哺乳动物组织和异种卵母细胞与胆固醇的丰富

Biochemistry

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Summary

提出了两种胆固醇富集方法:应用富含胆固醇的环糊精来丰富哺乳动物组织和细胞,以及利用富含胆固醇的磷脂型分散物(脂质体)来丰富Xenopus卵母细胞。这些方法有助于确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响。

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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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Abstract

哺乳动物组织和细胞的胆固醇丰富,包括用于研究细胞功能的Xenopus卵母细胞,可以使用多种方法完成。在这里,我们描述了用于此目的的两种重要方法。首先,我们描述了如何使用充满胆固醇的环糊精来丰富组织和细胞,以脑动脉(组织)和海马神经元(细胞)为例。此方法可用于任何类型的组织、细胞或细胞系。胆固醇富集的替代方法包括使用低密度脂蛋白(LDL)。这种方法的优点是,它使用部分天然胆固醇平衡机制的细胞。然而,虽然环糊精方法可以应用于丰富任何细胞类型与胆固醇的兴趣,LDL方法仅限于表达LDL受体的细胞(例如,肝细胞,骨髓衍生细胞,如血白细胞和组织巨噬细胞),和浓缩水平取决于LDL受体的浓度和流动性。此外,低密度脂蛋白颗粒包括其他脂质,因此胆固醇的输送是非特异性的。其次,我们描述了如何使用含有胆固醇的磷脂色(即脂质体)来丰富异种卵母细胞的胆固醇。异种卵母细胞是一种流行的异质表达系统,用于研究细胞和蛋白质功能。对于哺乳动物组织(脑动脉)的环糊精胆固醇增生方法,以及Xenopus卵母细胞的磷脂胆固醇浓缩方法,我们证明胆固醇水平在孵育5分钟后达到最大值。在长期潜伏期(例如60分钟),这种胆固醇水平保持不变。这些数据共同为优化组织、细胞和Xenopus卵母细胞的胆固醇富集时间条件提供了基础,用于旨在研究胆固醇富集的影响的功能研究。

Introduction

胆固醇是一种主要的细胞脂质,它起着许多关键的功能和结构作用121,2,3,4,5,6,7,8,9。7,8,95,6,,3,4,,从调节血浆膜的物理特性到确保细胞的生存能力、生长、增殖,以及作为信号和前体分子在大量生化途径中,胆固醇是正常细胞和器官功能所必需的必要组成部分。因此,胆固醇缺乏会导致严重的身体畸形和各种疾病。另一方面,即使胆固醇在生理水平(2-3x)以上略有增加,也含有细胞毒性11、2、10,2,10与疾病的发展有关,包括心血管11、12、1312,13和神经退行性疾病1114、15、16、17。14,15,16,17因此,为了询问胆固醇的关键功能并确定胆固醇水平变化的影响,已经开发出了改变组织、细胞和异种卵母细胞中胆固醇含量的不同方法。

哺乳动物组织和细胞中胆固醇水平的变化
有几种方法可以被用来降低组织和细胞18的胆固醇水平。一种方法是接触溶解在脂蛋白缺乏血清中的他汀类药物,以抑制HMG-CoA还原酶,控制胆固醇合成率19,20。19,然而,这些降胆固醇药物也抑制沿美价酮途径形成非固醇产物。因此,加入少量的美价,使这些产品的形成21,并增强这种方法的特异性。降低胆固醇水平的另一种方法是使用β-环糊精。这些糖原蛋白单体单体具有一个内部疏水性腔,其直径与固醇22的大小相匹配,便于从细胞中提取胆固醇,从而消耗其原生胆固醇含量23。例如,2-羟丙基-β-环糊精(HP_CD),这是一种临床前药物,目前正在测试治疗尼曼-皮克C型疾病,一种遗传性致命的代谢紊乱,其特征是淋索质胆固醇储存24。胆固醇消耗水平取决于所使用的特定衍生物。例如,HP_CD 提取的胆固醇的容量低于甲基化衍生物,甲基β-环糊精(M+CD)24,25,26,27,28,29,30。29,3024,25,26,27,28,值得注意的是,然而,β-环糊精还可以提取其他疏水分子,除了胆固醇,这可能会导致非特异性的影响31。与耗竭相比,细胞和组织可以通过与胆固醇23的中饱和的β-环糊精进行治疗,专门与胆固醇一起丰富。这种方法也可用作胆固醇消耗31中使用的β-环糊精特异性的对照。组织和细胞中胆固醇的消耗非常简单,可以通过将细胞暴露30-60分钟到溶解在用于储存细胞的介质中的5 mM M_CD来实现。这种方法可导致胆固醇含量降低50%(例如,在海马神经元32,大鼠脑动脉33)。另一方面,准备β-环糊精-胆固醇复合物用于组织和细胞的胆固醇富集更为复杂,将在协议部分进行说明。

使用饱和胆固醇的β-环糊精来丰富组织和细胞的替代方法涉及使用LDL,它依赖于组织/细胞18中表达的LDL受体。虽然这种方法提供了使用细胞的天然胆固醇平衡机制的优点,但它有几个局限性。首先,不能用这种方法来丰富不表达LDL受体的组织和细胞。其次,低密度脂蛋白颗粒除了胆固醇外,还含有其他脂质。具体来说,LDL由蛋白质ApoB100(25%)组成和以下脂质(75%):~6-8%胆固醇,+45-50%胆汁酯,+18-24%磷脂,和+4-8%三甘油34。因此,通过低密度脂蛋白颗粒输送胆固醇是非特异性的。第三,表达低密度脂蛋白受体的组织和细胞中低密度脂蛋白增加的百分比可能明显低于使用饱和胆固醇的环糊精观察到的含量。例如,在以前的研究中,通过低密度脂蛋白使啮齿动物脑动脉与胆固醇的丰富率仅使胆固醇水平增加10-15%35。相反,如协议部分所述,这些动脉与胆固醇饱和的动脉的浓缩导致胆固醇含量增加>50%(参见代表结果部分,图1)。

异种卵母细胞中胆固醇水平的变化
异种卵母细胞是一种异质表达系统,通常用于研究细胞和蛋白质功能。早期的研究表明,Xenopus卵母细胞的胆固醇与磷脂摩尔比为0.5± 0.136。由于这种内在的高胆固醇水平,增加胆固醇含量在这个系统中是具有挑战性的,但可以通过膜磷脂和胆固醇制成的分散实现。为此,我们选择的磷脂与用于形成人造平面脂质双层的磷脂相似,包括L-β-磷脂乙醇胺(POPE)和1-棕榈-2-奥莱基-sn-糖二烯-3-磷脂-l-塞林(POPS),如协议部分所述。这种方法可能导致胆固醇含量增加 >50%(参见代表结果部分,图 2)。

用基于磷脂的分散物丰富Xenopus卵母细胞的替代方法是使用胆固醇饱和的环糊精,这与组织和细胞的丰富方式类似。然而,我们发现这种方法的可重复性和效率较低,胆固醇含量平均增加约25%。这可能是由于这两种方法的加载能力不同(请参阅代表结果部分,图 3)。相反,已经表明,使用环糊精来消耗Xenopus卵母细胞的胆固醇,可以导致胆固醇含量降低40%36。

在这里,我们专注于哺乳动物组织和细胞的胆固醇丰富,通过应用环糊精饱和胆固醇,和异种卵母细胞使用脂质体。这两种方法都可以加以利用,以划定胆固醇水平增加对蛋白质功能的影响。蛋白质功能胆固醇调制的机制可能涉及直接相互作用8和/或间接效应9。当胆固醇通过直接相互作用影响蛋白质功能时,胆固醇水平增加对蛋白质活动的影响可能与细胞类型、表达系统或浓缩方法无关。例如,我们利用这两种方法来确定胆固醇对G蛋白的影响,内向纠正钾(GIRK)通道,以心房肌细胞37、海马神经元32、38、HEK29339细胞和异种卵母细胞32,3832、37,37表示。这些研究的结果是一致的:在所有三种类型的哺乳动物细胞和两栖卵母细胞胆固醇上升调节GIRK通道功能(参见代表结果部分,图4,海马神经元和相应的实验在Xenopus卵母细胞)。此外,这些研究中的观察结果也符合在心房肌细胞37,4040和海马神经元32,38,38新鲜从动物接受高胆固醇饮食40的研究的结果一致。37值得注意的是,使用M+CD的海马神经元的胆固醇富集逆转了用于治疗高胆固醇饮食对胆固醇水平和GIRK功能38影响的阿托伐他汀疗法的效果。在其他研究中,我们研究了突变对胆固醇敏感性的影响,使用Xenopus卵母细胞和HEK293细胞41来纠正体内的钾通道Kir2.1。同样,突变对通道灵敏度的影响在两个系统中是相似的。

两种浓缩方法在确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响方面应用不计其数。特别是,使用环糊精-胆固醇复合物来丰富细胞和组织是非常普遍的,主要是因为它的特异性。最近的例子包括确定胆固醇对HERG通道激活和底层机制的影响42,发现胆固醇激活G蛋白耦合受体平滑促进刺猪信号43,以及通过膜相关链接蛋白44确定胆固醇在干细胞生物力学中的作用和辅助生成。在我们自己的工作中,我们利用哺乳动物组织富集与M_CD:胆固醇复合物,研究胆固醇富集对基本功能的影响,以及大电导(BK,MaxiK)在血管平滑肌35、45、46中钙和电压门通道(BK,MaxiK)的药理学特征。35,45,46在其他研究中,我们使用基于磷脂的分散方法来丰富具有胆固醇的Xenopus卵母细胞,以确定不同区域在Kir2.1和GIRK通道中胆固醇敏感性41、47、48、4947,48,49中的作用,并确定这些通道4132、50、51中的假定胆固醇结合位,32,50

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Protocol

田纳西大学健康科学中心(UTHSC)进行了所有动物实验程序。动物护理和实验议定书由UTHSC动物护理和使用委员会审查和批准,该委员会是一个由国际实验室动物护理评估和鉴定协会认可的机构。

1. 使用甲基β-环糊精与胆固醇饱和的组织和细胞浓缩

注:下面的胆固醇浓缩协议适用于组织、细胞和细胞系。例如,我们描述了为丰富哺乳动物脑动脉而执行的步骤。提供了脑动脉(图1)和神经元的代表性结果(图4)。

  1. 制备富含胆固醇的M+CD
    1. 称量 0.064 g M_CD,并将其溶解在含有 10 mL 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 溶液的烧瓶中,以获得 5 mM M_CD 的最终浓度。用搅拌棒搅拌溶液,确保 M_CD 完全溶解。
    2. 重量 0.0024 克胆固醇粉,并添加到同一瓶中,以获得 0.63 mM 胆固醇浓度。然后大力搅拌溶液。使用铲子分解尽可能多的胆固醇块(有些块将保持到孵化)。
    3. 用至少两层石蜡膜盖住烧瓶,在37°C的水浴中缓慢摇动(约30振荡/分钟)。此步骤至关重要。
    4. 8-16 小时后,将溶液冷却至室温 (RT),然后通过 0.22 μm polyethersulfone 注射器过滤器过滤到玻璃瓶中。
      注:要达到溶液中不同的胆固醇浓度,请用简单的比例调整胆固醇和M+CD的含量。将M+CD:胆固醇摩尔比保持在8:1,以获得具有胆固醇的甲基-β-环糊精载体的饱和度是很重要的。如果储存在4°C,胆固醇丰富的溶液可以立即使用或几天内使用。然而,随着胆固醇总成的出现,胆固醇的丰富能力会随着时间而下降,溶液变得浑浊。
  2. 用M+CD饱和胆固醇治疗脑动脉
    1. 安乐死斯普拉格道利大鼠(250-300克),将其放入一个室与2%的西葫芦。然后,用锋利的断头盘或一把大剪刀将麻醉大鼠斩首。
      注:如果定期执行这些过程,则制定断头磨削时间表非常有用。此外,应该专门用一把单独的剪刀来斩首啮齿动物。灭鼠斩首是一种最终过程;因此,仪器不必无菌。每次使用后用肥皂水清洗就足够了。
    2. 将老鼠的头朝前放置,远离研究人员。将一把中等大小的剪刀的尖部分放在头骨和脑干之间,并在两侧横向切割。
    3. 使用钳子撬开头颅骨,拉起颅骨底部进行横向切割,并小心地取出大脑。确保切断支撑大脑在颅骨内的光学神经。
    4. 取出后,将大脑放入带有PBS的烧杯中。
      注:大脑可以在4°C下储存在冰上4-6小时。
    5. 在非无菌环境中,大鼠大脑转移到一个蜡解剖碗,有足够的PBS来淹没它。固定大脑,防止大脑移动。
      注:如果执行迅速,可以在 RT 处执行步骤 1.2.5。否则,它需要在冰上完成。
    6. 使用锋利的钳子和小手术剪刀来解剖脑动脉及其分支,在RT的PBS显微镜下形成大脑底部的Willis圆。此步骤至关重要。
    7. 在 96 井板或 35 mm 盘中将 PBS 中的动脉段(长达 1 厘米长)短暂冲洗,以去除剩余血液,然后将它们放入足够的胆固醇丰富溶液(在步骤 1.1 中准备),以覆盖整个动脉段。如果有足够的胆固醇丰富溶液和96井盘,如果动脉小,或者缺乏胆固醇丰富的溶液,请使用35毫米的菜。
      注:同样的方法可用于利用60分钟的孵育时间丰富其他组织和细胞的胆固醇。例如,这种方法以前用于小鼠脑动脉35、45、海马神经元32、心房肌细胞37和HEK293细胞39的胆固醇富集。,45需要根据胆固醇敏感测定在不同时间点验证胆固醇浓缩,确定每个组织或细胞类型的最小孵育时间(例如,通过沾染胆固醇敏感荧光染料菲律宾蛋白,对组织中胆固醇量进行生化测定)。
  3. 用类固醇敏感的荧光染料菲利宾染色动脉组织,以确定胆固醇水平的任何变化。
    注:在代表结果部分,我们演示了两种评估胆固醇水平变化的方法的结果:通过应用商用的基于胆固醇的胆固醇氧化酶试剂盒(参见材料表)进行的生化测定,以及使用类固醇敏感的荧光染料菲利芬染色。第一种方法可以按照制造商的说明执行。后一种方法的协议如下。
    1. 使用一瓶新鲜的菲律宾粉,制备10毫克/mL的二甲基硫氧化物(DMSO)库存溶液。此步骤至关重要。
      注: 生成的解决方案对光敏感。如果准备正确,菲律宾股票溶液为黄色。一些菲律宾粉可能粘在瓶盖上。因此,用 DMSO 溶剂冲洗瓶子和盖以保留全部数量的菲律宾元非常重要。一旦准备,菲律宾股票必须在几天内使用。菲律宾素在5天后完全失去荧光能力,即使储存在黑暗中,在-20°C。
    2. 从富含胆固醇的溶液中取出动脉段,用PBS清洗3倍5分钟。
    3. 将动脉段固定在4%的甲醛中,在冰上工作15分钟。
      注意:甲醛是轻敏的。因此,工作必须在黑暗中进行。
    4. 将动脉段放入RT的PBS中0.5%的Triton,10分钟,以渗透组织,促进染料渗透。
    5. 在摇床上用 PBS 清洗 3 倍的动脉段 5 分钟。此步骤至关重要。
      注:当 Triton 完全冲掉后,PBS 溶液表面不应有任何气泡。
    6. 稀释PBS中的菲律宾股票溶液,最终浓度为25微克/mL。将从PBS溶液中取出动脉,将其置于稀释的菲律宾溶液中,在黑暗中放置1小时。此步骤至关重要。
    7. 通过在摇床上用PBS冲洗3倍的动脉段,洗掉菲律宾。此步骤至关重要。
    8. 用蒸馏水短暂地冲洗动脉段,用餐巾纸吸收过多的液体,并使用市售的安装介质将动脉安装到滑道上(参见材料表)。
    9. 用盖玻片盖住动脉,避免动脉滚动或扭曲,并将滑道设置为在 RT 的黑暗区域干燥 24 小时。
    10. 安装介质干燥后,用透明指甲油密封盖玻片边缘,让指甲油干燥 10-15 分钟。将滑板存放在 -20°C 的黑暗中。
    11. 在成像之前,将幻灯片与 RT 进行平衡。
    12. 使用荧光显微镜或荧光读取器对组织进行成像,其激发设置为 340-380 nm,发射速度为 385-470 nm。
      注意:菲律宾光漂白剂快;因此,必须及时对样品进行成像。

2. 使用富含胆固醇的磷脂基色散物(脂质体)丰富异种卵母细胞

  1. 准备解决方案
    1. 要制备胆固醇的库存溶液,请将10毫克胆固醇粉溶解在10mL玻璃烧杯或瓶子中的1mL氯仿中。将溶液转移到 1.5 mL 盖式玻璃瓶中。
      注意:鉴于氯仿的毒性和快速蒸发,在发动机罩中工作,并将试剂放在冰上。
    2. 准备一个150 mM KCl,10 mM三酯-HEPES,pH = 7.4缓冲液,用于富含胆固醇的磷脂。为此,在双蒸馏水中溶解在 Erlenmeyer 烧瓶 5.5905 g KCl 和 0.6057 g Tris 中,总体积为 0.5 L。在另一瓶中,将5.5905克KCl和1.19155克HEPES溶解在双蒸馏水中,总体积为0.5升。将两个溶液混合在 1 L Erlenmeyer 烧瓶中,用 HCl 将 pH 调整到 7.4。
      注:将所得的 150 mM KCl、10 mM Tris-HEPES 溶液储存在 4 °C 下。
    3. 要准备ND96预中卵母细胞培养(低K+,低Ca2+)缓冲,将1 mL的2M KCl,1 mL的1MMgCl2,45.5 mL的2M NaCl,和5 mL的1/1 M NaOH-HEPES在1LErlenmeyer烧瓶。2加入900 mL双蒸馏水,用HCl将pH值调整到7.4。将溶液转移到1升气缸,用双蒸馏水将体积提高到1升。然后添加 1.8 mL 的 1 M CaCl2并过滤溶液。
      注:用于制造 ND96 溶液的组件之间的比例略有变化似乎对胆固醇富集并不重要,可能是因为 ND96 溶液在浓缩步骤本身期间没有使用,而是用于存储。例如,1 L 溶液的钠和氯化离子浓度略低,通过结合 2 mL 的 1 M KCl、1 m MgCl2的 1 mL、1 M NaCl 的 82.5 mL、1 M HEPES 的 5 mL 和 1.8 mL 的 1 M CaCl2(Ca 2+省略以获得 Ca2+免费溶液)制成。使用 NaOH 将溶液的 pH 调整为 7.4。将产生的 ND96 卵母细胞培养溶液储存在 4 °C 下长达 1 个月。
  2. 用胆固醇脂质体进行磷脂型分散的制备
    1. 在12 mL玻璃管中,将以下10mg/mL氯仿溶解脂质溶液的200μL组合:L-β-磷脂乙醇胺,1-棕榈-2-奥莱基-斯-糖-3-磷脂-l-血清素,和胆固醇。
    2. 蒸发发动机罩中的氯仿,在氮气流下缓慢干燥。此步骤至关重要。
    3. 在pH = 7.4下,将800 μL的缓冲溶液中的脂质悬浮,该溶液由150 mM KCl和10 mM Tris-HEPES组成,用石蜡膜覆盖。
    4. 在 80 kHz 下轻轻声波 10 分钟,直到形成乳状混合物。此步骤至关重要。
      注意:当声波时,玻璃管中的分散应轻轻振动,形成小波。分散液滴不应在管内跳跃。
  3. 用胆固醇丰富异种卵母细胞
    注:青蛙卵母细胞携带卵巢可以从两个来源获得:第一,Xenopus laevis 雌蛙可以用于内部手术。这一程序必须得到机构动物护理和使用委员会的批准。第二,可以从商业供应商处购买整个卵巢。作为购买或隔离整个卵巢,然后消化它们(如步骤 2.3.1-2.3.4)所述的替代方案,单个卵母细胞可在商业上购买。如果使用后者,则可以跳过步骤 2.3.1-2.3.4。
    1. 将新鲜获得的卵巢保持在+14°C的ND96溶液中。在这些情况下,卵巢可储存长达 1 周。
    2. 要获得单个卵母细胞,使用锋利的钳子在多个地方破坏卵巢囊。将卵巢块放入 60 mm 板中,5 mL 的 Ca2+-无 ND96 辅以 0.5 mg/mL 胶原酶。在 RT 时以 60 振荡/分钟的速度在轨道摇床上摇动 15 分钟。
      注:此步骤将确保卵巢囊的消化。为了保持酶活性,避免长时间(>1 h)储存含有ND96的胶原蛋白酶。即使在 15 °C 以下的低温下,也应进行短暂的存储。
    3. 使用具有宽尖的转移移液器,大力移液含卵细胞溶液上下约5-10倍,以分离单个卵母细胞。在此步骤中,解决方案将变暗。
    4. 使用 Ca2+-无 ND96 快速冲洗卵母细胞,直到溶液变透明。
    5. 使用带窄尖的转移移液器将单个卵母细胞转移到Ca2+-含ND-96溶液,辅以2mg/mL的根粒。
      注:当需要存储卵母细胞时,此步骤至关重要。单个卵母细胞可在14-17°C下储存在培养箱中数天。然而,必须每天至少清除一次死亡的卵母细胞,以避免有毒化学物质对溶液的污染。
    6. 将胆固醇丰富的磷脂色散物的90μL转移到96孔板的一口井中。
    7. 将多达六只卵母细胞从ND96介质转移到尽可能少的介质的井中。此步骤至关重要。
      注意:在转移过程中不要将卵母细胞暴露在空气中,以保持卵母细胞完好无损。
    8. 将 96 井板放在三维平台旋转器上,为细胞中的卵母细胞提供 5-10 分钟的小轨道运动。
    9. 加入一滴ND96到井中,将富含胆固醇的卵母细胞从96井板转移到带ND96的35毫米板中,立即使用。此步骤至关重要。
    10. 使用市售的基于胆固醇的胆固醇氧化酶试剂盒(参见材料表),按照制造商的说明评估胆固醇水平的变化。

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Representative Results

使用饱和胆固醇的环糊精作为丰富组织和细胞胆固醇的手段是公认的。在这里,我们首先演示了这种广泛使用的方法的应用,用M+CD饱和胆固醇来丰富大鼠脑动脉的胆固醇。图1A显示了一个图像脑动脉平滑肌肉层的例子,并演示了在组织富集后获得的与菲律宾相关的荧光的浓度依赖性增加,胆固醇浓度从6.25 μM-6.25 mM开始1小时。 Figure 1B值得注意的是,在1h潜伏期后2小时胆固醇水平的增加是M+CD:胆固醇复合物治疗后立即观察到的50%的增加。如图1C所示,对于1小时用0.625 mM胆固醇治疗的样本,需要尽快在胆固醇富集完成后使用经过处理组织进行功能研究。此外,虽然1小时孵育时间通常用于用这种方法丰富组织和细胞的胆固醇,但5分钟的孵化通常足以实现由基于胆固醇的氧化酶生化测定确定的脑动脉胆固醇含量的统计显著增加,如图1D所示。当孵育时间增加到60分钟时,胆固醇含量的增加维持在同一水平(图1D)。

图2A-C显示了富含胆固醇的脂质体作为一种使异种卵母细胞与胆固醇丰富的方法的有效性。虽然缺乏胆固醇的控制磷脂类分散体的胆固醇水平没有显著变化(图2A),但胆固醇水平在治疗5分钟后显著增加,包括胆固醇在内的磷脂色散物,在孵育时间增加到60分钟时保持相同水平(图2B)。从两只青蛙中获得的两个不同批次的卵母细胞也观察到类似的效果。然而,值得注意的是,胆固醇的初始水平和胆固醇含量的变化在两个批次之间各不相同:在第1批中,胆固醇的初始浓度为每毫克蛋白质64微克,而第2批的初始浓度为每毫克蛋白质45μg,即第1批中胆固醇初始水平的70%。在60分钟的治疗之后,第1批的胆固醇浓度为每毫克蛋白质124微克,而在第2批中,每毫克蛋白质的胆固醇浓度为67微克。因此,当胆固醇浓度在第1批中增加超过90%,在第2批增加+50%。然而,两个批次胆固醇水平的大幅增加提供了研究胆固醇水平增加对这种异质表达系统中表达的蛋白质功能的影响的方法。此外,以磷脂为基础的分散方法,使Xenopus卵母细胞与胆固醇丰富,似乎比在组织和细胞中应用充满胆固醇的环糊精更有效。如图 3所示,使用 5mM 环糊精应用环糊精-胆固醇复合物来丰富卵母细胞,平均胆固醇水平仅增加 ±25%。

在刚从海马的CA1区域分离的神经元中也证明了基于环糊精的丰富细胞方法的有效性(4A)。如图4B所示,M+CD中胆固醇饱和的神经元孵育60分钟,导致由菲律宾相关荧光决定的胆固醇水平增加2倍以上。使用这种方法,我们测试了胆固醇增加对海马神经元表达的GIRK通道的影响。如图 4C所示,胆固醇水平的这种变化导致 GIRK 电流显著增加。同样,我们使用异种卵细胞异质表达系统测试了胆固醇富集对大脑中表达的主要GIRK子单位GIRK子单位GIRK2的影响。为此,我们过度表达GIRK2+(GIRK2_E152D),GIRK2的孔液突变物,增加其膜表达和活性52Xenopus卵母细胞,并丰富了卵母细胞与胆固醇60分钟使用磷脂基分散方法。如图4D-F所示,胆固醇水平的增加导致电流显著增加,类似于神经元胆固醇水平增加对GIRK通道功能的影响。这些数据进一步证明了上述两种方法在确定胆固醇水平增加对蛋白质活动和细胞功能的影响方面的有效性、一致性和效用。

Figure 1
图1:使用甲基-环糊精与胆固醇的小鼠脑动脉与胆固醇的代表性浓缩。A) 图像脑动脉平滑肌肉层的例子,表明在组织富集后获得的与菲律宾相关的荧光的浓度依赖性增加,胆固醇浓度从6.25 μM-6.25 mM到1小时(B)定量成像数据(A)。使用商业软件中的内置"测量"功能对整个图像的荧光强度测量进行。在每个胆固醇浓度中,从从单独的动物捐赠者那里采集的动脉中收集了#3图像。对于每个胆固醇浓度,数据作为均值 = 标准误差呈现。(C) 脑动脉平滑肌肉层段的胆固醇水平在1小时潜伏期后立即与0.625 mM胆固醇,和3小时后的治疗开始(即,1小时的孵育,随后在PBS2小时)。(D) 胆固醇水平对胆固醇氧化酶生化测定确定的孵育时间的依赖。显著差异由星号 (*p = 0.05) 表示。面板 (A) (胆固醇浓度 0 mM-0.625 mM), (B) 和 (C) 已由北等45. 修改.请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 2
图2:使用脂质体,具有胆固醇的异种卵母细胞的代表性浓缩。A) 在无胆固醇脂质体中孵育的胆固醇水平变化5-60分钟(B)在富含胆固醇的脂质体中孵育的异种卵母细胞的胆固醇水平变化5-60分钟。描述的对照栏是指在无胆固醇脂体中孵育5分钟,并作为比较显示。(C) 比较两个不同批次的异种卵母细胞的胆固醇富集效应,使用富含胆固醇的脂质体5分钟和60分钟。显著差异由星号 (*p = 0.05) 表示。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 3
图3:使用甲基-β-环糊精与胆固醇的异种卵母细胞与胆固醇的代表性浓缩物。A) 在控制ND96介质中孵育的胆固醇水平变化为5-60分钟(B)在M+CD中孵育的XenopusXenopus卵母细胞胆固醇水平变化5-60分钟。描述的对照栏是指控制介质中的孵育5分钟,并作为比较显示。显著差异由星号 (*p = 0.05) 表示。请点击此处查看此图形的较大版本。

Figure 4
图4:胆固醇富集对细胞和异种卵母细胞蛋白质功能的研究的代表性例子:胆固醇对G蛋白内向纠正钾通道的影响。A) 来自控制大鼠(左)与富含胆固醇的海马CA1金字塔神经元的菲律宾相关荧光信号(右)。(B) 从控制和胆固醇丰富的新分离的海马CA1金字塔神经元获得的菲律宾相关荧光信号的汇总数据。胆固醇富集是通过孵育M+CD中胆固醇饱和的神经元1小时(n = 12-14)实现的。(CB ) i 离子电流 (I) 电压 (V) 曲线,描绘了(B)中所述的胆固醇富集对 CA1 区域海马神经元中 GIRK 电流的影响。(D) 代表跟踪显示胆固醇富集物利用胆固醇丰富的磷脂基脂质体对GIRK2+(GIRK2_E152D)的影响,以Xenopus卵母细胞在-80 mV和+80 mV表示。(E) 在 -80 mV (n = 6-9) 处的 (D) 的汇总数据。显著差异由星号 (*p = 0.05) 表示。副图(B-E)已由武吉亚等人32号修改。请点击此处查看此图形的较大版本。

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Discussion

用胆固醇丰富哺乳动物组织和细胞以及Xenopus卵母细胞的方法是研究胆固醇水平升高对单个分子物种、复杂大分子系统(如蛋白质)以及细胞和器官功能的影响的有力工具。在本文中,我们描述了促进此类研究的两种补充方法。首先,我们描述了如何使用富含胆固醇的M+CD来丰富组织和细胞。我们证明,在脑动脉部分,这种方法导致胆固醇水平增加+50%。此外,在最近的一项研究中,我们显示,同样的方法导致来自CA1区域的海马神经元的胆固醇含量增加2倍以上。然而,与此相反,采用这种方法作为丰富异种卵母细胞的手段,导致Xenopus卵母细胞的胆固醇含量仅增加25%。因此,为了丰富异种卵母细胞,我们开发了一种基于磷脂的分散方法,持续导致胆固醇水平至少增加±50%。与 M_CD:胆固醇复杂方法的装载能力相比,这种方法丰富Xenopus卵母细胞的优势可能来自于更高的装载能力。此外,虽然 M_CD:胆固醇复合方法针对丰富组织和细胞进行了优化,但还需要进一步优化协议,以改善其丰富Xenopus卵母细胞的应用。

用于用胆固醇丰富Xenopus卵母细胞的磷脂基色散包括两种脂质,广泛用于产生平面脂质双层(即L-α-磷脂乙醇胺和1-棕榈-2-奥莱奥西尔-斯-甘油-3-磷脂-l-血清素)。然而,在早期的研究中,它表明,异种卵母细胞也可以利用胆固醇从脂质体,包括磷脂酰胆碱和胆碱36。该方法使血浆膜中的胆固醇/磷脂摩尔比从0.5 ± 0.1 提高到 0.9 ± 0.1,平均浓缩百分比为 71%。这种平均浓缩百分比与我们观察到的胆固醇含量平均增加水平(+70.5%)非常相似,这表明,选择用于形成分散的磷脂对于使用这种方法用胆固醇丰富异种卵母细胞并不重要。

描述的每个协议都涉及几个关键步骤。在以8:1摩尔比制备M+CD:胆固醇混合物以确保M+CD与胆固醇的饱和度后,用至少两层石蜡薄膜覆盖烧瓶,并将其放在一夜之间慢慢摇晃的37°C水浴中是至关重要的。在解剖组织进行胆固醇治疗时,要温柔地确保组织不拉伸或切割是很重要的。渗透组织以促进染料渗透后,彻底清洗PBS中的组织部分至关重要。填充物中的组织染色需要在黑暗中进行,在染色完成后需要仔细冲洗。在制备富含胆固醇的磷脂色散分物时,必须确保玻璃管中的分散物轻轻振动,形成小波,避免胆固醇与分散体分离。对于异种卵母细胞的胆固醇治疗,重要的是将卵母细胞从ND96介质转移到井中,用尽可能少的介质进行富含胆固醇的磷脂型分散,同时不将卵母细胞暴露在空气中以保持卵母细胞完好无损。需要注意的是,由于组织、细胞和Xenopus卵母细胞的内在机制,胆固醇水平可能平衡,然后随着时间的推移恢复到原来的水平。因此,功能研究需要在潜伏时间之后立即进行。在这里,我们在富含胆固醇的脑动脉中证明了这一概念,表明在1小时潜伏期后2小时胆固醇水平的增加大约是潜伏期后立即观察到的增加量的一半。

尽管遵循了上述关键步骤,但可能会出现若干挑战。例如,在进行胆固醇丰富的治疗后,胆固醇水平可能不会增加。如果是这样的话,可能有必要增加胆固醇在胆固醇丰富的介质中的浓度。这同样适用于组织、细胞和异种卵母细胞的胆固醇富集。然而,在准备使用M+CD:胆固醇复合方法的治疗时,M+CD的含量应该随着胆固醇浓度的增加而增加,以保持8:1摩尔与胆固醇的比值。此外,可能有必要准备一个新的胆固醇丰富的解决方案,因为胆固醇往往沉淀出溶液,并且溶液失去其胆固醇丰富的效率。在胆固醇富集之后,很可能不会观察到菲律宾信号。如果是这种情况,可能需要使用新鲜的菲律宾粉来准备新的股票并重复实验。菲律宾氟荧光迅速下降,库存溶液不能储存超过几天。菲律宾染色的一个限制是,它似乎识别类固醇以外的胆固醇.例如,我们最近证明,在用共丙烷45浓缩后,大鼠脑动脉中的菲律宾相关荧光信号增加。因此,应谨慎解释菲律宾染色结果,如有疑问,应采用其他方法来证实结果。一种可能性是通过应用商用的胆固醇氧化酶试剂盒进行生化测定。

总之,所述方法在实现接近或超过50%的胆固醇富集方面非常有效。事实上,M+CD:胆固醇复合方法,导致脑动脉胆固醇水平+50%比使用低密度脂蛋白丰富这些组织更有效,这导致胆固醇35仅增加±10%。这同样适用于胆固醇丰富的磷脂基色散种(脂质体)的应用,以丰富异种卵母细胞。如上所述,这种方法持续导致胆固醇水平至少增加50%。重要的是,这两种在体外增加胆固醇的方法与让动物吃高胆固醇饮食32、37、40、53、54的胆固醇增加结果相当。32,37,40,53,54此外,与长达数周的高胆固醇饮食相比,体外方法只需几分钟的孵育时间即可达到具有统计学意义和稳定的胆固醇水平。

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Disclosures

A. M. Dopico 博士是一名特殊兼职的联邦雇员,现任国家酒精滥用和酗酒咨询委员会成员。

Acknowledgments

这项工作得到了美国心脏协会(至A.R.-D.)的科学家发展赠款(11SDG5190025)的支持,以及国家卫生研究所R01授予AA-023764(至A.N.B.)和HL-104631和R37 A-11560(至A.M.D.) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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