إثراء الأنسجة الثديية وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

يتم تقديم طريقتين لتخصيب الكوليسترول: تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول لإثراء أنسجة الثدييات والخلايا ، واستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد التخصيب للكوليسترول (الليبوزومات) لإثراء البويضات الزينيوبوس. هذه الطرق مفيدة لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الجسم في وظائف الجزيئية والخلوية والجهاز.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يمكن تحقيق إثراء الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا ، بما في ذلك البويضات Xenopus المستخدمة لدراسة وظيفة الخلية ، باستخدام مجموعة متنوعة من الطرق. وهنا، نصف نهجين هامين يستخدمان لهذا الغرض. أولاً، نحن نصف كيفية إثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول باستخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول باستخدام الشرايين الدماغية (الأنسجة) والخلايا العصبية فرس النهر (الخلايا) كأمثلة. يمكن استخدام هذا النهج لأي نوع من الأنسجة أو الخلايا أو خطوط الخلايا. نهج بديل لتخصيب الكوليسترول ينطوي على استخدام البروتين الدهني منخفض الكثافة (LDL). ميزة هذا النهج هو أنه يستخدم جزءا من آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية. ومع ذلك، في حين يمكن تطبيق نهج السيكلوديكسترين لإثراء أي نوع من الخلايا من الفائدة مع الكوليسترول، ويقتصر نهج LDL على الخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL (على سبيل المثال، خلايا الكبد، والخلايا المشتقة من نخاع العظام مثل الكريات البيض الدم والبلفة الأنسجة)، ومستوى الإثراء يعتمد على تركيز وحركة مستقبلات LDL. وعلاوة على ذلك، تشمل جزيئات LDL الدهون الأخرى، لذلك تسليم الكوليسترول غير محدد. ثانياً، نحن نصف كيفية إثراء البويضات الزينية مع الكوليسترول باستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد (أي الليبوزومات) التي تشمل الكوليسترول. تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير منطقي شائع يستخدم لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. لكل من نهج تخصيب الكوليسترول القائم على السيكلودكسترين من أنسجة الثدييات (الشرايين الدماغية) ولنهج تخصيب الكوليسترول القائم على الفوسفوليبيد من البويضات Xenopus ، نبرهن على أن مستويات الكوليسترول تصل إلى الحد الأقصى بعد 5 دقيقة من الحضانة. يبقى هذا المستوى من الكوليسترول ثابتًا خلال فترات الحضانة الممتدة (على سبيل المثال، 60 دقيقة). معا، توفر هذه البيانات الأساس للظروف الزمنية الأمثل لإثراء الكوليسترول من الأنسجة والخلايا، وoocytes Xenopus للدراسات الوظيفية التي تهدف إلى استجواب تأثير تخصيب الكوليسترول.

Introduction

الكوليسترول، والدهون الخلوية الرئيسية، يلعب العديد من الأدوار الوظيفية والهيكلية الحرجة,,,,,,,,9. من تنظيم الخصائص الفيزيائية لغشاء البلازما إلى ضمان بقاء الخلية والنمو والانتشار ، والعمل كجزيء إشارة وسلائف في عدد كبير من المسارات الكيميائية الحيوية ، الكوليسترول هو مكون ضروري لوظيفة الخلية والجهاز الطبيعي. ونتيجة لذلك، يؤدي نقص الكوليسترول إلى تشوهات جسدية حادة ومجموعة متنوعة من الاضطرابات. من ناحية أخرى ، حتى زيادة صغيرة في الكوليسترول فوق المستويات الفسيولوجية (2-3x) هي سامة للخلايا1،2،10 وقد ارتبطت بتطور الاضطرابات ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية11،12،13 والأمراض العصبية التنكسية14،15،16،17. وهكذا، لاستجواب الوظائف الحرجة للكولسترول وتحديد تأثير التغيرات في مستويات الكوليسترول، تم تطوير النهج المختلفة التي تغير محتوى الكوليسترول في الأنسجة والخلايا والبويضات Xenopus.

تغير مستويات الكوليسترول في أنسجة الثدييات والخلايا
يمكن تسخير العديد من النهج لتقليل مستويات الكوليسترول في الأنسجة والخلايا18. نهج واحد ينطوي على تعرضهم للستاتين الذائبة في مصل نقص البروتين الدهني لمنع اختزال HMG-CoA, الذي يتحكم في معدل تخليق الكوليسترول19,,20. ومع ذلك ، فإن هذه الأدوية المخفضة للكوليسترول تمنع أيضًا تشكيل منتجات غير ستيرول على طول مسار الميفالونات. لذلك ، يتم إضافة كمية صغيرة من الميفالونات للسماح بتشكيل هذه المنتجات21 وتعزيز خصوصية هذا النهج. نهج آخر لخفض مستويات الكوليسترول ينطوي على استخدام α-cyclodextrins. هذه مونومرات glucopyranose تمتلك تجويف الهيدروفوبيا الداخلية مع القطر الذي يطابق حجم الستيرول22، مما يسهل استخراج الكوليسترول من الخلايا ، وبالتالي استنزافها من محتواها الأصلي الكوليسترول23. مثال على ذلك هو 2-هيدروكسي بروبيل-α-cyclodextrin (HPαCD)، وهو دواء ما قبل السريرية التي يجري اختبارها حاليا لعلاج مرض نيمان بيك من النوع C، وهو اضطراب التمثيل الغذائي القاتل الموروثة وراثيا تتميز تخزين الكوليسترول الليسوسومي24. مستوى نضوب الكوليسترول يعتمد على مشتق معين المستخدمة. على سبيل المثال ، يستخرج HPαCD الكوليسترول بسعة أقل من مشتق الميثيل ، ميثيل - α - سيكلوديكسترين (MαCD)24،25، 26،27،,2828،29،30. ومع ذلك ، ومع ذلك ، يمكن أن استخراج الجزيئات الأخرى الكارهة للماء بالإضافة إلى الكوليسترول ، والتي قد تؤدي بعد ذلك إلى آثار غير محددة31. على النقيض من النضوب ، يمكن إثراء الخلايا والأنسجة على وجه التحديد مع الكوليسترول من خلال العلاج مع α-cyclodextrin التي تم تشبعها مسبقًا بالكوليسترول23. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا النهج كعنصر تحكم لخصوصية α-cyclodextrins المستخدمة لاستنفاد الكوليسترول31. استنفاد الكوليسترول من الأنسجة والخلايا أمر مباشر ويمكن تحقيقه عن طريق تعريض الخلايا لمدة 30-60 دقيقة إلى 5 mm MαCD مذابة في المتوسط المستخدم لتخزين الخلايا. هذا النهج يمكن أن يؤدي إلى انخفاض بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (على سبيل المثال، في الخلايا العصبية فرس النهر32، الشرايين الدماغية الفئران33). من ناحية أخرى ، يعد مجمع الكوليسترول في الدم لتخصيب الكوليسترول في الأنسجة والخلايا أكثر تعقيدًا ، وسيتم وصفه في قسم البروتوكول.

نهج بديل لإثراء الأنسجة والخلايا باستخدام α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول ينطوي على استخدام LDL, الذي يعتمد على مستقبلات LDL أعرب في الأنسجة / الخلايا18. في حين أن هذا النهج يوفر ميزة استخدام آلات التوازن الكوليسترول الطبيعي في الخلية ، إلا أن لديها العديد من القيود. أولاً، لا يمكن إثراء الأنسجة والخلايا التي لا تعبر عن مستقبلات LDL باستخدام هذا النهج. ثانياً، تحتوي جزيئات LDL على دهون أخرى بالإضافة إلى الكوليسترول. على وجه التحديد، LDL يتكون من البروتين ApoB100 (25٪) والدهون التالية (75٪): ~ 6-8٪ الكوليسترول، ~ 45-50٪ استر cholesteryl، ~ 18-24٪ فوسفوليبيدات، و ~ 4-8٪ triacylglycerols34. وبالتالي ، فإن تسليم الكوليسترول عبر جزيئات LDL غير محدد. ثالثا، قد تكون نسبة الزيادة في محتوى الكوليسترول من قبل LDL في الأنسجة والخلايا التي تعبر عن مستقبلات LDL أقل بكثير من الزيادة التي لوحظت باستخدام السيكلودكسترين المشبعة بالكوليسترول. على سبيل المثال ، في دراسة سابقة ، أدى إثراء الشرايين الدماغية القوارض مع الكوليسترول عن طريق LDL إلى زيادة 10-15٪ فقط في مستويات الكوليسترول35. في المقابل، أدى إثراء هذه الشرايين مع السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول كما هو موضح في قسم البروتوكول في > 50٪ زيادة في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 1).

تغيير مستويات الكوليسترول في البويضات Xenopus
تشكل البويضات الزينية نظام تعبير غير يروج يستخدم عادة لدراسة وظيفة الخلية والبروتين. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن نسبة الكوليسترول إلى الفوسفوليبيد المولي في البويضات Xenopus هو 0.5 ± 0.136. بسبب هذا المستوى المرتفع الجوهري من الكوليسترول ، فإن زيادة محتوى الكوليسترول في هذا النظام أمر صعب ، ومع ذلك يمكن تحقيقه باستخدام التشتت اتّسابه من فوسفوليبيدات الغشاء والكوليسترول. الفوسفوليبيدات التي اخترناها لهذا الغرض مماثلة لتلك المستخدمة لتشكيل ثنائيات الدهون البلانية الاصطناعية وتشمل L-α-phosphatidylethanolamine (البابا) و 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS)، كما هو موضح في قسم البروتوكول. يمكن أن يؤدي هذا النهج إلى زيادة بنسبة 50٪ في محتوى الكوليسترول (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 2).

نهج بديل لإثراء البويضات Xenopus مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد ينطوي على استخدام السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، والتي تشبه الطريقة التي يتم إثراء الأنسجة والخلايا. ومع ذلك ، وجدنا أن هذا النهج منخفض القابلية للاستنساخ والكفاءة ، مع زيادة في متوسط ~ 25٪ في محتوى الكوليسترول. وربما يرجع ذلك إلى اختلاف قدرة التحميل على هذين النهجين (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 3). في المقابل، فقد تبين أن استخدام السيكلوديكسترين لاستنفاد الكوليسترول من البويضات Xenopus يمكن أن يؤدي إلى انخفاض ~ 40٪ في محتوى الكوليسترول36.

هنا، ونحن نركز على إثراء الكوليسترول من أنسجة الثدييات والخلايا من خلال تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول، وoocytes Xenopus باستخدام الليبوزومات. ويمكن تسخير كلا النهجين لتحديد تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على وظيفة البروتين. قد تنطوي آليات تعديل الكوليسترول في وظيفة البروتين على تفاعلات مباشرة8 و / أو تأثيرات غير مباشرة9. عندما يؤثر الكوليسترول على وظيفة البروتين من خلال التفاعلات المباشرة ، فإن تأثير زيادة مستويات الكوليسترول على نشاط البروتين من المرجح أن يكون مستقلًا عن نوع الخلية أو نظام التعبير أو نهج الإثراء. على سبيل المثال، استوعنا هذين النهجين لتحديد تأثير الكوليسترول على G-بروتين مسور ة داخليتصحيح قنوات البوتاسيوم (GIRK) أعرب في myocytesالأذين37،الخلايا العصبية فرس النهر32،38، HEK29339 الخلايا ، وأوسيتس Xenopus 32،37. وكانت النتائج التي تم الحصول عليها في هذه الدراسات متسقة: في جميع الأنواع الثلاثة من خلايا الثدييات وفي البويضات البرمائية الكولسترول upregulationed وظيفة قناة GIRK (انظر قسم النتائج التمثيلية، الشكل 4،للخلايا العصبية فرس النهر والتجارب المقابلة في oocytes Xenopus). وعلاوة على ذلك، كانت الملاحظات التي أبديت في هذه الدراسات أيضا متسقة مع نتائج الدراسات التي أجريت في myocytes الأذينية37،40 وخلايا فرس النهر32،38 معزولة حديثا عن الحيوانات التي تتعرض لنظام غذائي عالي الكوليسترول40. وتجدر الإشارة إلى أن تخصيب الكوليسترول في الخلايا العصبية فرس النهر باستخدام MαCD عكس تأثير العلاج أتورفاستاتين المستخدمة لمعالجة تأثير النظام الغذائي ارتفاع الكوليسترول على حد سواء على مستويات الكوليسترول ووظيفة GIRK38. في دراسات أخرى، قمنا بدراسة تأثير الطفرات على حساسية الكوليسترول في قناة البوتاسيوم تصحيح داخلي Kir2.1 باستخدام كل من oocytes Xenopus وHEK293 خلايا41. مرة أخرى ، كان تأثير الطفرات على حساسية القناة مماثلًا في النظامين.

تطبيقات كل من أساليب التخصيب لتحديد تأثير ارتفاع مستويات الكوليسترول في الدم على الجزيئية، الخلوية، وظيفة الجهاز عديدة. على وجه الخصوص ، فإن استخدام مجمعات الكوليسترول السيكلوديكسترين لإثراء الخلايا والأنسجة شائع جدًا ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى خصوصيته. وتشمل الأمثلة الحديثة على هذا النهج تحديد تأثير الكوليسترول على تنشيط قناة HERG والآليات الأساسية42، واكتشاف أن الكوليسترول ينشط مستقبلات البروتين G المقترنة الملساء لتعزيز القنفذ إشارة43، وتحديد دور الكوليسترول في الميكانيكا الحيوية للخلايا الجذعية وadipogenesis من خلال البروتينات الرابط المرتبطة الغشاء44. في عملنا الخاص، وأننا تستخدم إثراء أنسجة الثدييات مع MαCD: مجمع الكوليسترول لدراسة تأثير تخصيب الكوليسترول على الوظيفة الأساسية والشخصية الدوائية من قنوات الكالسيوم والجهد المسورة من التوصيلات الكبيرة (BK، MaxiK) في العضلات الملساء الأوعية الدموية35،45،46. في دراسات أخرى، استخدمنا نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد لإثراء oocytes Xenopus مع الكوليسترول لتحديد أدوار المناطق المختلفة في Kir2.1 وقنوات GIRK في حساسية الكوليسترول41،47،48،49، وكذلك لتحديد مواقع ربط الكوليسترول المفترضة في هذه القنوات32،50،51.47

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية مع الحيوانات في مركز العلوم الصحية بجامعة تينيسي (UTHSC). تم مراجعة رعاية الحيوانات والبروتوكولات التجريبية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لـ UTHSC ، وهي مؤسسة معتمدة من قبل جمعية تقييم واعتماد المنظمة الدولية لرعاية الحيوانات المختبرية.

1. إثراء الأنسجة والخلايا باستخدام ميثيل-α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول

ملاحظة: بروتوكول تخصيب الكوليسترول أدناه مناسب للأنسجة والخلايا وخطوط الخلايا. على سبيل المثال، نحن نصف الخطوات التي أجريت لإثراء الشرايين الدماغية الثدييات. يتم توفير النتائج التمثيلية لكل من الشرايين الدماغية(الشكل 1)والخلايا العصبية(الشكل 4).

  1. إعداد MαCD المشبعة بالكوليسترول
    1. وزن 0.064 غرام من MαCD وتذوبه في قارورة تحتوي على 10 مل من محلول المالحة المخزنة بالفوسفات (PBS) للحصول على تركيز نهائي من MαCD 5 mM. حرك الحل بشريط ضجة لضمان حل MαCD بالكامل.
    2. وزن 0.0024 غرام من مسحوق الكوليسترول وإضافته إلى نفس القارورة للحصول على تركيز الكوليسترول 0.63 mM. ثم حرك الحل بقوة. استخدام ملعقة لتفريق أكبر عدد ممكن من قطع الكوليسترول (بعض قطع ستبقى حتى الحضانة).
    3. تغطية قارورة مع طبقتين على الأقل من فيلم البارافين ويهز ببطء (~ 30 التذبذبات / دقيقة) في حمام المياه 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. هذه الخطوة حاسمة.
    4. بعد 8-16 ساعة، قم بتبريد المحلول لدرجة حرارة الغرفة (RT)، ثم قم بتصفيته من خلال فلتر حقنة البولي إيثرسولفون 0.22 ميكرومتر في زجاجة زجاجية.
      ملاحظة: للوصول إلى تركيزات الكوليسترول المختلفة في الحل، قم بضبط كميات كل من الكوليسترول وMαCD بنسبة بسيطة. من المهم الحفاظ على نسبة مولر MαCD: الكوليسترول في 8:1 للحصول على تشبع حامل الميثيل-α-cyclodextrin مع الكوليسترول. يمكن استخدام محلول تخصيب الكوليسترول على الفور أو على مدار عدة أيام إذا تم تخزينه عند 4 درجات مئوية. ومع ذلك ، فإن القدرة على إثراء الكوليسترول تنخفض مع مرور الوقت مع ظهور مجاميع الكوليسترول ، ويصبح الحل غائمًا.
  2. علاج الشرايين الدماغية مع MαCD المشبعة بالكوليسترول
    1. القتل الرحيم الجرذ سبراغ داولي (250-300 ز) عن طريق وضعه في غرفة مع 2٪ isoflurane. ثم، قطع رأس الفئران مثير للسمرة باستخدام مقصلة حادة أو زوج حاد كبير من مقص.
      ملاحظة: إذا كان تنفيذ هذه الإجراءات بانتظام، فمن المفيد وضع جدول زمني لشحذ المقصلة. أيضا، ينبغي تخصيص زوج منفصل من مقص لقطع الرأس القوارض. قطع رأس القوارض هو إجراء نهائي. لذلك ، لا يجب أن تكون الأدوات عقيمة. التنظيف بالماء والصابون بعد كل استخدام يكفي.
    2. ضع رأس الجرذ مواجهاً للأمام بعيداً عن الباحث ضع الجزء المدبب من زوج متوسط الحجم من المقص بين الجمجمة وجذع الدماغ ، وتقطع بشكل لاحق على كلا الجانبين.
    3. استخدام ملقط لابعاد الجمجمة العليا مفتوحة عن طريق سحب ما يصل على قاعدة الجمجمة حيث تم إجراء التخفيضات الجانبية وإزالة الدماغ بعناية. تأكد من قطع الأعصاب البصرية التي تعقد الدماغ داخل الجمجمة.
    4. وضع الدماغ في كوب مع برنامج تلفزيوني على الجليد بعد إزالته.
      ملاحظة: يمكن تخزين الدماغ على الجليد لمدة 4-6 ساعة في 4 درجة مئوية.
    5. في بيئة غير معقمة نقل الدماغ الفئران إلى وعاء تشريح مشمع مع ما يكفي من برنامج تلفزيوني لغمره. دبوس الدماغ إلى أسفل لمنعها من التحرك.
      ملاحظة: الخطوة 1.2.5 يمكن تنفيذها في RT إذا تم تنفيذها بسرعة. خلاف ذلك، فإنه يجب أن يتم على الجليد.
    6. استخدام ملقط حادة ومقص الجراحية الصغيرة لتشريح الشرايين الدماغية وفروعها التي تشكل دائرة وليس في قاعدة الدماغ تحت المجهر في برنامج تلفزيوني في RT. كن لطيف عند تشريح لضمان عدم تمدد أنسجة الشريان أو قطعها. هذه الخطوة حاسمة.
    7. شطف شرائح الشريان لفترة وجيزة (تصل إلى 1 سم طويلة) في برنامج تلفزيوني إما في لوحة بئر 96 أو في طبق 35 ملم لإزالة بقايا الدم، ومن ثم وضعها لمدة 10 دقيقة في ما يكفي من محلول تخصيب الكوليسترول (أعدت في الخطوة 1.1) لتغطية شرائح الشريان بأكملها. استخدم طبقًا من 35 مم إذا كان هناك كمية وافرة من محلول تخصيب الكوليسترول وطبق بئر 96 إذا كانت الشرايين صغيرة أو إذا كان هناك نقص في محلول تخصيب الكوليسترول.
      ملاحظة: يمكن استخدام نفس النهج لإثراء الأنسجة والخلايا الأخرى مع الكوليسترول باستخدام وقت حضانة 60 دقيقة. على سبيل المثال، وقد استخدمت هذه الطريقة سابقا لتخصيب الكوليسترول من الشرايين الدماغية الماوس35،45، خلايا فرس النهر32، myocytes الأذين37 ، وHEK 293 الخلايا39.37 يجب تحديد الحد الأدنى من وقت الحضانة لكل نوع من الأنسجة أو الخلايا استنادًا إلى التحقق من تخصيب الكوليسترول في نقاط زمنية مختلفة مع قياس حساس للكوليسترول (على سبيل المثال ، التحديد الكيميائي الحيوي لكمية الكوليسترول في الأنسجة عن طريق تلطيخ مع صبغة الفلورسين الحساسة للكوليسترول.
  3. وصمة عار أنسجة الشريان مع صبغة الفلورسين الحساسة الستيرويد فلبيني لتحديد أي تعديلات في مستويات الكوليسترول في الدم.
    ملاحظة: في قسم النتائج التمثيلية، نبين نتائج نهجين لتقييم التغيرات في مستويات الكوليسترول: فحص كيميائي حيوي يتم تنفيذه من خلال تطبيق مجموعة تعتمد على الكوليسترول الأوكسيديز يتوافر تجارياً (انظر جدول المواد)وتلطيخ مع صبغة الفلورسين الحساسة للالستيرويد. يمكن تنفيذ النهج الأول باتباع تعليمات الشركة المصنعة. ويرد أدناه بروتوكول النهج الأخير.
    1. باستخدام زجاجة جديدة من مسحوق فيليبين، وإعداد محلول مخزون 10 ملغ/مل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). هذه الخطوة حاسمة.
      ملاحظة: الحل الناتج حساس للضوء. إذا أعدت بشكل صحيح، حل الأسهم فيليبين هو مصفر. قد يلتصق بعض مسحوق الفلبينيين بغطاء الزجاجة. لذلك ، من المهم شطف الزجاجة والغطاء مع مذيب DMSO للاحتفاظ بالكمية الكاملة من الفلبينية. بمجرد إعدادها ، يجب استخدام مخزون الفلبينيين في غضون عدة أيام. فيليبين يفقد تماما قدرته على الفلورسين بعد 5 أيام، حتى عندما يتم تخزينها في الظلام في -20 درجة مئوية.
    2. إزالة شرائح الشريان من محلول تخصيب الكوليسترول وغسلها 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة.
    3. إصلاح شرائح الشريان في 4٪ paraformaldehyde لمدة 15 دقيقة على الجليد.
      تنبيه: بارافورمالديهايد حساس للضوء. ولذلك، يجب أن يتم العمل في الظلام.
    4. وضع شرائح الشريان في 0.5٪ تريتون في برنامج تلفزيوني في RT لمدة 10 دقيقة لpermeabilize الأنسجة وتسهيل تغلغل الصبغة.
    5. غسل شرائح الشريان 3x مع برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقيقة على شاكر. هذه الخطوة حاسمة.
      ملاحظة: عندما تم غسلها تماما تريتون، لا ينبغي أن يكون هناك أي فقاعات على سطح محلول PBS.
    6. تمييع محلول الأسهم الفلبينية في PBS إلى تركيز نهائي قدره 25 ميكروغرام/مل. إزالة الشرايين تشكل محلول PBS ووضعها في محلول فيليبين المخفف لمدة 1 ساعة في الظلام. هذه الخطوة حاسمة.
    7. غسل فيليبين عن طريق الرصال ة شرائح الشريان 3x مع PBS لمدة 5 دقيقة على شاكر. هذه الخطوة حاسمة.
    8. شطف شرائح الشريان لفترة وجيزة بالماء المقطر، وامتصاص السائل المفرط مع منديل ورقة، وجبل الشرايين على شريحة باستخدام وسائل الإعلام التركيب المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).
    9. غطي الشريان بقسيمة غطاء تتجنب المتداول أو التواء الشريان وتعيين الشرائح لتجف في منطقة مظلمة في RT لمدة 24 ساعة.
    10. بعد أن يجف وسائل الإعلام المتصاعدة، ختم حواف غطاء مع طلاء الأظافر واضحة، وترك طلاء الأظافر لتجف لمدة 10-15 دقيقة. تخزين الشرائح في الظلام في -20 درجة مئوية.
    11. معادلة الشرائح إلى RT قبل التصوير.
    12. صورة الأنسجة مع المجهر الفلوري أو قارئ الفلورسينس مع الإثارة تعيين في 340-380 نانومتر والانبعاثات في 385-470 نانومتر.
      تنبيه: فيليبين photobleaches بسرعة; وبالتالي ، يجب أن يتم عرض العينات على الفور.

2. إثراء البويضات Xenopus باستخدام التشتت القائم على الفوسفوليبيد الغني بالكوليسترول (الليبوزومات)

  1. إعداد الحلول
    1. لإعداد محلول مخزون من الكوليسترول ، قم بإذابة 10 ملغ من مسحوق الكوليسترول في 1 مل من الكلوروفورم في كوب زجاجي أو زجاجة 10 مل. نقل الحل إلى زجاجة مغطاة بـ 1.5 مل.
      تنبيه: في ضوء سمية الكلوروفورم والتبخر السريع له، اعمل في غطاء محرك السيارة والحفاظ على الكواشف على الجليد.
    2. إعداد 150 mM KCl، 10 mM تريس-HEPES، درجة الحموضة = 7.4 المخزن المؤقت للفوسفوليبيدات المخصب بالكوليسترول. للقيام بذلك، حل في قارورة Erlenmeyer 5.5905 غرام من KCl و 0.6057 غرام من تريس في الماء المقطر المزدوج إلى ما مجموعه 0.5 لتر حجم. في قارورة أخرى، حل 5.5905 غرام من KCl و 1.19155 غرام من HEPES في الماء المقطر المزدوج إلى ما مجموعه 0.5 لتر حجم. اخلطي الحلين معًا في قارورة 1 لتر إرلنماير، وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl.
      ملاحظة: تخزين الناتج 150 mM KCl، 10 mM تريس-HEPES الحل في 4 درجة مئوية.
    3. لإعداد ND96 قبل المتوسطة oocyte عبادة (منخفضة K+، منخفضة Ca2 +) العازلة، والجمع بين 1 مل من 2 M KCl، 1 مل من 1 M MgCl45.5 مل من 2 M NaCl، و 5 مل من 1/1 M NaOH-HEPES في قارورة 1 لتر Erlenmeyer. أضف الماء المقطر المزدوج بسعة 900 مل وضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع HCl. انقل المحلول إلى أسطوانة 1 لتر وارفع مستوى الصوت إلى 1 لتر مع الماء المقطر المزدوج. ثم إضافة 1.8 مل من 1 M CaCl2 وتصفية الحل.
      ملاحظة: لا يبدو أن الاختلافات الطفيفة في النسب بين المكونات المستخدمة في صنع حل ND96 حاسمة لتخصيب الكوليسترول، ربما لأن محلول ND96 لا يستخدم أثناء خطوة التخصيب نفسها ولكن للتخزين. مثال على ذلك هو محلول 1 L يحتوي على تركيز أقل قليلاً من أيونات الصوديوم وكلوريد ، ويتم ذلك عن طريق الجمع بين 2 مل من 1 M KCl ، 1 مل من 1 M MgCl2، 82.5 مل من 1 M NaCl ، 5 مل من 1 M HEPES ، و 1.8 مل من 1 M CaCl2 (Ca2 + يتم حذفها للحصول على حل Ca 2+ مجاني). ضبط درجة الحموضة من الحل إلى 7.4 مع NaOH. تخزين الناتج ND96 oocyte حل التبهي في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 1 شهر.
  2. إعداد التشتت القائم على الفوسفوليبيد مع الليبوزومات الكوليسترول
    1. في أنبوب زجاجي 12 مل، اجمع بين 200 ميكرولتر من كل من محاليل الدهون المذابة ذات الـ 10 ملغ/مل التالية: L-α-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine, والكوليسترول.
    2. يتبخر الكلوروفورم في غطاء محرك السيارة ليجف ببطء تحت تيار من النيتروجين. هذه الخطوة حاسمة.
    3. تعليق الدهون في 800 ميكرولتر من محلول المخزنة المؤقتة تتكون من 150 mM KCl و 10 mM Tris-HEPES في درجة الحموضة = 7.4، وتغطية مع فيلم البارافين.
    4. سونيكات بلطف في 80 كيلو هرتز لمدة 10 دقيقة حتى يتم تشكيل خليط حليبي. هذه الخطوة حاسمة.
      تنبيه: عند سونيكاتينج، يجب أن يهتز التشتت في الأنبوب الزجاجي بلطف، وتشكيل موجات صغيرة. قطرات من التشتت لا ينبغي أن يكون القفز داخل الأنبوب.
  3. إثراء البويضات Xenopus مع الكوليسترول
    ملاحظة: يمكن الحصول على المبيضين المحتويين على البويضات من مصدرين: أولاً، يمكن إيواء ضفادع الإناث Xenopus laevis لغرض الجراحة الداخلية. ويجب أن توافق اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها على هذا الإجراء. ثانياً، يمكن شراء المبيضين الكاملين من الموردين التجاريين. كبديل لشراء أو عزل المبيضين الكاملين ثم هضمها كما هو موضح في الخطوات 2.3.1-2.3.4 ، تتوفر البويضات الفردية تجاريًا للشراء. إذا تم استخدام هذا الأخير، يمكن تخطي الخطوات 2.3.1-2.3.4.
    1. الحفاظ على المبيضين الطازجة في ~ 14 درجة مئوية في محلول ND96. في ظل هذه الظروف، يمكن تخزين المبيضين لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
    2. للحصول على البويضات الفردية، اعطل كيس المبيض في أماكن متعددة باستخدام ملقط حادة. ضع قطع المبيض في لوحة 60 مم، مع 5 مل من Ca2+-FREE ND96 مُكمّلة بـ 0.5 ملغم/مل كولاكولاز. يهز على شاكر المداري في 60 التذبذبات / دقيقة لمدة 15 دقيقة في RT.
      ملاحظة: ستضمن هذه الخطوة هضم كيس المبيض. للحفاظ على النشاط الأنزيمي، تجنب تخزين الكولاجين الذي يحتوي على ND96 لفترات طويلة من الزمن (> 1 ساعة). حتى التخزين القصير يجب أن يتم في درجات حرارة باردة من تحت 15 درجة مئوية.
    3. باستخدام ماصة نقل مع طرف واسع، ماصة بقوة الحل المحتوي على oocyte صعودا وهبوطا ما يقرب من 5-10x لفصل oocytes الفردية. في هذه الخطوة، سوف يتحول الحل إلى الظلام.
    4. شطف بسرعة oocytes مع Ca2 +خالية ND96 حتى يصبح الحل شفافا.
    5. نقل البويضات الفردية إلى Ca2+-التي تحتوي على حل ND-96 المكمل ة بـ 2 ملغم/مل من جنتاميسين باستخدام ماصة نقل مع طرف ضيق.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية عندما يكون من الضروري تخزين البويضات. يمكن تخزين البويضات الفردية في حاضنة لعدة أيام عند 14-17 درجة مئوية. ومع ذلك ، يجب إزالة البويضات الميتة التي هي بيضاء على الأقل مرة واحدة في اليوم لتجنب تلوث المحلول بالمواد الكيميائية السامة.
    6. نقل 90 ميكرولتر من التشتت القائم على الفوسفوليبيد المخصب بالكوليسترول إلى بئر واحد من طبق بئر 96.
    7. نقل ما يصل إلى ستة oocytes من المتوسط ND96 إلى البئر مع أقل قدر ممكن من المتوسطة. هذه الخطوة حاسمة.
      تنبيه: لا تعرض البويضات للهواء أثناء النقل للحفاظ على البويضات سليمة.
    8. ضع لوحة البئر 96 على دوار منصة ثلاثية الأبعاد لتوفير حركة مدارية صغيرة للبويضات في الخلية لمدة 5-10 دقيقة.
    9. إضافة قطرة من ND96 في البئر، ونقل البويضات المخصب بالكوليسترول من لوحة البئر 96 إلى لوحة 35 ملم مع ND96 للاستخدام الفوري. هذه الخطوة حاسمة.
    10. استخدام مجموعة المتاحة تجاريا للكوليسترول الأوكسيديز (انظر جدول المواد)لتقييم التغيرات في مستويات الكوليسترول باتباع تعليمات الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدام السيكلوديكسترين المشبعة بالكوليسترول كوسيلة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول هو راسخ. هنا، ونحن أول من إظهار تطبيق هذا النهج المستخدمة على نطاق واسع لإثراء الشرايين الدماغية الفئران مع الكوليسترول باستخدام MβCD المشبعة الكوليسترول. يوضح الشكل 1A مثالًا على طبقة العضلات الملساء الشريان الدماغي المصوّرة ويوضح الزيادة المعتمدة على التركيز في الفلورسين المرتبط بفيليبين التي يتم الحصول عليها عند إثراء الأنسجة مع تركيزات متزايدة من الكوليسترول تتراوح بين 6.25 ميكرومتر-6.25 متر مربع لساعة واحدة. ويصور التقدير الكمي المقابل لبيانات التصوير في الشكل 1B. وتجدر الإشارة إلى أن الزيادة في مستويات الكوليسترول 2 ساعة بعد فترة الحضانة 1 ساعة كانت ~ 50٪ من الزيادة التي لوحظت مباشرة بعد العلاج مع مجمع MβCD:الكوليسترول. كما يوضح الشكل 1C للعينة المعالجة بالكوليسترول 0.625 mM لمدة ساعة واحدة ، يجب إجراء الدراسات الوظيفية باستخدام الأنسجة المعالجة في أقرب وقت ممكن بعد الانتهاء من تخصيب الكوليسترول. وعلاوة على ذلك، في حين أن 1 ح وقت الحضانة يستخدم عادة لإثراء الأنسجة والخلايا مع الكوليسترول باستخدام هذا النهج، 5 دقيقة من الحضانة عادة ما تكون كافية لتحقيق زيادة كبيرة إحصائيا في محتوى الكوليسترول الشريان الدماغي كما يحددها الكولسترول القائم على الاوكسيدة البيوكيميائية القول، كما هو مبين في الشكل 1D. ظلت الزيادة في محتوى الكوليسترول في الدم على نفس المستوى عندما تم زيادة وقت الحضانة إلى 60 دقيقة(الشكل 1D).

وتتجلى فعالية الليبوزومات الغنية بالكوليسترول كوسيلة لإثراء البويضات الزينية مع الكوليسترول في الشكل 2A-C. في حين لم يلاحظ أي تغيير كبير في مستويات الكوليسترول في التحكم التشتت القائم على الفوسفوليبيد التي تفتقر إلى الكوليسترول(الشكل 2A)، زادت مستويات الكوليسترول بشكل كبير بعد 5 دقيقة فقط من العلاج مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد الذي شمل الكوليسترول ، وظل على نفس المستوى عندما تم زيادة وقت الحضانة إلى 60 دقيقة(الشكل 2B). ولوحظ تأثير مماثل في دفعتين مختلفتين من البويضات التي تم الحصول عليها من ضفدعين. ومع ذلك ، بشكل ملحوظ ، اختلف كل من المستويات الأولية للكوليسترول والتغير في محتوى الكوليسترول بين دفعتين: في الدفعة 1 ، كان التركيز الأولي للكوليسترول 64 ميكروغرام من الكوليسترول لكل ملغ من البروتين ، في حين أن التركيز الأولي في الدفعة 2 كان 45 ميكروغرام من الكوليسترول لكل ملغ من البروتين ، وهو ما يقرب من 70 ٪ من المستويات الأولية للكوليسترول في الدفعة 1. بعد علاج 60 دقيقة ، كان تركيز الكوليسترول في الدفعة 1 1 124 ميكروغرام من الكوليسترول لكل ملغ من البروتين ، في حين كان في الدفعة 2 67 ميكروغرام من الكوليسترول لكل ملغ من البروتين. وهكذا، في حين أن تركيز الكوليسترول زاد بأكثر من ~ 90٪ في الدفعة 1، فإنه زاد بنسبة ~ 50٪ في الدفعة 2. ومع ذلك ، فإن الزيادة الكبيرة في مستويات الكوليسترول في كلتا الدفعات توفر وسيلة للتحقيق في تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على وظيفة البروتينات المعبر عنها في هذا النظام التعبير غير المتجانس. وعلاوة على ذلك، فإن نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد لإثراء أوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول يبدو أن أكثر فعالية من تطبيق السيكلوديكسترين المشبعة الكوليسترول كما هو الحال في الأنسجة والخلايا. كما يوضح الشكل 3 ، أدى تطبيق مجمعات الكوليسترول السيكلوديكسترين لإثراء البويضات باستخدام 5mM cyclodextrin في متوسط زيادة ~ 25٪ فقط في مستويات الكوليسترول.

كما تظهر فعالية النهج القائم على السيكلوكترين للخلايا الغنية في الخلايا العصبية المعزولة حديثا عن منطقة CA1 من قرن آمون(الشكل 4A). كما يظهر الشكل 4 أدى حضانة الخلايا العصبية في MαCD المشبعة الكوليسترول لمدة 60 دقيقة في زيادة أكثر من 2x في مستويات الكوليسترول على النحو المحدد من قبل الفلورسين المرتبطة. باستخدام هذا النهج، اختبرنا تأثير الزيادة في الكوليسترول على قنوات GIRK المعبر عنها في الخلايا العصبية فرس النهر. كما يوضح الشكل 4 أدى هذا التغير في مستويات الكوليسترول في الدم إلى زيادة كبيرة في تيارات GIRK. وبالمثل، اختبرنا تأثير تخصيب الكوليسترول على الوحدة الفرعية جيرك الأولية المعبر عنها في الدماغ، GIRK2، وذلك باستخدام نظام التعبير غير المتجانس Xenopus oocytes. وتحقيقا لهذه الغاية، أعربنا عن OVERK2 ^ (GIRK2_E152D)، وهو مسام متحولة من GIRK2 أن يزيد من التعبير الغشائية والنشاط52 في البويضات Xenopus، وإثراء البويضات مع الكوليسترول لمدة 60 دقيقة باستخدام نهج التشتت القائم على فوسفوليبيد. كما تظهر الأرقام 4D-F, الزيادة في مستويات الكوليسترول في الدم أدى إلى زيادة كبيرة في التيارات مماثلة لتأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الخلايا العصبية على وظيفة قناة GIRK. هذه البيانات تظهر كذلك فعالية, اتساق, وفائدة من النهجين المذكورين أعلاه لتحديد تأثير زيادة مستويات الكوليسترول في الدم على نشاط البروتين والوظيفة الخلوية.

Figure 1
الشكل 1: إثراء تمثيلي للشرايين الدماغية الفئران مع الكوليسترول باستخدام الميثيل-α-cyclodextrin المشبعة الكوليسترول. (أ)مثال على صورة شريان دماغي طبقة العضلات الملساء مما يدل على زيادة التركيز المعتمدة في الفلورسين المرتبطة بفيليبين الحصول على إثراء الأنسجة مع زيادة تركيزات الكوليسترول تتراوح بين 6.25 ميكرومتر-6.25 mm لساعة واحدة(ب)القياس الكمي لبيانات التصوير في (أ). تم تنفيذ قياس شدة الفلورسينس للصورة بأكملها باستخدام وظيفة "القياس" المضمنة في البرامج التجارية. في كل تركيز الكوليسترول، تم جمع ≥ 3 صور من الشرايين التي تم حصادها من المتبرعين الحيوانات منفصلة. لكل تركيز الكوليسترول، يتم تقديم البيانات كخطأ معياري متوسط ± . (ج)مستويات الكوليسترول في الشريان الدماغي شرائح طبقة العضلات الملساء مباشرة بعد فترة حضانة 1 ساعة مع 0.625 mM الكوليسترول، و 3 ح بعد بداية العلاج (أي، 1 ح من الحضانة تليها 2 ح في برنامج تلفزيوني). (د)اعتماد مستويات الكوليسترول في وقت الحضانة كما يحددها مقياس كيميائي حيوي قائم على أكسدة الكوليسترول. ويشار إلى اختلاف كبير من قبل النجمة (* ع ≤ 0.05). تم تعديل الألواح(A)(تركيزات الكوليسترول 0 mM-0.625 mM) و(B)و(C)من الشمال وآخرين45. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: إثراء تمثيلي من البويضات Xenopus مع الكوليسترول باستخدام الليبوزومات. (أ)تغيير أضعاف في مستويات الكوليسترول في السيطرة البويضات Xenopus المحتضن ة في الليبوزومات الخالية من الكوليسترول Xenopus لمدة 5-60 دقيقة. يشير شريط التحكم المصور إلى الحضانة في الليبوزومات الخالية من الكوليسترول لمدة 5 دقيقة ويظهر على سبيل المقارنة. (C)مقارنة تأثير تخصيب الكوليسترول من دفعتين مختلفتين من البويضات Xenopus باستخدام الليبوزومات المخصب ة بالكوليسترول لمدة 5 و 60 دقيقة. ويشار إلى اختلاف كبير من قبل النجمة (* ع ≤ 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: إثراء تمثيلي لبويضات Xenopus مع الكوليسترول باستخدام ميثيل-α-cyclodextrin المشبعة بالكوليسترول. (أ)تغيير أضعاف في مستويات الكوليسترول في السيطرة البويضات Xenopus المحتضن ة في السيطرة ND96 وسائل الإعلام لمدة 5-60 دقيقة.(ب)أضعاف التغيير في مستويات الكوليسترول في الدم من البويضات Xenopus المحتضن ة في MαCD المشبعة الكوليسترول لمدة 5-60 دقيقة. يشير شريط التحكم المصور إلى الحضانة في وسائط التحكم لمدة 5 دقيقة ويظهر على سبيل المقارنة. ويشار إلى اختلاف كبير من قبل النجمة (* ع ≤ 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: أمثلة تمثيلية لدراسات تخصيب الكوليسترول على وظيفة البروتين في الخلايا وبويضات Xenopus: تأثير الكوليسترول على G-بروتين تصحيح قنوات البوتاسيوم داخليا. (أ)إشارة الفلورسين المرتبطة بفيليبين من الخلايا العصبية الهرمية CA1 فرس النهر من الفئران على السيطرة (يسار) مقابل الكوليسترول المخصب (يمين). (ب)البيانات الموجزة من إشارات الفلورسين المرتبطة filipin التي تم الحصول عليها من السيطرة والكوليسترول المخصب حديثا فرس النهر معزولة CA1 الخلايا العصبية الهرمية. تم تحقيق إثراء الكوليسترول عن طريق احتضان الخلايا العصبية في MαCD المشبعة بالكوليسترول لمدة 1 ساعة (ن = 12-14). (C)التيار الأيوني (I) -الجهد (V) منحنى يصور تأثير إثراء الكوليسترول كما هو موضح في(B)على تيارات GIRK في الخلايا العصبية فرس النهر من منطقة CA1. (D)آثار تمثيلية تبين تأثير إثراء الكوليسترول باستخدام الليبوزومات القائمة على الفوسفوليبيد الغنية بالكوليسترول على GIRK2^ (GIRK2_E152D) المعبر عنها في البويضات Xenopus في -80 mV و +80 mV. (E)بيانات موجزة من (D) في -80 mV (ن = 6-9). ويشار إلى اختلاف كبير من قبل النجمة (* ع ≤ 0.05). تم تعديل الأرقام الفرعية(B-E)من بوكيا وآخرون32. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تشكل طرق إثراء أنسجة الثدييات والخلايا وأوسيتس زينوبوس مع الكوليسترول أداة قوية للتحقيق في تأثير مستويات الكوليسترول المرتفعة على الأنواع الجزيئية الفردية ، وعلى الأنظمة الجزيئية المعقدة (مثل البروتينات) ، وعلى وظيفة الجهاز الخلوي والجهاز. وقد وصفنا في هذه الورقة نهجين متكاملين ييسران إجراء هذه الدراسات. أولاً، وصفنا كيفية إثراء الأنسجة والخلايا بالكوليسترول باستخدام MαCD المشبعة بالكوليسترول. أظهرنا أنه في شرائح الشريان الدماغي ، أدى هذا النهج إلى زيادة ~ 50٪ في مستويات الكوليسترول في الدم. وعلاوة على ذلك، في دراسة حديثة، أظهرنا أن نفس النهج يؤدي إلى زيادة أكثر من 2x في محتوى الكوليسترول في الخلايا العصبية فرس النهر من منطقة CA1. في المقابل، ومع ذلك، فإن استخدام هذا النهج كوسيلة لإثراء البويضات Xenopus أدى فقط إلى زيادة ~ 25٪ في محتوى الكوليسترول في البويضات Xenopus. وهكذا، لإثراء البويضات Xenopus، قمنا بتطوير نهج التشتت القائم على الفوسفوليبيد الذي يؤدي باستمرار إلى زيادة ~ 50٪ على الأقل في مستويات الكوليسترول. فمن الممكن أن ميزة هذا النهج لإثراء البويضات Xenopus ينبع من تعزيز قدرة التحميل بالمقارنة مع قدرة التحميل من النهج MαCD: الكوليسترول المعقدة. ومن الممكن أيضا أنه في حين تم تحسين نهج MαCD: الكوليسترول المعقدة لإثراء الأنسجة والخلايا، مطلوب مزيد من التحسين للبروتوكول لتحسين تطبيقه لإثراء oocytes Xenopus.

التشتت القائم على فوسفوليبيد المستخدمة لإثراء البويضات Xenopus مع الكوليسترول يتضمن اثنين من الدهون التي تستخدم على نطاق واسع لخلق bilayers الدهون البلان (أي L-α-phosphatidylethanolamine و 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). ومع ذلك، في دراسة سابقة، تبين أن البويضات Xenopus يمكن أيضا أن تثري باستخدام الكوليسترول من الليبوزومات التي شملت فوسفاتيديل كولين وcholate36. أدت هذه الطريقة إلى زيادة نسبة الموليللك/الفوسفوليبيد في غشاء البلازما من 0.5 ± 0.1 إلى 0.9 ± 0.1 مع متوسط نسبة إثراء 71٪. هذه النسبة المئوية المتوسطة للإثراء تشبه إلى حد كبير متوسط مستوى الزيادة في محتوى الكوليسترول الذي لاحظناه (~ 70.5٪) ، مما يشير إلى أن اختيار الفوسفوليبيدات المستخدمة لتشكيل التشتت ليس حاسمًا لإثراء أوسيتس Xenopus مع الكوليسترول باستخدام هذا النهج.

يتضمن كل بروتوكول موصوف عدة خطوات حاسمة. بعد إعداد خليط MαCD: الكوليسترول بنسبة ضرس 8:1 لضمان تشبع MαCD مع الكوليسترول ، من الأهمية بمكان تغطية القارورة مع طبقتين على الأقل من فيلم البارافين وتعيينها في حمام مائي يهز ببطء 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. عند تشريح الأنسجة لعلاج الكوليسترول من المهم أن تكون لطيفة لضمان عدم تمدد الأنسجة أو قطعها. بعد permeabilizing الأنسجة لتسهيل تغلغل الصبغة، فمن الأهمية بمكان لغسل شرائح الأنسجة في برنامج تلفزيوني. يجب أن يتم تلطيخ الأنسجة في الفيليبين في الظلام ، ويجب غسل الفيليبين بدقة بعد الانتهاء من تلطيخ. عند إعداد التشتت القائم على الفوسفوليبيد المخصب بالكوليسترول ، من الأهمية بمكان التأكد من أن التشتت في الأنبوب الزجاجي يهتز بلطف ، مما يشكل موجات صغيرة ، لتجنب فصل الكوليسترول عن التشتت. لعلاج الكوليسترول من البويضات Xenopus، من المهم لنقل البويضات من المتوسط ND96 إلى البئر مع التشتت القائم على الفوسفوليبيد المخصب بالكوليسترول مع أقل قدر ممكن من المتوسط مع عدم تعريض البويضات للهواء للحفاظ على البويضات سليمة. من المهم ملاحظة أنه بسبب الآلات الجوهرية في الأنسجة والخلايا وبويضات Xenopus ، قد تتوازن مستويات الكوليسترول ، ثم تعود إلى مستوياتها الأصلية بمرور الوقت. وبالتالي، يجب إجراء الدراسات الوظيفية مباشرة بعد وقت الحضانة. هنا ، أظهرنا هذا المفهوم في الشرايين الدماغية المخصب مع الكوليسترول ، وتبين أن الزيادة في مستويات الكوليسترول 2 ساعة بعد فترة حضانة 1 ح كان ما يقرب من نصف الزيادة التي لوحظت مباشرة بعد فترة الحضانة.

وعلى الرغم من اتباع الخطوات الحرجة المذكورة أعلاه، قد تنشأ عدة تحديات. على سبيل المثال، قد لا تلاحظ زيادة في مستويات الكوليسترول بعد العلاج المغنى للكوليسترول. إذا كان هذا هو الحال، قد يكون من الضروري زيادة تركيز الكوليسترول في وسائل الإعلام المثرية للكوليسترول. وينطبق الشيء نفسه على تخصيب الكوليسترول من الأنسجة والخلايا والبويضات Xenopus. ومع ذلك ، في إعداد العلاجات باستخدام نهج MαCD: الكوليسترول المركب ، يجب زيادة كمية MαCD مع زيادة تركيز الكوليسترول للحفاظ على نسبة ضرس 8:1 مع الكوليسترول. بالإضافة إلى ذلك ، قد يكون من الضروري إعداد محلول جديد لإثراء الكوليسترول ، لأن الكوليسترول يميل إلى التسرّب للخروج من الحل ، ويفقد الحل كفاءته في إثراء الكوليسترول. بعد تخصيب الكوليسترول ، من الممكن عدم ملاحظة إشارة فيليبين. إذا كان هذا هو الحال، قد يكون من الضروري استخدام مسحوق فيليبين الطازجة لإعداد مخزون جديد وتكرار التجربة. فيليبين الفلورية ينخفض بسرعة، ولا يمكن تخزين محلول الأسهم لأكثر من عدة أيام. أحد القيود على تلطيخ فيليبين هو أنه يبدو أن التعرف على المنشطات الأخرى من الكوليسترول. على سبيل المثال ، أظهرنا مؤخرًا زيادة في إشارة الفلورسين المرتبطة بفيليبين في الشرايين الدماغية للفئران بعد الإثراء مع coprostanol45. وبالتالي، ينبغي تفسير نتائج تلطيخ الفيليبين بحذر، وعندما يكون هناك شك، ينبغي استخدام نُهج بديلة لتأكيد النتائج. أحد الاحتمالات هو إجراء عملية معاينة كيميائية حيوية من خلال تطبيق مجموعة من الأكسدة المتاحة تجارياً.

وباختصار ، فإن النهج المعروضة فعالة جدا في تحقيق إثراء الكوليسترول ما يقرب من أو يتجاوز 50 ٪. في الواقع، فإن النهج المعقد MαCD: الكوليسترول الذي ينتج عنه ~ 50٪ في مستويات الكوليسترول في الشرايين الدماغية هو أكثر كفاءة بكثير من استخدام LDL لإثراء هذه الأنسجة، مما يؤدي إلى زيادة ~ 10٪ في الكوليسترول35. وينطبق الشيء نفسه على تطبيق التشتت القائم على الفوسفوليبيد التخصيب بالكوليسترول (الليبوزومات) لإثراء البويضات الزينيوبوس. كما هو موضح أعلاه، يؤدي هذا النهج باستمرار إلى زيادة بنسبة 50٪ على الأقل في مستويات الكوليسترول في الدم. الأهم من ذلك، هذين النهجين لتخصيب الكوليسترول في المختبر النتائج العائدة التي هي مماثلة مع زيادة الكوليسترول التي تم الحصول عليها عن طريق إخضاع الحيوانات لنظام غذائي عالي الكوليسترول32،37،40،53،54. وعلاوة على ذلك، وعلى النقيض من الوجبات الغذائية ارتفاع الكوليسترول في الدم لمدة أسابيع، في نهج المختبر تتطلب بضع دقائق فقط من وقت الحضانة للوصول إلى زيادة هامة إحصائيا وثابتة في الدولة في مستوى الكوليسترول في الدم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الدكتور أ. م. دوبيكو هو موظف فيدرالي خاص وبدوام جزئي وعضو حالي في المجلس الاستشاري الوطني المعني بتعاطي الكحول وإدمان الكحول.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل منحة تطوير العلماء (11SDG5190025) من جمعية القلب الأمريكية (إلى A.R.D.) ، والمعهد الوطني للصحة R01 يمنح AA-023764 (إلى A.N.B.) ، وHL-104631 و R37 AA-11560 (إلى A.M.D).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics