5 min ved 4 ° c.
  6. Dekanter så mye av supernatanten som mulig. Resuspend celle pellet med 6 mL DCM medium og telle cellene. Fortynne cellene til 1 x 106 celler/ml med DCM medium.
  7. Seed cellene i en 6 brønn plate med 1 mL celle suspensjon per brønn. Klapp forsiktig platen for å fordele cellene jevnt. Ruge platen over natten (14 – 16 timer) i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.

2. dag 2: fire-plasmider Cotransfection formidlet av Lipofection

  1. Kontroller celle morfologi og tetthet under et omvendt lys mikroskop. Ideelt sett bør celler være ca 85% confluent på transfeksjoner. Erstatt mediet med 1 mL serum fritt DMEM medium per brønn, og sett deretter platen tilbake i inkubator.
    Merk: Manuell håndtering av HEK 293T/17-cellene må være svært milde, fordi de enkelt løsner.
  2. For hver brønn av kultivert celler som skal transfekterte, fortynne 8 μL av transfeksjoner reagens til et volum på 150 μL med redusert serum medium (rør 1). Bland forsiktig og ruge i 5 minutter ved romtemperatur (RT, ca. 20 ° c).
    Merk: for hver transfeksjoner prøve klargjør du to 1,5 mL mikrosentrifugen rør, nummerert 1 og 2.
  3. I rør 2, fortynne 2,5 μg av plasmider DNA til 150 μL av redusert serum medium.
    Merk: i rør 2, fortynne hvert plasmider DNA som vist i tabell 1. En plasmider koding flytande stomatitt virus (VSV) G glykoprotein (plasmider pLP-VSVG) ble brukt som en positiv kontroll, fordi VSV er i stand til å infisere et bredt spekter av celler. Negative kontroll partikler som mangler influensa konvolutt glykoproteiner (Δenv PPS) ble generert ved hjelp av pcDNA-gag-Pol og pcDNA-GFP plasmider.
  4. Etter 5 min inkubasjons, Kombiner det fortynnede DNA med fortynnet transfeksjoner reagens. Bland forsiktig og ruge for en annen 15 min ved RT.
  5. Tilsett DNA-lipid-komplekset til tilsvarende brønn som inneholder cellene og serum fritt medium. Bland forsiktig ved å gynge platen frem og tilbake.
  6. Etter inkubasjons for 4 – 6 timer i en 37 ° c, 5%2 inkubator, Fjern mediet, og Erstatt med 2 ml DMEM. Ruge for en annen 36 – 48 h i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.
    Merk: Skift ut med serum fri og antistoff fri DMEM. I denne protokollen, to har og to NAs kan brukes til å generere åtte typer PPS (vist i tabell 1).

3. dag 3: mottakelige celler seeding

  1. For infectivity analysen, seedet hver type mottakelige celler på 1 x 104 celler per brønn i en 96 brønn plate.
    Merk: Bruk to typer mål celle for å utføre infectivity analysen i denne artikkelen: en alveolære menneskelig cellelinje (A549 celler) og Madin-Darby canine nyre (MDCK) celler. MDCK celler er mye brukt i influensa forskning og kan være en god kontroll. Dette trinnet er fleksibelt. Alle andre mål cellelinjer kan brukes i henhold til forsknings kravene.
  2. Ruge platen over natten (14 – 16 timer) i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.

4. dag 4: pseudotyped viral partikkel Collection, kvantifisering, og infectivity analysen

  1. Pseudotyped viral partikkel samling
    1. Sjekk fargen på mediet. Ideelt sett bør det være lys rosa eller svakt oransje. Undersøk cellene med et invertert fluorescerende biologisk mikroskop under 440 – 460 NM.
    2. På 36-48 h posttransfection, høste PPS ved passaging gjennom et 0,45 μm Polyvinylidene fluor (PVDF) membran filter for å eliminere celle rusk.
    3. Del PPS i små volum alikvoter.
    4. Lagre PPS at-80 ° c.
      Merk: protokollen kan stanses midlertidig her. Men dette er ikke oppmuntret, fordi infectivity av PPS vil kraftig avta etter frysing og tine.
  2. Pseudotyped viral partikkel kvantifisering
    1. Overfør 20 μL av renset PPS til en 1,5 mL ribonuklease (RNase)-Free mikrosentrifugen tube.
    2. Tilsett 1 μL av 0,24 U/mL benzonase nuklease. Ruge ved 37 ° c i 1 time for å eliminere enhver DNA-og RNA-forurensning.
      Merk: Target RNA, vanligvis downregulated Cytomegalovirus (CMV)-GFP RNA, er pakket i PPS og kan unngå å bli degradert av benzonase nuklease.
    3. Frys prøven ved-70 ° c for å deaktivere benzonase nuklease.
    4. Tilsett 2 μL av proteinase K. ruge ved 50 ° c i 30 min for å fordøye konvolutt proteiner og løsne CMV-GFP RNA. Deaktiver proteinase K ved 100 ° c i 3 min.
    5. Kvantifisere PPS av sanntids-kvantitative Reverse-transkripsjon (qRT)-PCR med en Universal probe One-Step RT-qPCR Kit, ved hjelp av frem primer 5 '-AACAAAAGCTGGAGCTCGTTTAA-3 ', omvendt primer 5 '-GGGTCTCCTCAGAGTGATTGACTAC-3 ', og sonden 5 '-FAM-CCCCCAAATGAAAGACCCCCGAG-TAM-3 ' på en PCR-thermocycler i sanntid. Normalisere PPS for RNA kopi nummer før infectivity.
  3. Infectivity analysen
    1. Fortynne hver type PPS i forhold til qRT-PCR data til 4 x 105 eksemplarer/ml (PP normalisering).
    2. Legg Tosyl-fenylalanin Chloromethyl-keton (TPCK)-Trypsin til en endelig konsentrasjon på 40 mikrogram/mL til PPS at Harbor H7N9 HA. Ruge ved 37 ° c i 1 time for å danne sin funksjonelle under enheter HA1 og HA2.
      Merk: det er ikke nødvendig å behandle PPS at Harbor H5 med TPCK-Trypsin, fordi de har flere arginin og lysin rester på HA1-HA2 kløft området. Denne multi-grunnleggende kløft området kan bli kløyvde av allestedsnærværende cellulære proteaser.
    3. Bland normalisert PPS med DMEM medium (serum-fri) på en 1:1 ratio (volum/volum).
    4. Bring platen som inneholder mottakelige celler til biosafety skapet.
    5. Aspirer supernatanten og vask cellene en gang med 0,1 mL prewarmed PBS.
    6. Tilsett 0,1 mL PPS-DMEM blanding til en brønn. Tre eksemplarer de infectivity testene av hver type PPS til en mottakelig cellelinje (leses i figur 2).
    7. Ruge 96 brønn plate for 4 – 6 timer i 37 ° c, 5%2 inkubator.
    8. Aspirer supernatanten og Skift ut med 0,1 mL DCM.
    9. Ruge den 96 brønn plate for en annen 24-36 t i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator.

5. dag 5 eller 6: infectivity deteksjon

  1. Bring 96 brønn platen til biosafety skapet.
  2. Aspirer supernatanten og vask cellene 1x med 0,2 mL prewarmed PBS.
  3. Fjern PBS og distansere cellene med 0,1 mL 0,25% Trypsin-EDTA-løsning.
  4. Plasser fatet i en 37 ° c, 5% CO2 inkubator for 3 min til cellene er dissosiert.
    Merk: unngå incubating i mer enn 5 minutter, fordi dette vil føre til celle klumper.
  5. Deaktiver Trypsin ved å legge til 0,4 mL av DCM.
  6. Spre cellene til enkelt celle fjæring ved pipettering opp og ned flere ganger.
  7. Overfør celle suspensjonen til en kjølt 1,5 mL mikrosentrifugen tube.
  8. Bestem GFP reporter-positive celler med fluorescens aktivert Cell sortering (FACS).
    Merk: for å bestemme forholdet mellom GFP reporter-positive målceller, angi flyt flowcytometer portene ved hjelp av kontroll prøvene (PPS-ubehandlet A549 celler eller MDCK celler), og deretter telle GFP reporter-positive celler i 10 000 celler per prøve.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Avhengig av den generelle fremgangsmåten som er beskrevet ovenfor, har vi generert 10 typer PPS kombinere to gruppe har/NAs eller VSV-G glykoprotein eller no-konvolutt glykoproteiner (vist i tabell 1). Syv av dem er smittsomme. Den PPS at Harbor no-konvolutt glykoprotein eller bare havn NA ikke viser noen infectivity her. Den influensa PP produksjonen prosedyren er leses i figur 1. Transmission Electron micrographs av PPS (f. eks, H5N1pp) er vist i Figur 3. Resultatene av infectivity analyser av disse PPS er vist i Figur 4. Det infectivity av det syv typer av PPS var vurdert med ett Genova eksemplarene per cellen (GCP) [analog med mangfoldet av infeksjon (MOI)] salgsverdi av 20. I PPS-gruppen harboring H5 var infectivity av H5N1, (H5 + N9) og H5 90,05 ± 4,05%, 17,78 ± 1,58%, 10,15 ± 2,85% for cellelinje A549 og 40,37 ± 4,92%, 5,24 ± 1,32%, 4,88 ± 0,27% for MDCK. I PPS gruppen harboring H7, infectivity av H7N9, (H7 + N1), og H7 var 10,45 ± 2,35%, 6,75 ± 1,37%, 1,23 ± 0,33% for cellelinje A549 og 7,61 ± 1,04%, 4,12 ± 1,29%, 1,08 ± 0,02% for MDCK, henholdsvis. For infectivity analyser av PPS, spesielt HApp (H5pp, H7pp), eksogene neuraminidase ble ikke lagt til. I denne infectivity analysen ble MDCK-cellene også brukt som kontroll cellelinje for å teste PPS infectivity. Infectivity av VSVGpp var 20,9 ± 2,00% for A549 og 16,02 ± 2,41% for MDCK celler. Deltaet-konvolutt glykoproteiner PP (Δenv PP) viste ingen infectivity i studien vår. Disse dataene viste også at har/NAs fra ulike virusstammer er i stand til å lykkes generere smittsomme virus partikler. Til sammen kan vår pseudotyping plattform utvikle smittsomme pseudotyped virale partikler som brukes i influensa forskning.

Figure 1
Figur 1: oversikt over influensa PP produksjons prosedyre. (A) emballasjen plasmider PcDNA-gag-Pol, reporteren plasmider PCDNA-GFP, og konvolutten glykoprotein uttrykket plasmider PVRC-ha og PVRC-na, er cotransfected i PP-produserende HEK 293/17 celler. (B) i HEK 293/17-celler blir gag-Pol-polyproteins syntetisert og transportert av en ukjent mekanisme til cellemembranen. Glykoproteiner HA og NA transporteres og forankres på cellemembranen via sekretoriske Tien. Reporter plasmider pcDNA-GFP er skrives inn i single-strandet ψ-GFP genomisk RNA. (C) under eller etter transporten rekrutterer gag-Pol-proteinet den enkelt-strandet ψ-GFP genomisk RNA via PSI-RNA-emballasjen, og danner dermed de pre-spirende komplekser. (D) den sammensatte gag-Pol-ψ-RNA kompleks induserer membran krumning, noe som fører til dannelsen av en knopp. Under spirende, det viral konvolutt glykoproteiner har/NAs er innlemmet i begynnende partikler. Spirende er fullført som partikkel klyper av fra cellemembranen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: samlet ordning i infectivity analysen. De infectivity testene av hver type PPS til en mottakelig cellelinje ble målt i tre eksemplarer. Alveolære menneskelige celler A549 og MDCK brukes som mottakelige celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Transmission elektron micrographs av PPS. Unconcentrated (venstre) og konsentrert (høyre) supernatanten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: infectivity av normalisert PPS. Infectivity presenteres som gjennomsnittlig ± standardavvik (SD) prosent av infiserte celler (n = 3). Infectivity av PPS ble vurdert i to cellelinjer, A549 og MDCK celler. Sju typer PPS vist ulike infectivity profiler i to målceller. PPS at bare Harbor NA er ikke vist her som de ikke manifest noen infectivity. PPS at havna no-konvolutt glykoproteiner (Δenv) viste også ingen infectivity i studien vår. Prosenten av infectivity betegnet forholdet mellom GFP reporter-positive celler i 10 000 celler per prøve. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

plasmider preparater
plasmider (μL, 0,1 μg/μL) H5N1 (H5 + N9) H7N9 (H7 + N1) H5 N1 H7 N9 VSVG Δenv
pcDNA-gag-Pol 10,53 10,53 10,53 10,53 11,43 11,43 11,43 11,43 11,43 12,5
pcDNA-GFP 10,53 10,53 10,53 10,53 11,43 11,43 11,43 11,43 11,43 12,5
pVRC-HA 1,98 1,98 1,98 1,98 2,14 - 2,14 - - -
pVRC-NA 1,98 1,98 1,98 1,98 - 2,14 - 2,14 - -
pcDNA-VSVG - - - - - - - - 2,14 -

Tabell 1: kombinasjoner av ha og na proteiner avledet fra H5N1 og H7N9 virus og nødvendige mengder (volum) av PLASMIDER DNA for en brønn transfeksjoner av en 6 brønn plate. I henhold til konsentrasjonen av plasmider preparater, beregne det nødvendige volumet av hver plasmider DNA. Den totale mengden plasmider DNA for tranfection av en brønn er 2,5 μg. For å oppnå den høyeste transfeksjoner effektiviteten og de laveste ikke-spesifikke effektene, optimaliserte vi transfeksjoner forhold ved å variere plasmider DNA og tranfection reagens konsentrasjoner. Etter optimalisering ble forholdet mellom de fire plasmider antallene angitt som 16:16:1:1. Volumet av transfeksjoner reagens som brukes i en brønn transfeksjoner av en 6 brønn plate er 8 μL (ikke vist i tabellen). To har og to NAs fra H5N1 og H7N9 virus kan brukes til å generere åtte typer PPS: H5N1pp, (H5 + N9) PP, H5pp, N1pp, H7N9pp, (H7 + N1) PP, H7pp og N9pp. Den PPS at havna no-konvolutt glykoproteiner (Δenv) eller bare Harbor NA glykoproteiner viste ingen infectivity i vår studie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne protokollen beskriver vi en metode for å produsere influensa virus pseudotyped partikler (PP) i en BSL-2 innstilling. Reporteren plasmider pcDNA-GFP er innlemmet inn i PPS og kan brukes å kvantifisere PPS av FACS inne en infectivity analysen. Vi valgte to typer mottakelige cellelinjer fordi de er mye brukt i influensa forskning. MDCK celler ville gi en god kontroll til variabelen udødeliggjort menneskelige celler som brukes i disse studiene.

Denne protokollen er basert på retrovirus MLV, som kan innlemme en GFP reporter og produsere knopper på mobilnettet membranen. Denne teknikken har blitt mye utviklet for pakking influensa virus partikler4,22,23,24. Noen andre systemer er basert på lentiviral HIV-1 pseudotyping system19,25,26 eller baculovirus-insekt celle Expression system27,28,29. Mange andre reporter gener har også blitt brukt til pseudoparticle produksjon, slik som luciferase (luminescence)30,31,32,33, β-gal/LacZ (av kolorimetriprogrammene)34,35, og utskilt alkalisk fosfatase36,37. Millet et al. brukte luciferase analysen å kvantifisere infectivity av coronavirus pseudotyped partikler33. Sammenlignet med luciferase, GFP grønne fluorescens er lett observert med en invertert fluorescerende biologiske mikroskop. Dette er en praktisk måte å kontrollere effektiviteten til transfeksjoner og infeksjonen på. For denne studien kan infectivity bestemmes direkte ved å oppdage de GFP-positive cellene med FACS.

I denne metoden påvirker flere trinn kritisk resultatene. Optimalisert celle tetthet er en kritisk faktor for vellykket transfeksjoner. I denne protokollen, en celle tetthet i området 80-90% confluent ble funnet å være optimal for influensa virus PP produksjon. Høyere eller lavere celle tetthet vil resultere i lavere transfeksjoner effektivitet. God fysiologisk status av produsent celler er også svært viktig for høy partikkel produksjon. Dette er grunnen til lavere celle passasje HEK 293T/17 celler er anbefalt å produsere PPS i denne protokollen. Også volumet av transfeksjoner reagens og forholdet mellom de fire plasmider mengdene kan også påvirke transfeksjoner effektivitet. For å oppnå den høyeste transfeksjoner effektivitet, anbefales det å optimalisere disse faktorene ved å variere og teste deres beløp. Vi setter forholdet mellom fire plasmider mengder som 16:16:1:1 og volumet av transfeksjoner reagens som 8 μL for en brønn tranfection i en 6 brønn plate. Et annet problem er håndteringen av cellene. Den HEK 293T/17producer cellene er lite vedheft, så Manuell håndtering av cellene må være svært skånsom. Lipofection kan føre til en celle permeabilitet øker, og serum og antistoffer i mediet kan øke cytotoksisitet. Det er best å bruke serum fri og antistoff fri DMEM til kultur post-transfekterte HEK 293T/17 celler. Videre er innsamling tid viktig. På 36-48 h post-transfeksjoner, fargen på cellen supernatanten må sjekkes for å være sikker på at det er rosa eller oransje-rosa før PP samling. Gul supernatanten indikerer at mediet er for surt til å støtte cellevekst og vanligvis fører til dårlig PP gir.

Vi utførte transfeksjoner analysen i en 6 brønn plate. For å få mer PP volum antall transfeksjoner brønner kan økes og supernatanter som inneholder samme PPS kan samles sammen. Alternativt kan noen andre typer fartøy brukes til å øke PP yield. For eksempel kan 18 μL av transfeksjoner reagens og 5,5 mikrogram plasmider DNA brukes til å utføre transfeksjoner med 2,2 x 106 celler i 1 60 mm rett. Tilsvarende kan en infectivity analysen utføres i en 24 brønn plate.

Suksessen med denne teknikken kan bli påvirket av mange faktorer. Derfor bør prosedyren optimaliseres for partikkel pakking av ulike typer virus.

I denne protokollen, pseudotyped viral partikler av HPAI H5N1 og H7N9, samt deres reassortants, ble generert. I denne metoden bruker vi qRT-PCR av GFP-RNA i infectivity analysen på single-cellenivå (som Genova eksemplarer per celle) i stedet for vev kultur smittsomme dosen 50 (TCID50) eller tradisjonell Moi23,38,39. Virus infectivity titrering metoder er basert på plakk analyser eller TCID50 analyser, som er både tidkrevende og arbeidskrevende. Begge analysene er avhengige av måling av synlige Cytopathic effekter (CPE) forårsaket av virus infeksjon i cellelinjer, så det kan være vanskelig å titrere virus av lav infectivity (dvs. H7pp i denne studien). Vi tror det er en praktisk, effektiv og rask metode for å normalisere PPS med qRT-PCR av GFP RNA som finnes i influensa PPS.

Til sammen er vår teknikk trygg og tilpasningsdyktig, og kan brukes til å studere innhyllet virus, inkludert deres reseptorer, tropisms, konvolutt glykoprotein funksjon, nøytralisere antistoffer, antivirus narkotika utvikling, diagnose, og vaksine design og Evaluering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Zhejiang Provincial Medicine and Health Science and Technology plan (Grant Numbers, 2017KY538), Hangzhou Municipal Medicine og Health Science and Technology plan (Grant Numbers, OO20190070), Hangzhou Medical Science og Teknologi nøkkel Project (Grant Numbers, 2014Z11) og Hangzhou kommunale autonome søknad prosjekt for sosial utvikling og vitenskapelig forskning (Grant Numbers, 20191203B134).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Benzonase Nuclease Millipore 70664 Effective viscosity reduction and removal of nucleic acids from protein solutions
Clear Flat Bottom Polystyrene TC-treated Microplates (96-well) Corning 3599 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
Individual alphanumeric codes for well identification
Clear TC-treated Multiple Well Plates (6-wells) Costar 3516 Individual alphanumerical codes for well identification
Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma irradiation
Dulbecco's modified essential medium (DMEM) Gibco 11965092 A widely used basal medium for supporting the growth of many different mammalian cells
Fetal bovine serum Excell FND500 fetal bovine sera that can offer excellent value for basic cell culture, specialty research, and specific assays
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) Beckman coulter cytoflex
Human alveolar adenocarcinoma A549 cells ATCC CRM-CCL-185
Human embryonic kidney (HEK) HEK-293T/17 cells ATCC CRL-11268 A versatile transfection reagent that has been shown to effectively transfect the widest variety of adherent and suspension cell lines
Inverted fluorescent biological microscope Olympus BX51-32P01-FLB3
Inverted light microscope Olympus CKX31-12PHP
Lipofectamine 2000 Transfection Reagent Invitrogen 11668019 Rapid, sensitive and precise probe-based qPCR detection and quantitation of target RNA targets.
Luna Universal Probe One-Step RT-qPCR Kit NEB E3006L Will withstand up to 14,000 RCF
RNase-/DNase-free Nonpyrogenic
Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells ATCC CCL-34
MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube (1.5 mL) Axygen MCT-150-C 33 mm, gamma sterilized
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF Millipore SLHV033RS an improved Minimal Essential Medium (MEM) that allows for a reduction of Fetal Bovine Serum supplementation by at least 50% with no change in cell growth rate or morphology. Opti-MEM I medium is also recommended for use with cationic lipid transfection reagents, such as Lipofectamine reagent.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Gibco 11058021 The antibiotics penicillin and streptomycin are used to prevent bacterial contamination of cell cultures due to their effective combined action against gram-positive and gram-negative bacteria.
penicillin-streptomycin Gibco 15140122 Maximum RCF is 12,500 xg
Temperature range from -80 °C to 120 °C
RNase-/DNase-free
Sterile
PP Centrifuge Tubes (15 mL) Corning 430791 a stable and highly reactive serine protease
Proteinase K Beyotime ST532 Treated for optimal cell attachment
Sterilized by gamma radiation and certified nonpyrogenic
TC-treated Culture Dish (60mm) Corning 430166 Trypsin from bovine pancreas
TPCK Treated, essentially salt-free, lyophilized powder, ≥10,000 BAEE units/mg protein
TPCK-trypsin Sigma T1426 This liquid formulation of trypsin contains EDTA and phenol red. Gibco Trypsin-EDTA is made from trypsin powder, an irradiated mixture of proteases derived from porcine pancreas. Due to its digestive strength, trypsin is widely used for cell dissociation, routine cell culture passaging, and primary tissue dissociation. The trypsin concentration required for dissociation varies with cell type and experimental requirements.
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Knipe, D. M., Howley, P. M. Fields Virology (6th). Lippincott Williams & Wilkins Immunology. Philadelphia, PA. (2013).
  2. White, J. M., Delos, S. E., Brecher, M., Schornberg, K. Structures and mechanisms of viral membrane fusion proteins: multiple variations on a common theme. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 43, (3), 189-219 (2008).
  3. Bright, R. A., et al. Cross-clade protective immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS One. 3, (1), 1501 (2008).
  4. Yang, J., et al. Reliability of pseudotyped influenza viral particles in neutralizing antibody detection. PLoS One. 9, (12), 113629 (2014).
  5. Wyatt, R., Sodroski, J. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens, and immunogens. Science. 280, (5371), 1884-1888 (1998).
  6. Joe, A. K., Foo, H. H., Kleeman, L., Levine, B. The transmembrane domains of Sindbis virus envelope glycoproteins induce cell death. Journal of Virology. 72, (5), 3935-3943 (1998).
  7. Albecka, A., Laine, R. F., Janssen, A. F., Kaminski, C. F., Crump, C. M. HSV-1 Glycoproteins Are Delivered to Virus Assembly Sites Through Dynamin-Dependent Endocytosis. Traffic. 17, (1), 21-39 (2016).
  8. Huang, A. S., Palma, E. L., Hewlett, N., Roizman, B. Pseudotype formation between enveloped RNA and DNA viruses. Nature. 252, (5485), 743-745 (1974).
  9. Rubin, H. Genetic Control of Cellular Susceptibility to Pseudotypes of Rous Sarcoma Virus. Virology. 26, 270-276 (1965).
  10. Steffen, I., Simmons, G. Pseudotyping Viral Vectors With Emerging Virus Envelope Proteins. Current Gene Therapy. 16, (1), 47-55 (2016).
  11. Bartosch, B., Dubuisson, J., Cosset, F. L. Infectious hepatitis C virus pseudo-particles containing functional E1-E2 envelope protein complexes. Journal of Experimental Medicine. 197, (5), 633-642 (2003).
  12. Bian, T., Zhou, Y., Bi, S., Tan, W., Wang, Y. HCV envelope protein function is dependent on the peptides preceding the glycoproteins. Biochemical and Biophysical Research Communications. 378, (1), 118-122 (2009).
  13. Gudima, S., Meier, A., Dunbrack, R., Taylor, J., Bruss, V. Two potentially important elements of the hepatitis B virus large envelope protein are dispensable for the infectivity of hepatitis delta virus. Journal of Virology. 81, (8), 4343-4347 (2007).
  14. Yoshida, Y., Emi, N., Hamada, H. VSV-G-pseudotyped retroviral packaging through adenovirus-mediated inducible gene expression. Biochemical and Biophysical Research Communications. 232, (2), 379-382 (1997).
  15. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, (17), 8033-8037 (1993).
  16. Zhang, F., et al. Characterization of pseudoparticles paired with hemagglutinin and neuraminidase from highly pathogenic H5N1 influenza and avian influenza A (H7N9) viruses. Virus Research. 253, 20-27 (2018).
  17. Zhang, F., et al. Infectivity of Pseudotyped Particles Pairing Hemagglutinin of Highly Pathogenic Avian Influenza a H5N1 Virus with Neuraminidases of The 2009 Pandemic H1N1 and a Seasonal H3N2. Journal of Bioterrorism & Biodefense. 2, 104 (2011).
  18. Wu, J., et al. Characterization of neuraminidases from the highly pathogenic avian H5N1 and 2009 pandemic H1N1 influenza A viruses. PLoS One. 5, (12), 15825 (2010).
  19. Nefkens, I., et al. Hemagglutinin pseudotyped lentiviral particles: characterization of a new method for avian H5N1 influenza sero-diagnosis. Journal of Clinical Virology. 39, (1), 27-33 (2007).
  20. Zhang, Y., et al. Hemagglutinin and neuraminidase matching patterns of two influenza A virus strains related to the 1918 and 2009 global pandemics. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387, (2), 405-408 (2009).
  21. Lin, X., et al. Oseltamivir boosts 2009 H1N1 virus infectivity in vitro. Biochemical and Biophysical Research Communications. 390, (4), 1305-1308 (2009).
  22. McKay, T., Patel, M., Pickles, R. J., Johnson, L. G., Olsen, J. C. Influenza M2 envelope protein augments avian influenza hemagglutinin pseudotyping of lentiviral vectors. Gene Therapy. 13, (8), 715-724 (2006).
  23. Pan, H., et al. Autophagy mediates avian influenza H5N1 pseudotyped particle-induced lung inflammation through NF-kappaB and p38 MAPK signaling pathways. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 306, (2), 183-195 (2014).
  24. Szecsi, J., et al. Induction of neutralising antibodies by virus-like particles harbouring surface proteins from highly pathogenic H5N1 and H7N1 influenza viruses. Virology Journal. 3, 70 (2006).
  25. Garcia, J. M., Lagarde, N., Ma, E. S., de Jong, M. D., Peiris, J. S. Optimization and evaluation of an influenza A (H5) pseudotyped lentiviral particle-based serological assay. Journal of Clinical Virology. 47, (1), 29-33 (2010).
  26. Garcia, J. M., Lai, J. C. Production of influenza pseudotyped lentiviral particles and their use in influenza research and diagnosis: an update. Expert Review of Anti-infective Therapy. 9, (4), 443-455 (2011).
  27. Haynes, J. R., et al. Influenza-pseudotyped Gag virus-like particle vaccines provide broad protection against highly pathogenic avian influenza challenge. Vaccine. 27, (4), 530-541 (2009).
  28. Schmeisser, F., et al. Production and characterization of mammalian virus-like particles from modified vaccinia virus Ankara vectors expressing influenza H5N1 hemagglutinin and neuraminidase. Vaccine. 30, (23), 3413-3422 (2012).
  29. Liu, Y. V., et al. Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV) S glycoprotein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles (VLPs) that protect mice against challenge with SARS-CoV. Vaccine. 29, (38), 6606-6613 (2011).
  30. Moeschler, S., Locher, S., Conzelmann, K. K., Kramer, B., Zimmer, G. Quantification of Lyssavirus-Neutralizing Antibodies Using Vesicular Stomatitis Virus Pseudotype Particles. Viruses. 8, (9), 254 (2016).
  31. Lai, A. L., Millet, J. K., Daniel, S., Freed, J. H., Whittaker, G. R. The SARS-CoV Fusion Peptide Forms an Extended Bipartite Fusion Platform that Perturbs Membrane Order in a Calcium-Dependent Manner. Journal of Molecular Biology. 429, (24), 3875-3892 (2017).
  32. Millet, J. K., et al. Middle East respiratory syndrome coronavirus infection is inhibited by griffithsin. Antiviral Research. 133, 1-8 (2016).
  33. Millet, J. K., et al. Production of Pseudotyped Particles to Study Highly Pathogenic Coronaviruses in a Biosafety Level 2 Setting. Journal of Visualized Experiments. (145), e59010 (2019).
  34. Ma, M., et al. Murine leukemia virus pseudotypes of La Crosse and Hantaan Bunyaviruses: a system for analysis of cell tropism. Virus Research. 64, (1), 23-32 (1999).
  35. Wool-Lewis, R. J., Bates, P. Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology. 72, (4), 3155-3160 (1998).
  36. Chen, C. M., et al. Production and design of more effective avian replication-incompetent retroviral vectors. Developmental Biology. 214, (2), 370-384 (1999).
  37. Kaku, Y., et al. Second generation of pseudotype-based serum neutralization assay for Nipah virus antibodies: sensitive and high-throughput analysis utilizing secreted alkaline phosphatase. Journal of Virological Methods. 179, (1), 226-232 (2012).
  38. Rudiger, D., Kupke, S. Y., Laske, T., Zmora, P., Reichl, U. Multiscale modeling of influenza A virus replication in cell cultures predicts infection dynamics for highly different infection conditions. PLOS Computational Biology. 15, (2), 1006819 (2019).
  39. Petiot, E., et al. Influenza viruses production: Evaluation of a novel avian cell line DuckCelt(R)-T17. Vaccine. 36, (22), 3101-3111 (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics