毛里岛皮下白脂肪组织(ISWAT)移植模型

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Medicine

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Summary

在本协议中,描述了一种将鼠小岛分离和移植到皮下白脂肪组织的方法。分离的银体鼠胰岛使用基底膜水凝胶移植到鼠细胞接受者中。监测受体的血糖水平,对小岛移植物进行组织学分析。

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Peng, Y., Zou, Z., Chen, J., Zhang, H., Lu, Y., Bittino, R., Fu, H., Cooper, D. K. C., Lin, S., Cao, M., Dai, Y., Cai, Z., Mou, L. Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets. J. Vis. Exp. (156), e60679, doi:10.3791/60679 (2020).

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Abstract

胰腺胰岛移植是治疗1型糖尿病的一种成熟疗法。肾胶囊是啮齿动物模型中最常见的岛移植部位。然而,紧密的肾胶囊限制了大型动物和人类足够的胰岛移植。阴皮下皮白脂肪组织(ISWAT)是一种新的皮下空间,被发现是小岛移植的潜在价值部位。该网站有比其他皮下空间更好的血液供应。此外,ISWAT容纳比肾胶囊更大的小岛质量,移植到它很简单。本手稿描述了在ISWAT的协同糖尿病小鼠受体的小鼠小岛分离和移植程序。使用该协议,通过标准胶原酶消化分离了鼠胰腺胰岛,并用基底膜基质水凝胶固定ISWAT部位的纯化胰岛。对受体小鼠的血糖水平进行了100多天的监测。在移植后的第100天检索了岛移植物,进行组织学分析。本手稿中描述的 ISWAT 站点中的岛移植方案简单而有效。

Introduction

根据国际糖尿病联合会(IDF)1的统计数据,全球1型糖尿病的发病率和患病率正在迅速上升。岛移植是治疗T1DM4最有希望的方法之一。自从使用埃德蒙顿协议2的临床小岛移植取得重大突破以来,5年后T1DM受体的功能性小岛移植存活率现已达到50%左右

过去,在实验岛移植5、6、7等移植部位,如肝、肾胶囊、脾脏、肌肉内区域、皮下空间、骨髓、眼袋等,上述一些站点已在临床环境中测试8。虽然小岛移植到肝脏仍然是目前临床应用最广泛的方法但在使用这个部位时,有几个重要问题需要解决。例如,如何减少由即时血液介导炎症反应(IBMIR)和不良氧合供应10,11引起的移植胰岛的早期损失,以及如何在必要时取回胰岛移植物,因为它们在肝脏中分散局部化。肾脏胶囊可能是啮齿动物接受者的理想部位。然而,紧肾胶囊限制了移植足够的异体小岛在人类,虽然它可能是一个更好的适合胰岛异种移植由于高度纯化的猪胰岛制剂临床使用5,12。因此,寻找更合适的岛移植部位正在进行中。

皮下空间可作为临床上适用于小岛移植的场所,因为它可及性。然而,胰岛移植到皮下空间的效率极低,因此需要相对大量的胰岛来逆转高血糖13。最近,日本一个研究小组发现ISWAT,一种与肝脏14相比,在小鼠模型中用于小岛移植的新型皮下部位。ISWAT包含外胃动脉和静脉,因此丰富的血液供应可以保证小岛移植再血管化。在这份手稿中,我们提出了一种简单的植入方法,使用基底膜基质水凝胶来修复ISWAT中的合成鼠岛。该协议证明对小岛移植有效。

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Protocol

本议定书的所有程序均遵循深圳市第二人民医院伦理审查委员会的动物福利原则。从广东省医学动物中心购买的8至10周大的C57BL/6雄性小鼠为岛移植受体和捐赠者。收获细胞的收获、隔离、培养或管理程序是在无菌条件下进行的。

1. 岛准备

  1. 准备胶原酶 V 型工作溶液。称量胶原酶V型,用D-Hank的缓冲液溶解至1mg/mL的最终浓度,使用0.22μm注射器驱动的过滤单元和60 mL注射器和冰中预冷却进行过滤。每个捐赠者接受者需要5 mL的体积。
  2. 通过宫颈脱位使一只10周大的C57BL/6雄性小鼠(23 ±2 g)安乐死,用75%乙醇喷洒小鼠外部部分几秒钟。同时,用胶原酶溶液填充5mL注射器,用弯曲的钝尖灌注针(32G)更换注射器针。
  3. 将供体小鼠放在解剖范围下的冰袋上,在皮肤用直尖眼科剪刀切开横向开口,将皮肤完全切向头部。然后通过从阴区到西波叶过程的V切口完全打开腹部。
  4. 通过重新定位肝脏,暴露胆囊和普通胆管的整个长度。然后用血管夹夹夹住普通胆管的十二指肠开口,在胆囊中切开一个小开口。
    注:最佳针头放置对于防止回流到肝脏和胆囊非常重要。
  5. 在步骤1.2中使用灌注针从胆囊开口中分离普通胆管,然后将+2 mL的胶原酶溶液注射到胰腺中。之后,使用两对非侵入性微钳将浸没的胰腺从肠、胃和脾脏中分离出来,并将其放入冰上50 mL锥形管中。
    注:对所有供体小鼠重复此过程。连续三次灌注胰腺(间隔不超过 40 分钟)可组合成 50 mL 锥形管,预填充每个胰腺的 3 mL 胶原酶溶液。
  6. 将每个胰腺100μL DNase I(10mg/mL)加入50 mL锥形管中,并在37°C下在水浴中消化胰腺,摇动锥形管3~5分钟。
    注:在水浴中消化之前,以10秒的间隔大力摇动管40倍,使组织脱位,然后在消化过程中适度摇动管。
  7. 加入停止溶液(2.5 mg/mL BSA-HBSS溶液),最终体积为50 mL,以阻止消化,并在4°C下将管脉冲离心至750 x g的速度,并迅速停止。
  8. 在 BSA-HBSS 的 15–25 mL 中轻轻重新悬浮,将上清液倒入并洗净颗粒 2 倍。脉冲离心管的速度条件与步骤 1.7 中概述的相同,持续 1 分钟。
  9. 倒入上清液,将三个锥形管的颗粒放入 50 mL 锥形管中。在总体积为 10 mL 的分型 1119 中重新悬浮颗粒。均匀混合,并依次加入5 mL的异体-1077和5 mL的HBSS,通过移液缓慢沿管侧。
  10. 在 4°C 下以 750 x g的速度旋转离心机中的样品 10 分钟,无需踩刹车。
  11. 使用一次性 5 mL 巴斯德移液器将 HBSS/istopaque-1077 接口的小岛吸入 50 mL 锥形管中,将 BSA-HBSS 添加到 50 mL 的最终体积中,在 4 °C 时以 750 x g的脉冲离心机。
  12. 倒入上清液,使用 30 mL 的 BSA-HBSS 清洗胰岛。在 4 °C 下 750 x g下离心 1 分钟。
  13. 每管使用 30 mL 培养基(10% FBS-1%P/S-CMRL-1066)重新悬浮胰岛,并倒入直径为 10 厘米的轻紧培养皿中。在立体显微镜下,使用 200 μL 凝胶加载移液器尖端,根据其形态(即球形、白色)从溶液中手工挑选胰岛。放入未经处理的细胞培养皿,培养基为10 mL。
    注:如果第一次采摘后第一纯化小岛的纯度不是最佳,则可以进行第二次手工采摘。
  14. 通过在光学显微镜下染色来检测精采胰岛的纯度,并在荧光显微镜下通过荧光显微镜下氟化二乙酸(FDA)-碘化钠(PI)染色检测胰岛的可行性。
  15. 在移植前,在37°C、95%空气-5%CO2的培养箱中培养培养基中分离的小岛(如步骤1.13)。

2. ISWAT小岛移植

  1. 通过一次注射链球菌素(STZ),在8周大的雄性C57BL/6小鼠(22~2克)中诱发糖尿病。在第-4天,快速将小鼠快速进行±4~6小时,然后用0.1M齐酸盐缓冲液(pH 4.4)制备2%的STZ溶液。称量,在缓冲液中重新悬浮,以180mg/kg的剂量在腹内注射小鼠。
    注:STZ解决方案在使用前需要新鲜准备,并覆盖铝箔,由于其光敏性。应立即使用,因为它将在 15-20 分钟内失去活动。
  2. 穿刺STZ注射小鼠的牛脉,在-1日上午10点左右和0日采集一些血液,并使用测试条和基本血糖监测仪器测量非禁食血糖水平。如果连续2个测试日的血糖水平都至少为20 mmol/L,小鼠将用作小岛移植受体。
  3. 在第 0 天,称量并标记所有受体小鼠。通过注射60mg/kg五巴比妥钠在腹内麻醉每个受体。
    注:使用脚趾捏检查麻醉深度。如果受体小鼠没有退退反射,麻醉水平足以进行手术。如果没有,则多加服用10毫克/千克五巴比妥钠。使用的五巴比妥钠在无菌生理盐水中稀释,浓度为2%(m/v)。
  4. 将水凝胶从 -20°C 冷冻箱中取出,放在冰上,以便解冻。水凝胶在4~10°C下是液体,在较高温度下会凝固。
  5. 为每个受体挑选+450~500个小岛当量(IEQ),在立体显微镜下(如步骤1.13)下,用200μL培养基,放入无菌的1.5 mL离心管中,并保持在冰上,直到准备移植。
  6. 使用 75% 乙醇将受体的左侧内脏区域拭子。将其置于上肢位置,并用手术胶带固定四肢。用电动剪子剪掉手术部位周围的头发,用Iodophor扫拭区域。
  7. 使用眼科剪刀和非侵入性微钳,在此区域进行垂直皮肤切口,识别ISWAT中劣质的表观动脉和静脉,并在血管上方创建一个小口袋。
  8. 在 200 x g下旋转胰岛管 30 s,并尽可能去除上清液。将完全解冻的水凝胶吸出 20 μL,并将其与胰岛一起加载到管中。轻轻重新悬挂胰岛,避免气泡。
  9. 将整个水池水凝胶混合物放入管中(步骤 2.7)的受体口袋(步骤 2.7),使用 200 μL 移液器尖端。
    注:此过程需要两名技术人员,一个使用非侵入性微钳拾取口袋边缘,另一个用于将小岛混合物输送到口袋。
  10. 在胰岛-水凝胶混合物完全凝固后,将20μL的头孢菌素(±5~10mg)加入移植部位,然后用连续缝合法使用5-0手术缝合关闭肌肉和皮肤。
    注:由于体温原因,水凝胶需要大约3分钟才能凝固。
  11. 将接收器放入干净的保持架中,并使用热垫保持温暖。继续监视,直到收件人完全恢复并开始自主移动。然后,根据0.1mg/Kg剂量,在腹内用无菌生理盐水施用0.03毫克/毫升布丙诺啡。
  12. 对每个收件人鼠标重复步骤 2.3_2.11。
  13. 测量受体小鼠的非禁食血糖水平(如步骤2.2),第一个月每周3-4倍,之后每周1倍。
  14. 在随访结束时(移植后100天),在麻醉(如步骤2.3中执行)下,按照步骤2.6所述的无菌步骤,从接受者体内切除ISWAT。根据血氧林和欧辛(H&E)染色的组织方案,修复甲醛和甲醛中的组织,以及胰岛素和胰高血糖素的免疫荧光。
  15. 如步骤 2.10 中那样添加头孢菌素并关闭收件人的切口,然后像步骤 2.11 中那样准备恢复。

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Representative Results

该协议引入了两个程序:鼠小岛制备和滑入ISWAT部位的岛移植。在第一个过程中,在用V型胶原酶溶液渗透和消化后,用Histopaque-1119和Histopaque-1077和额外的手工拾取步骤进行纯化,分离的鼠岛将足够纯,用于移植(如图1所示),具有高存活率的分离胰岛将用于移植(如图2所示)。在第二个程序中,使用STZ化学的糖尿病诱导至关重要。STZ的最佳剂量取决于小鼠菌株和年龄,糖尿病的成功诱导取决于连续两天同时超过16.7 mmol/L的非快速血糖水平。糖尿病小鼠无需小岛移植即可存活数周。在移植到ISWAT部位之前,小岛移植物应与水凝胶完全混合,需要几分钟才能将移植物固定到IWSAT中(图3)。当移植到ISWAT时,小岛移植逆转高血糖约一个月,受体小鼠的体重逐渐增加(图4)。在移植后100天,检索到小岛移植物进行组织分析(图5)。如图4所示,在测试日上午10点,移植物被切除后,非禁食血液迅速增加。H&E 染色表明,小岛移植物完好无损。胰岛素和胰高血糖素免疫荧光染色表明移植的小岛运作良好(图5)。

Figure 1
图1:胰腺灌注、消化和胰岛纯化。A) 胰腺灌注过程 (A1+A6.(B) 胰腺消化的终点,颗粒悬浮。(C) 在光学显微镜下观察到的纯化胰岛.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 2
图2:纯化胰岛的纯度和生存能力。A) 岛的纯度由二丁酮染色决定.由FDA-PI双染色评估的岛的可行性。(B) 胰岛的光显微镜图像.(C) FDA染色显示绿色中可行的细胞.(D) PI 荧光红色表示死细胞。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 3
图3:岛移植。A) 麻醉后,用刀刃在移植部位洗发,用手术胶带固定受助人的四肢腹部向上。(B) 腹腔切除术后,ISWAT移植部位暴露。(C) 混合在水凝胶中的胰岛被缓慢地移植到ISWAT部位.请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 4
图4:血糖水平和移植后体重。使用合成胰岛移植的受体小鼠的非禁食血糖水平(红线)和体重(蓝线)(n = 7)。黑色箭头表示移植后100天切除了移植物。观察到不同受体血糖水平的一些变化,反映了小岛质量和功能的差异。请点击此处查看此图的较大版本。

Figure 5
图5:行为学和免疫荧光。移植部分沾染了H&E、DAPI(核)、抗小鼠胰岛素抗体和抗小鼠胰高血糖素抗体。请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

胰腺胰岛移植是治疗T1DM的一种有前途的治疗方法。这种疗法的效果受多种因素的影响,选择最佳的植入部位是非常重要的。胰岛移植的理想解剖部位应具有以下特征:简单移植、活检和移植检索程序的可及性;减少并发症;血糖控制成功率高;和长期存活的小岛移植15,16。

我们的团队之前描述了在鼠模17的阴岛移植方案。在阴膜中,与肾胶囊下的小岛移植相比,在较晚的时间达到正常血糖。因此,探索了其他植入胰岛的地点。

据报道,ISWAT是肝脏的替代部位,因为它需要较少的胰岛来逆转接受者的高血糖,而与在肝脏14的移植相比。此外,移植胰岛是容易的,就像可视化和检索移植14一样。在我们的研究中,受体小鼠在小岛移植后一个月内减少了高血糖,这表明ISWAT需要比肾胶囊更长的时间才能产生足够的胰岛素。因此,这些结果表明,ISWAT站点可能无法为氧气、营养物质的扩散和移植物的再血管化提供更好的条件。

在异岛移植设置中,分离胰岛的高纯度和活性对逆转糖尿病受体的高血糖至关重要,而胰岛分离方案在不同研究人员中并不相同消化时间对于获得高质量的胰岛至关重要。根据我们的经验,它不应超过5分钟。 分离的小岛可以在37°C的培养箱中过夜,以便从消化程序的机械应力中恢复21。

这里使用的水凝胶是一个基底膜基质,含有层蛋白,胶原蛋白IV,和生长因子17。当它达到体温时,它会凝固,并有助于将小岛移植物保存在ISWAT部位。虽然它对胰岛没有毒性,但水凝胶的存在是否影响胰岛移植和功能仍有待确定。

综合而言,ISWAT是啮齿类动物模型中的一种新型的分皮移植空间,可能用于临床应用。为了进行全面评估,需要使用较大的哺乳动物临床前模型进行其他研究。

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Disclosures

提交人报告没有利益冲突。

   

Acknowledgments

这项工作得到了国家重点研发项目(2017YFC1103704)广东省高水平医院建设专项资金(2019年)、深圳三明医药项目(SZSM201412020)、高水平基金的资助。深圳市医学学科建设(2016031638),深圳市科技基金会(JCJY20160260229204849975,GJHZ2017031417171357556),深圳市卫生和计划生育基金会(SZXJ2017021SZXJ2018059),医疗中国广东省科学研究基金会(A2019218),中国博士后科学基金会(2018M633218)。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Syringe-driven Filter Unit Merck Millipore SLHV033RB
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
5 mL Pasteur pipette JingAn Biological, China J00085
5 mL syringe Szboon, China 20170829
50 mL conical tube Corning 430829
5-0 surgical suture sh-Jinhuan, China CR537
60 mL syringe Szboon, China 20170623
75% Ethanol LIRCON, China 9180527
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG(H+L) Invitrogen A21202 Dilution (1:200)
anti-mouse Glucagon antibody Abcam ab10988 Dilution (1:100)
anti-mouse insulin antibody Cell Signaling Technology 3014s Dilution (1:100)
blunt-pointed perfusion needle Oloey, China 005 32G, yellow
BSA Meilune, China MB4219
C57BL/6 Mice Medical Animal Center of Guangdong Province 8~10 weeks
cell culture dish BIOFIL, China TCD000100 General,Non-treated,87.8 mm diameter
centrifuge Thermo Scientific ST16R
cephalosporin Lukang medical, China 150303
CMRL-1066 Sigma-Aldrich C0422
Codos Pet Clipper Szcodos, China CP-8000
collagenase Type V Sigma C9262
DAPI Thermo Fisher D1306
D-hank's buffer Coolaber, China PM5140-10
dithizone Sigma-Aldrich D5130
Dnase I Sigma-Aldrich D4263
Eosin staining media Beyotime Biotech, China C0109
FBS GE Healthcare Life Sciences SH30084
fluorescein diacetate (FDA) Thermo Fisher F1303
fluorescent microscope Leica DMIL
gel-loading pipet tips Corning CLS4884
HBSS Coolaber, China PM5150-10
hematoxylin staining media Cell Signaling Technology 14166S
HISTOPAQUE-1077 Sigma-Aldrich RNBG0522
HISTOPAQUE-1119 Sigma-Aldrich RNBG0536
Hydrogel BD Biosciences 356234 Basement Membrane Matrix
Iodophor LIRCON, China 5190313
light-tight culture dish DVS, China AN-5058548 self-made, glass dish sprayed with black paint
Medical Adhesive Tape Cofoe, China K12001
non-invasive microtweezers RWD Life Science F11033-11 and F12016-15
One Touch ultraeasy Basic blood glucose monitoring system Johnson & Johnson 33391713
ophthalmic scissors RWD Life Science S12012-12 and S11001-08
P/S (penicillin / streptomycin) Gibco 15140-122
pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P-010
Propidium iodide Sigma-Aldrich P4864
STZ (streptozotocin) Sigma-Aldrich S0130
Test Strip GenUltimate 100-50
TRITC-conjugated Goat anti-Rabbit IgG(H+L) proteintech SA00007-2 Dilution (1:200)
vascular clamp RWD Life Science R31006-04

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References

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