Arricchimento dei tessuti mammiferi e Xenopus Oocytes con colesterolo

Biochemistry

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Summary

Sono presentati due metodi di arricchimento del colesterolo: l'applicazione di ciclodextrin satura di colesterolo per arricchire tessuti e cellule mammiferi e l'uso di dispersioni a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo (liposomi) per arricchire gli evociti di Xenopo. Questi metodi sono fondamentali per determinare l'impatto dei livelli elevati di colesterolo nella funzione molecolare, cellulare e dell'organo.

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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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Abstract

L'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi, compresi gli evociti di Xenopus utilizzati per studiare la funzione cellulare, può essere realizzato utilizzando una varietà di metodi. In questo caso, descriviamo due approcci importanti utilizzati a questo scopo. In primo luogo, descriviamo come arricchire tessuti e cellule con colesterolo usando ciclodextrin saturi di colesterolo usando arterie cerebrali (tessuti) e neuroni ippocampali (cellule) come esempi. Questo approccio può essere utilizzato per qualsiasi tipo di tessuto, cellule o linee cellulari. Un approccio alternativo per l'arricchimento del colesterolo prevede l'uso di lipoproteina a bassa densità (LDL). Il vantaggio di questo approccio è che utilizza parte della macchina naturale dell'omeostasi del colesterolo della cellula. Tuttavia, mentre l'approccio ciclodextrin può essere applicato per arricchire qualsiasi tipo di interesse cellulare con il colesterolo, l'approccio LDL è limitato alle cellule che esprimono i recettori LDL (ad esempio, le cellule epatiche, le cellule derivate dal midollo osseo come i leucociti e i macrofagi tissutali), e il livello di arricchimento dipende dalla concentrazione e dalla mobilità del recettore LDL. Inoltre, le particelle Di LDL includono altri lipidi, quindi la somministrazione di colesterolo non è specifica. In secondo luogo, descriviamo come arricchire gli ovociti di Xenopus con colesterolo usando una dispersione a base di fosforidi (cioè liposomi) che include il colesterolo. Gli ovociti Xenopus costituiscono un popolare sistema di espressione eterologa utilizzato per studiare la funzione cellulare e proteica. Sia per l'approccio di arricchimento del colesterolo basato su ciclodintrina del tessuto dei mammiferi Xenopus (arterie cerebrali) sia per l'approccio di arricchimento del colesterolo basato su fosfori di nociti, dimostriamo che i livelli di colesterolo raggiungono un massimo dopo 5 min di incubazione. Questo livello di colesterolo rimane costante durante lunghi periodi di incubazione (ad esempio, 60 min). Insieme, questi dati forniscono la base per condizioni temporali ottimizzate per l'arricchimento del colesterolo di tessuti, cellule e evociti di Xenopus per studi funzionali volti a interrogare l'impatto dell'arricchimento del colesterolo.

Introduction

Il colesterolo, un grande lipido cellulare, svolge numerosi ruoli funzionali e strutturali critici1,2,3,4,5,6,7,8,9. Dalla regolazione delle proprietà fisiche della membrana plasmatica a garantire la vitalità cellulare, la crescita, la proliferazione e fungere da segnalazione e molecola precursore in una pletora di vie biochimiche, il colesterolo è un componente imperativo necessario per la normale funzione cellulare e dell'organo. Di conseguenza, la carenza di colesterolo si traduce in gravi malformazioni fisiche e una varietà di disturbi. D'altra parte, anche un piccolo aumento del colesterolo al di sopra dei livelli fisiologici (2-3x) è citotossico1,2,10 ed è stato associato allo sviluppo di disturbi, tra cui cardiovascolare11,12,13 e malattie neurodegenerative14,15,16,17. Così, per interrogare le funzioni critiche del colesterolo e per determinare l'effetto dei cambiamenti nei livelli di colesterolo, sono stati sviluppati diversi approcci che alterano il contenuto di colesterolo nei tessuti, nelle cellule e negli ovociti di Xenopus.

Alterazione dei livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule dei mammiferi
Diversi approcci possono essere sfruttati per diminuire i livelli di colesterolo nei tessuti e nelle cellule18. Un approccio prevede la loro esposizione alle statine disciolte nel siero carente di lipoproteina per inibire la reductasi HMG-CoA, che controlla il tasso di sintesi del colesterolo19,20. Tuttavia, questi farmaci per abbassare il colesterolo inibiscono anche la formazione di prodotti non sterolo lungo il percorso mevalonato. Pertanto, viene aggiunta una piccola quantità di mevalonato per consentire la formazione di questi prodotti21 e migliorare la specificità di questo approccio. Un altro approccio per diminuire i livelli di colesterolo coinvolge l'uso di z-ciclodextrins. Questi monomeri glucopyranosi possiedono una cavità idrofobica interna con un diametro che corrisponde alla dimensione di steroli22, che facilita l'estrazione del colesterolo dalle cellule, esaurendoli così dal loro contenuto nativo di colesterolo23. Un esempio è costituito da 2-idrossipropyl-z-ciclodextrin (HP-cyclodextrin, un farmaco preclinico attualmente in fase di test per il trattamento della malattia di Niemann-Pick di tipo C, una malattia metabolica fatale ereditata geneticamente ereditata caratterizzata dall'accumulo di colesterolo lisonio24. Il livello di esaurimento del colesterolo dipende dal derivato specifico utilizzato. Ad esempio, l'HP-CD estrae il colesterolo con una capacità inferiore rispetto al derivato metilato, metil-z-ciclodextrin (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. In particolare, tuttavia, il ciclodextrintrins può anche estrarre altre molecole idrofobiche oltre al colesterolo, il che può poi provocare effetti non specifici31. A differenza dell'esaurimento, le cellule e i tessuti possono essere specificamente arricchiti con colesterolo attraverso il trattamento con ciclodextrina che è stato presaturato con colesterolo23. Questo approccio può essere utilizzato anche come controllo per la specificità di z-ciclodextrins utilizzato per l'esaurimento del colesterolo31. L'esaurimento del colesterolo dai tessuti e dalle cellule è semplice e può essere raggiunto esponendo le cellule per 30-60 min a 5 mM-MCD disciolti nel mezzo utilizzato per la conservazione delle cellule. Questo approccio può provocare una diminuzione del 50% del contenuto di colesterolo (ad esempio, nei neuroni ippocampali32, arterie cerebrali del ratto33). D'altra parte, preparare il complesso di colesterolo z-cyclodextrin-colesterolo per l'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule è più complesso, e sarà descritto nella sezione protocollo.

Un approccio alternativo all'arricchimento dei tessuti e delle cellule che utilizzano la saturazione di colesterolo derivante dal colesterolo, che si basa sui recettori LDL espressi nei tessuti/cellule18. Mentre questo approccio offre il vantaggio di utilizzare il meccanismo naturale di omeostasi colesterolo della cellula, ha diverse limitazioni. In primo luogo, i tessuti e le cellule che non esprimono il recettore LDL non possono essere arricchiti con questo approccio. In secondo luogo, le particelle LDL contengono altri lipidi oltre al colesterolo. In particolare, LDL è costituito dalla proteina ApoB100 (25%) e i seguenti lipidi (75%): colesterolo del 6-8%, 45-50% di esteri di colesterile, 18-24% fosforidi, e 34 triacylgliceroli34. Pertanto, la somministrazione di colesterolo tramite particelle LDL non è specifica. In terzo luogo, la percentuale di aumento del contenuto di colesterolo da LDL nei tessuti e nelle cellule che esprimono il recettore LDL può essere significativamente inferiore all'aumento osservato utilizzando ciclodextrin saturo di colesterolo. Ad esempio, in uno studio precedente, l'arricchimento delle arterie cerebrali dei roditori con colesterolo tramite LDL ha provocato solo un aumento del 10-15% nei livelli di colesterolo35. Al contrario, l'arricchimento di queste arterie con ciclodextrin saturo di colesterolo come descritto nella sezione protocollo ha provocato >50% aumento del contenuto di colesterolo (Vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 1).

Alterazione dei livelli di colesterolo in Xenopus oecytes
Gli ovociti Xenopus costituiscono un sistema di espressione eterologa comunemente usato per studiare la funzione cellulare e proteica. Studi precedenti hanno dimostrato che il rapporto di colesterolo al molare fosfolipide in Xenopus oocytes è 0,5 x 0,136. A causa di questo alto livello intrinseco di colesterolo, aumentare il contenuto di colesterolo in questo sistema è impegnativo, ma può essere raggiunto utilizzando dispersioni a base di fosfolipidi di membrana e colesterolo. I fosfolipidi che abbiamo scelto per questo scopo sono simili a quelli utilizzati per formare bistrato ibici planari artificiali e includono l'l-z-fosfatidylethanolamina (POPE) e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS), come descritto nella sezione del protocollo. Questo approccio può comportare un aumento del contenuto di colesterolo in >50% (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 2).

Un approccio alternativo all'arricchimento degli ovociti di Xenopus con dispersioni a base di fosofilidi comporta l'uso di ciclodextrin saturi di colesterolo, che è simile al modo in cui tessuti e cellule sono arricchiti. Tuttavia, abbiamo trovato questo approccio di bassa riproducibilità ed efficienza, con una media di 25% aumento del contenuto di colesterolo. Ciò è probabilmente dovuto alla diversa capacità di caricamento di questi due approcci (vedere la sezione Risultati rappresentativi, Figura 3). Al contrario, è stato dimostrato che l'utilizzo di ciclodextrinper per esaurire il colesterolo da Xenopus oocytes può provocare una diminuzione del colesterolo del 40% nel contenuto36.

Qui, ci concentriamo sull'arricchimento del colesterolo dei tessuti e delle cellule dei mammiferi attraverso l'applicazione di ciclodextrinsatura satura di colesterolo e di Enopus evociti usando i liposomi. Entrambi gli approcci possono essere sfruttati per delineare l'effetto dell'aumento dei livelli di colesterolo sulla funzione proteica. I meccanismi di modulazione del colesterolo della funzione proteica possono comportare interazioni dirette8 e/o effetti indiretti9. Quando il colesterolo influisce sulla funzione delle proteine tramite interazioni dirette, l'effetto di un aumento dei livelli di colesterolo sull'attività proteica è probabilmente indipendente dal tipo di cellula, dal sistema di espressione o dall'approccio di arricchimento. Per esempio, abbiamo utilizzato questi due approcci per determinare l'effetto del colesterolo sui canali di rettificazione interiore del potassio (GIRK) della proteina G e 32 espressi nei miociti atriale37,neuroni ippocampali32,38, HEK29339 cellule, e Xenopus oociti32,37. I risultati ottenuti in questi studi sono stati coerenti: in tutti e tre i tipi di cellule di mammiferi e negli ovociti anfibi il colesterolo ha aumentato la funzione del canale GIRK (vedi sezione Risultati rappresentativi, Figura 4, per i neuroni ippocampali e i corrispondenti esperimenti in ovociti di Xenopo). Inoltre, le osservazioni fatte in questi studi erano anche coerenti con i risultati degli studi condotti in miociti atriale37,40 e neuroni ippocampali32,38 appena isolati da animali sottoposti a una dieta ad alto colesterolo40. In particolare, l'arricchimento del colesterolo dei neuroni ippocampali utilizzando la funzione di abitarla ha invertito l'effetto della terapia dell'atorvastatina utilizzata per affrontare l'impatto della dieta ad alto colesterolo sia sui livelli di colesterolo che sulla funzione GIRK38. In altri studi, abbiamo studiato l'effetto delle mutazioni sulla sensibilità al colesterolo del canale di potassio rettificare interiormente Kir2.1 utilizzando sia gli evociti Xenopus che le cellule HEK29341. Ancora una volta, l'effetto delle mutazioni sulla sensibilità del canale era simile nei due sistemi.

Le applicazioni di entrambi i metodi di arricchimento per determinare l'impatto dei livelli elevati di colesterolo sulla funzione molecolare, cellulare, e dell'organo sono numerosi. In particolare, l'uso di complessi di colesterolo ciclodelo per arricchire le cellule e i tessuti è molto comune in gran parte a causa della sua specificità. Esempi recenti di questo approccio includono la determinazione dell'impatto del colesterolo sull'attivazione del canale HERG e i meccanismi sottostanti42, la scoperta che il colesterolo attiva il recettore accoppiato della proteina G levigato per promuovere la segnalazione delriccio 43, e l'identificazione del ruolo del colesterolo nella biomeccanica delle cellule staminali e nell'adipogenesi attraverso le proteine associate alla membrana44. Nel nostro lavoro, abbiamo utilizzato l'arricchimento dei tessuti mammiferi con il complesso M'CD:colesterolo per studiare l'effetto dell'arricchimento del colesterolo sulla funzione di base e il profilo farmacologico dei canali di calcio e tensione-gated di grandi conduttamenti (BK, MaxiK) nel muscolo liscio vascolare35,45,46. In altri studi, abbiamo usato l'approccio di dispersione basato sul fosfolipidi per arricchire gli evociti Xenopus con il colesterolo per determinare i ruoli delle diverse regioni nei canali Kir2.1 e GIRK nella sensibilità al colesterolo41,47,48,49, così come per determinare i siti di legame putativo in questi canali32,50,51.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali con gli animali sono state eseguite presso l'University of Tennessee Health Science Center (UTHSC). La cura degli animali e dei protocolli sperimentali è stata esaminata e approvata dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'UTHSC, un'istituzione accreditata dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento di Laboratory Animal Care International.

1. Arricchimento di tessuti e cellule che utilizzano metil-z-ciclodextrin saturi di colesterolo

NOTA: Il protocollo di arricchimento del colesterolo riportato di seguito è adatto per tessuti, cellule e linee cellulari. Ad esempio, descriviamo i passi eseguiti per arricchire le arterie cerebrali dei mammiferi. I risultati rappresentativi sono forniti sia per le arterie cerebrali (Figura 1) che per i neuroni (Figura 4).

  1. Preparazione di M-CD satura di colesterolo
    1. Pesate 0,064 g di M'CD e scioglietelo in un flacone contenente 10 mL di soluzione salina con buffer fosfato (PBS) per ottenere una concentrazione finale di 5 mM- M.CD. Mescolare la soluzione con una barra di agitazione per garantire che l'Unità di sbarramento sia completamente dissolta.
    2. Pesare 0,0024 g di polvere di colesterolo e aggiungerlo alla stessa fiaschetta per ottenere una concentrazione di colesterolo di 0,63 mM. Quindi mescolare la soluzione vigorosamente. Utilizzare una spatola per rompere il maggior numero possibile di pezzi di colesterolo (alcuni pezzi rimarranno fino all'incubazione).
    3. Coprire il pallone con almeno due strati di pellicola di paraffina e agitare lentamente (30 dollari oscillazioni/min) in un bagno d'acqua a 37 gradi durante la notte. Questo passaggio è fondamentale.
    4. Dopo 8-16 h, raffreddare la soluzione alla temperatura ambiente (RT), quindi filtrarla attraverso un filtro di siringa in poliestere da 0,22 m in una bottiglia di vetro.
      NOTA: Per raggiungere diverse concentrazioni di colesterolo in soluzione, regolare le quantità di colesterolo e M-CD di proporzioni semplici. È importante mantenere il rapporto molare M-CD:colesterolo a 8:1 per ottenere la saturazione del vettore di metili-z-ciclodextrina con colesterolo. La soluzione di arricchimento del colesterolo può essere utilizzata immediatamente o nel corso di diversi giorni se conservata a 4 gradi centigradi. Tuttavia, la capacità di arricchimento del colesterolo diminuisce nel tempo come gli aggregati di colesterolo appaiono, e la soluzione diventa nuvolosa.
  2. Trattamento delle arterie cerebrali con M-CD saturo di colesterolo
    1. Eutanasia un ratto Sprague Dawley (250-300 g) posizionandolo in una camera con 2% isoflurane. Quindi, decapitare il ratto anestetizzato usando una ghigliottina affilata o un grande paio di forbici affilate.
      NOTA: Se si eseguono regolarmente queste procedure, è utile sviluppare un programma per la affilatura della ghigliottina. Inoltre, un paio di forbici separate dovrebbe essere dedicato alla decapitazione dei roditori. La decapitazione dei roditori è una procedura terminale; pertanto, gli strumenti non devono essere sterili. Pulire con acqua saponata dopo ogni uso è sufficiente.
    2. Posizionare la testa del topo rivolto in avanti, lontano dal ricercatore. Posizionare la parte appuntita di una coppia di forbici di medie dimensioni tra il cranio e il tronco encefalico e tagliare lateralmente su entrambi i lati.
    3. Utilizzare pinze per sollevare il cranio superiore aperto tirando su sulla base del cranio dove sono stati fatti i tagli laterali e rimuovere con attenzione il cervello. Assicurati di tagliare i nervi ottici che tengono il cervello all'interno del cranio.
    4. Mettere il cervello in un bicchiere con PBS sul ghiaccio dopo la rimozione.
      NOTA: Il cervello può essere conservato sul ghiaccio per 4-6 h a 4 gradi centigradi.
    5. In un ambiente non sterile trasferire il cervello del ratto in una ciotola di dissezione cerata con abbastanza PBS per sommergerlo. Pin il cervello verso il basso per impedirgli di muoversi.
      NOTA: il passaggio 1.2.5 può essere eseguito presso RT se eseguito rapidamente. In caso contrario, deve essere fatto sul ghiaccio.
    6. Utilizzare pinze affilate e piccole forbici chirurgiche per sezionare le arterie cerebrali ei loro rami che formano il circolo di Willis alla base del cervello sotto il microscopio in PBS a RT. Essere delicato quando si seziona per garantire che il tessuto dell'arteria non è allungato o tagliato. Questo passaggio è fondamentale.
    7. Sciacquare brevemente i segmenti dell'arteria (fino a 1 cm di lunghezza) in PBS in una piastra da 96 pozzi o in un piatto da 35 mm per rimuovere il sangue resimo, quindi posizionarli per 10 minuti in un valore sufficiente della soluzione di arricchimento del colesterolo (preparata al punto 1.1) per coprire l'intero segmento dell'arteria. Utilizzare un piatto 35 mm se c'è una grande quantità di soluzione di arricchimento del colesterolo e un 96 bene piastra se le arterie sono piccole o se c'è una carenza di soluzione di arricchimento del colesterolo.
      NOTA: Lo stesso approccio può essere utilizzato per arricchire altri tessuti e cellule con colesterolo utilizzando un tempo di incubazione di 60 min. Ad esempio, questo approccio è stato precedentemente utilizzato per l'arricchimento del colesterolo delle arterie cerebrali del topo35,45, neuroni ippocampali32, miociti atriale37, e HEK 293 cellule39. Il tempo minimo di incubazione deve essere determinato per ogni tessuto o tipo di cellula sulla base della convalida dell'arricchimento del colesterolo in diversi punti temporali con un saggio sensibile al colesterolo (ad esempio, la determinazione biochimica della quantità di colesterolo nel tessuto macchiando con la tintura a fluorescenza colesterolo).
  3. Macchiare il tessuto arterioso con il colorante fluorescenza steroide-sensibile filipin per determinare eventuali alterazioni nei livelli di colesterolo.
    NOTA: Nella sezione Risultati rappresentativi, dimostriamo i risultati di due approcci per valutare i cambiamenti nei livelli di colesterolo: un saggio biochimico eseguito attraverso l'applicazione di un kit a base di colesterolo ossidasi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali)e colorazione con la colorazione a fluornceesce sensibile agli steroidi. Il primo approccio può essere eseguito seguendo le istruzioni del produttore. Il protocollo per quest'ultimo approccio è fornito di seguito.
    1. Utilizzando una bottiglia fresca di polvere filipina, preparare una soluzione di 10 mg/mL di brodo in solfuro dimetile (DMSO). Questo passaggio è fondamentale.
      NOTA: la soluzione risultante è sensibile alla luce. Se preparata correttamente, la soluzione di stock filipin è giallastra. Alcuni polvere filipin può attaccare al tappo della bottiglia. Pertanto, è importante sciacquare la bottiglia e il tappo con solvente DMSO per trattenere l'intera quantità di filigrana. Una volta preparato, lo stock filipin deve essere utilizzato entro diversi giorni. Filippino perde completamente la sua capacità di fluorescenza dopo 5 giorni, anche se conservato al buio a -20 gradi centigradi.
    2. Rimuovere i segmenti dell'arteria dalla soluzione di arricchimento del colesterolo e lavarli 3x con PBS per 5 min.
    3. Fissare i segmenti dell'arteria in 4% paraformaldeide per 15 min sul ghiaccio.
      AVVISO: la paraformaldeide è sensibile alla luce. Pertanto, il lavoro deve essere effettuato al buio.
    4. Collocare i segmenti dell'arteria in 0,5% Triton in PBS a RT per 10 min per deviare il tessuto e facilitare la penetrazione del tinio.
    5. Lavare i segmenti dell'arteria 3x con PBS per 5 min su uno shaker. Questo passaggio è fondamentale.
      NOTA: Quando il Triton è stato completamente lavato via, non ci dovrebbero essere bolle sulla superficie della soluzione PBS.
    6. Diluire la soluzione di stock filipin in PBS ad una concentrazione finale di 25 g/mL. Rimuovere le arterie formando la soluzione PBS e metterle nella soluzione filipina diluita per 1 h al buio. Questo passaggio è fondamentale.
    7. Lavare la filigrana sciacquando i segmenti dell'arteria 3x con PBS per 5 min su uno shaker. Questo passaggio è fondamentale.
    8. Sciacquare brevemente i segmenti dell'arteria con acqua distillata, assorbire il liquido eccessivo con un tovagliolo di carta e montare le arterie su uno scivolo utilizzando supporti di montaggio disponibili in commercio (vedere Tabella dei materiali).
    9. Coprire l'arteria con un coperchio evitando il rotolamento o la torsione dell'arteria e impostare i vetrini ad asciugare in una zona scura a RT per 24 h.
    10. Dopo che il supporto di montaggio si asciuga, sigillare i bordi coverslip con smalto trasparente, e lasciare lo smalto ad asciugare per 10-15 min. Conservare i vetrini al buio a -20 gradi centigradi.
    11. Equilibrate le diapositive in RT prima dell'imaging.
    12. Immagine del tessuto con un microscopio a fluorescenza o un lettore di fluorescenza con l'eccitazione impostata a 340-380 nm ed emissione a 385-470 nm.
      AVVISO: fotosbianca rapidamente filippini; pertanto, i campioni devono essere immagine tempestivamente.

2. Arricchimento di evociti Xenopus utilizzando dispersioni a base di fosforidi arricchiti dal colesterolo (liposomi)

  1. Preparazione delle soluzioni
    1. Per preparare una soluzione di riserva di colesterolo, sciogliere 10 mg di polvere di colesterolo in 1 mL di cloroformio in un bicchiere di vetro da 10 mL o in una bottiglia. Trasferire la soluzione in una bottiglia di vetro chiuso da 1,5 ml.
      AVVISO: In considerazione della tossicità e della rapida evaporazione del cloroformio, lavorare nel cofano e tenere i reagenti sul ghiaccio.
    2. Preparare un buffer Tris-HEPES da 150 mM, 10 mM, pH 7,4 per fosforidi arricchiti di colesterolo. Per farlo, sciogliere in una fiaschetta Erlenmeyer 5.5905 g di KCl e 0.6057 g di Tris in acqua a doppia distillazione ad un totale di 0.5 L volume. In un altro flacone, sciogliere 5.5905 g di KCl e 1.19155 g di HEPES in acqua a doppia distillazione ad un totale di 0.5 L volume. Mescolare le due soluzioni in una fiaschetta da 1 L Erlenmeyer e regolare il pH a 7,4 con HCl.
      NOTA: Memorizzare la soluzione Tris-HEPES da 150 mM risultante, a 4 mM.
    3. Per preparare il buffer ND96 pre-medio ovocita (basso K,basso Ca2 )tampone, combinare 1 mL di 2 M KCl, 1 mL di 1 M MgCl2, 45,5 mL di 2 M NaCl, e 5 mL di 1/1 M NaOH-HEPES in un pallone 1 L Erlenmeyer. Aggiungere 900 mL di acqua a doppia distillazione e regolare il pH a 7,4 con HCl. Trasferire la soluzione in un cilindro da 1 L e portare il volume a 1 L con acqua a doppia distillazione. Quindi aggiungere 1,8 mL di 1 M CaCl2 e filtrare la soluzione.
      NOTA: Lievi variazioni nei rapporti tra i componenti utilizzati per fare una soluzione ND96 non sembrano essere fondamentali per l'arricchimento del colesterolo, forse perché la soluzione ND96 non viene utilizzata durante la fase di arricchimento stessa, ma per lo stoccaggio. Un esempio è una soluzione da 1 L che ha una concentrazione leggermente inferiore di ioni di sodio e cloruro, ed è realizzata combinando 2 mL di 1 M KCl, 1 mL di 1 M MgCl2, 82,5 mL di 1 M NaCl, 5 mL di 1 M HEPES e 1,8 mL di 1 M CaCl2 (Ca 2 è omesso di ottenere una soluzione gratuita di Ca2). 2+ Regolare il pH della soluzione a 7.4 con NaOH. Conservare la soluzione di coltura di ovociti ND96 risultante a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 mese.
  2. Preparazione della dispersione a base di fosforida con liposomi colesterolo
    1. In un tubo di vetro da 12 mL, unire 200 ll di ciascuno dei seguenti 10 mg/mL soluzioni lipidiche disciolte dicilforato: L-z-phosphatidylethanolamine, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine, e colesterolo.
    2. Evaporare il cloroformio nel cofano per asciugare lentamente sotto un flusso di azoto. Questo passaggio è fondamentale.
    3. Sospendere i lipidi in 800 o l di soluzione tampone composta da 150 mM KCl e 10 mM Tris-HEPES a pH 7.4 e coprire con pellicola di paraffina.
    4. Sonicare delicatamente a 80 kHz per 10 min fino a quando non si forma una miscela lattiginosa. Questo passaggio è fondamentale.
      AVVISO: Quando si sonica, la dispersione nel tubo di vetro dovrebbe vibrare delicatamente, formando piccole onde. Le gocce di dispersione non devono saltare all'interno del tubo.
  3. Arricchire gli evociti di Xenopus con colesterolo
    NOTA: Le ovaie contenenti ovociti di rana possono essere ottenute da due fonti: In primo luogo, le rane femmine di Xenopus laevis possono essere ospitate ai fini della chirurgia interna. Questa procedura deve essere approvata dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. In secondo luogo, intere ovaie possono essere acquistate da fornitori commerciali. In alternativa all'acquisto o all'isolamento di intere ovaie e poi alla loro digestione, come descritto nei passaggi 2.3.1-2.3.4, i singoli ovociti sono disponibili commercialmente per l'acquisto. Se si utilizza quest'ultimo, i passaggi 2.3.1-2.3.4 possono essere ignorati.
    1. Mantenere le ovaie appena ottenute a 14 gradi centigradi in una soluzione ND96. In queste condizioni, le ovaie possono essere conservate fino a 1 settimana.
    2. Per ottenere singoli ovociti, interrompere il sacco ovarico in più luoghi utilizzando pinze affilate. Collocare i pezzi di ovaia in una piastra2+da 60 mm, con 5 mL di Nd96 senza Ca 2,riempiti con collagenasi da 0,5 mg/mL. Agitare su uno shaker orbitale a 60 oscillazioni/min per 15 min a RT.
      NOTA: Questo passaggio garantirà la digestione del sacco ovarico. Per preservare l'attività ezimatica, evitare di conservare collagenasi contenenti ND96 per lunghi periodi di tempo (>1 h). Anche un breve stoccaggio deve essere eseguito a temperature fredde inferiori a 15 gradi centigradi.
    3. Utilizzando una pipetta di trasferimento con una punta larga, pipetta vigorosamente la soluzione contenente ovociti su e giù circa 5-10x per separare i singoli ovociti. In questo passaggio, la soluzione diventerà scura.
    4. Sciacquare rapidamente gli ovociti con ND96 senza Ca2o senza Ca fino a quando la soluzione non diventa trasparente.
    5. Trasferire singoli ovociti alla soluzione ND-96 contenente Ca2ointegrata con 2 mg/mL di gentamicin utilizzando una pipetta di trasferimento con una punta stretta.
      NOTA: Questo passaggio è essenziale quando è necessario memorizzare gli ovociti. I singoli ovociti possono essere conservati in un'incubatrice per diversi giorni a 14-17 gradi centigradi. Tuttavia, gli ovociti morti che sono biancastri devono essere rimossi almeno una volta al giorno per evitare la contaminazione della soluzione con sostanze chimiche tossiche.
    6. Trasferire 90 l della dispersione a base di fosforida arricchita di colesterolo in uno di un pozzo di una piastra di 96 pozze.
    7. Trasferire fino a sei ovociti dal mezzo ND96 al pozzo con il minor mezzo possibile. Questo passaggio è fondamentale.
      AVVISO: Non esporre gli ovociti all'aria durante il trasferimento per mantenere intatti gli ovociti.
    8. Posizionare la piastra 96 pozzo su un rotatore piattaforma tridimensionale per fornire un piccolo movimento orbitale agli ovociti nella cella per 5-10 min.
    9. Aggiungere una goccia di ND96 nel pozzo e trasferire gli ovociti arricchiti di colesterolo dalla piastra del pozzo 96 a una piastra da 35 mm con ND96 per un uso immediato. Questo passaggio è fondamentale.
    10. Utilizzare un kit a base di colesterolo ossidasi disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per valutare i cambiamenti nei livelli di colesterolo seguendo le istruzioni del produttore.

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Representative Results

L'uso di ciclodextrin saturo di colesterolo come mezzo per arricchire tessuti e cellule con colesterolo è ben consolidato. In questo caso, dimostriamo prima l'applicazione di questo approccio ampiamente usato per arricchire le arterie cerebrali di ratto con colesterolo usando MCD saturi di colesterolo. La figura 1A mostra un esempio di uno strato muscolare liscio dell'arteria cerebrale raffigurata e dimostra l'aumento dipendente dalla concentrazione della fluorescenza associata in ostrulità ottenuta sull'arricchimento dei tessuti con crescenti concentrazioni di colesterolo che vanno da 6,25 M-6,25 mM per 1 h. La quantificazione corrispondente dei dati di imaging è illustrata nella Figura 1B. In particolare, l'aumento dei livelli di colesterolo 2 h dopo il periodo di incubazione di 1 h è stato di 50% dell'aumento osservato immediatamente dopo il trattamento con il complesso di colesterolo M.CD: . Come mostra la figura 1C per il campione trattato con colesterolo di 0,625 mM per 1 h, gli studi funzionali che utilizzano i tessuti trattati devono essere effettuati il prima possibile dopo il completamento dell'arricchimento del colesterolo. Inoltre, mentre un tempo di incubazione di 1 h è comunemente usato per arricchire tessuti e cellule con colesterolo utilizzando questo approccio, 5 min di incubazione è di solito sufficiente per ottenere un aumento statisticamente significativo del contenuto di colesterolo dell'arteria cerebrale come determinato da un saggio biochimico a base di colesterolo ossidase, come raffigurato nella Figura 1D. L'aumento del contenuto di colesterolo è rimasto allo stesso livello quando il tempo di incubazione è stato aumentato a 60 min(Figura 1D).

L'efficacia dei liposomi arricchiti di colesterolo come mezzo per arricchire Xenopus oocytes con colesterolo è dimostrata nella Figura 2A-C. Mentre non è stato osservato alcun cambiamento significativo nei livelli di colesterolo nelle dispersioni a base di controllo a base di fosfolipidi priva di colesterolo (Figura 2A), i livelli di colesterolo sono aumentati in modo significativo dopo solo 5 min di trattamento con le dispersioni a base di fosfolipidi che includevano il colesterolo, ed è rimasto allo stesso livello quando il tempo di incubazione è stato aumentato a 60 min (Figura 2B). Un effetto simile è stato osservato in due lotti diversi di ovociti che sono stati ottenuti da due rane. In particolare, tuttavia, sia i livelli iniziali di colesterolo che il cambiamento del contenuto di colesterolo variavano tra i due lotti: nel lotto 1, la concentrazione iniziale di colesterolo era di 64 g di colesterolo per mg di proteine, mentre la concentrazione iniziale nel lotto 2 era 45 g di colesterolo per mg di proteine, che è il 70% dei livelli iniziali di colesterolo nel lotto 1. Dopo un trattamento di 60 min, la concentrazione di colesterolo nel lotto 1 era di 124 g di colesterolo per mg di proteine, mentre nel lotto 2 era 67 g di colesterolo per mg di proteine. Così, mentre la concentrazione di colesterolo è aumentata di oltre il 90% nel batch 1, è aumentata del 50% nel lotto 2. Tuttavia, l'aumento sostanziale dei livelli di colesterolo in entrambi i lotti fornisce i mezzi per studiare l'effetto di un aumento dei livelli di colesterolo sulla funzione delle proteine espresse in questo sistema di espressione eteloga. Inoltre, l'approccio di dispersione basato sul fosfolipidi per arricchire gli evociti di Xenopus con il colesterolo sembra essere più efficace dell'applicazione di ciclodextrin saturi di colesterolo come fatto nei tessuti e nelle cellule. Come dimostra la Figura 3, l'applicazione di complessi di colesterolo ciclodelina per arricchire gli ovociti utilizzando ciclodextrin5 5mM ha provocato una media di un aumento medio del 25% dei livelli di colesterolo.

L'efficacia dell'approccio basato su ciclodextrin per l'arricchimento delle cellule è dimostrata anche nei neuroni appena isolati dalla regione CA1 dell'ippocampo (Figura 4A). Come mostra la figura 4B, l'incubazione dei neuroni in M'CD satura di colesterolo per 60 min ha provocato un aumento di oltre 2 volte nei livelli di colesterolo come determinato dalla fluorescenza filippina associata. Utilizzando questo approccio, abbiamo testato l'effetto dell'aumento del colesterolo sui canali GIRK espresso nei neuroni ippocampali. Come dimostra la figura 4C, questo cambiamento nei livelli di colesterolo ha provocato un aumento significativo delle correnti GIRK. Allo stesso modo, abbiamo testato l'effetto dell'arricchimento del colesterolo sulla sottounità GIRK primaria espressa nel cervello, GIRK2, usando il sistema di espressione etetologo Xenopus oocytes. A tal fine, abbiamo sovraespresso IL GIRK2 (GIRK2_E152D), un mutante poro di GIRK2 che aumenta la sua espressione di membrana e l'attività52 negli ovociti di Xenopus, e arricchito gli ovociti con colesterolo per 60 min utilizzando l'approccio di dispersione a base di fosforicolo. Come dimostrano le figure 4D-F, l'aumento dei livelli di colesterolo ha provocato un aumento significativo delle correnti simili all'effetto dell'aumento dei livelli di colesterolo nei neuroni sulla funzione del canale GIRK. Questi dati dimostrano ulteriormente l'efficacia, la consistenza e l'utilità dei due approcci descritti in precedenza per determinare l'impatto dell'aumento dei livelli di colesterolo sull'attività proteica e sulla funzione cellulare.

Figure 1
Figura 1: Arricchimento rappresentativo delle arterie cerebrali del ratto con colesterolo usando metil-z-ciclodextrinsatursatura satura di colesterolo. (A) Un esempio di uno strato muscolare liscio dell'arteria cerebrale immagine che dimostra l'aumento dipendente dalla concentrazione della fluorescenza filippina ottenuta con l'arricchimento dei tessuti con crescenti concentrazioni di colesterolo che vanno da 6,25 m-6,25 mM per 1 h. (B) Quantificazione dei dati di imaging in (A). La misurazione dell'intensità di fluorescenza dell'intera immagine è stata eseguita utilizzando la funzione integrata "Misurazione" nel software commerciale. Ad ogni concentrazione di colesterolo, sono state raccolte immagini da 3 dollari che sono state raccolte da donatori animali separati. Per ogni concentrazione di colesterolo, i dati sono presentati come l'errore medio standard. (C) I livelli di colesterolo nell'arteria cerebrale liscia strati di strato muscolare immediatamente dopo un periodo di incubazione di 1 h con 0,625 mM di colesterolo, e 3 h dopo l'inizio del trattamento (cioè 1 h di incubazione seguita da 2 h in PBS). (D) Dipendenza dei livelli di colesterolo al tempo di incubazione come determinato da un saggio biochimico a base di ossida di colesterolo. Una differenza significativa è indicata da un asterisco (-p - 0,05). Pannelli (A) (concentrazioni di colesterolo 0 mM-0,625 mM), (B) e (C) sono stati modificati da North et al.45. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Arricchimento rappresentativo di Xenopus evociti con colesterolo usando liposomi. (A) Cambiamento di piegatura nei livelli di colesterolo degli evociti Xenopus incubati in liposomi privi di colesterolo per 5-60 min. (B) Variazione della piega nei livelli di colesterolo degli evociti di Xenopus incubati in liposomi arricchiti di colesterolo per 5-60 min. La barra di controllo raffigurata si riferisce all'incubazione in liposomi privi di colesterolo per 5 min ed è mostrata come un confronto. (C) Confronto dell'effetto dell'arricchimento del colesterolo di due diversi lotti di evociti di Xenopus utilizzando liposomi arricchiti di colesterolo per 5 e 60 min. Una differenza significativa è indicata da un asterisco (-p - 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Arricchimento rappresentativo di Xenopus ovociti con colesterolo utilizzando metil-ciclodextrinsatura satura di colesterolo. (A) Variazione delle pieghe nei livelli di colesterolo degli evociti Xenopus incubati nel controllo ND96 media per 5-60 min. (B) Variazione della piega nei livelli di colesterolo di Enopus evociti incubati in M'CD saturi di colesterolo per 5-60 min. La barra di controllo raffigurata si riferisce all'incubazione nei supporti di controllo per 5 min ed è mostrata come un confronto. Una differenza significativa è indicata da un asterisco (-p - 0,05). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Esempi rappresentativi di studi sull'arricchimento del colesterolo sulla funzione delle proteine nelle cellule e negli evociti di Xenopus: l'impatto del colesterolo sui canali di potassio che rettificalano interiormente le proteine delle proteine galigni. (A) Segnale di fluorescenza associato ai filici del neurone piramidale CA1 ippocampo dai ratti in controllo (a sinistra) e arricchiti di colesterolo (a destra). (B) Dati sintetici dei segnali di fluorescenza associati a filipin ottenuti dai neuroni piramidali CA1 appena isolati e di controllo e arricchiti di colesterolo. L'arricchimento del colesterolo è stato ottenuto incubando i neuroni in M'CD saturi di colesterolo per 1 h (n - 12-14). (C) Corrente ionica (I)-tensione(V) che rappresenta l'effetto dell'arricchimento del colesterolo come descritto in (B) sulle correnti GIRK nei neuroni ippocampali della regione CA1. (D) Tracce rappresentative che mostrano l'effetto dell'arricchimento del colesterolo utilizzando liposomi a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo su GIRK2 , (GIRK2_E152D) espressi in ovociti di Xenopus a -80 mV e 80 mV. (E) Dati di riepilogo di (D) a -80 mV (n : 6-9). Una differenza significativa è indicata da un asterisco (-p - 0,05). Le sottofigure (B-E) sono state modificate da Bukiya et al.32. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I metodi per arricchire i tessuti e le cellule dei mammiferi e gli evociti di Xenopus con il colesterolo costituiscono un potente strumento per studiare l'effetto dei livelli elevati di colesterolo sulle singole specie molecolari, sui complessi sistemi macromolecolari (ad esempio, proteine) e sulla funzione cellulare e dell'organo. In questo articolo, abbiamo descritto due approcci complementari che facilitano tali studi. In primo luogo, abbiamo descritto come arricchire i tessuti e le cellule con colesterolo utilizzando M'CD saturato di colesterolo. Abbiamo dimostrato che nei segmenti dell'arteria cerebrale, questo approccio ha portato ad un aumento del 50% dei livelli di colesterolo. Inoltre, in un recente studio, abbiamo dimostrato che lo stesso approccio porta ad un aumento di oltre 2x del contenuto di colesterolo nei neuroni ippocampali della regione CA1. Al contrario, tuttavia, l'impiego di questo approccio come mezzo per arricchire gli evociti Xenopus ha provocato solo un aumento del 25% del contenuto di colesterolo negli evociti di Xenopus. Così, per arricchire gli evociti di Xenopus, abbiamo sviluppato un approccio di dispersione basato su fosforici che si traduce costantemente in un aumento di almeno il 50% dei livelli di colesterolo. È possibile che il vantaggio di questo approccio per arricchire gli evociti Xenopus derivi da una maggiore capacità di carico rispetto alla capacità di carico dell'approccio complesso M'CD:colesterolo. E 'anche possibile che, mentre l'approccio complesso M-CD:colesterolo è ottimizzato per arricchire tessuti e cellule, ulteriore ottimizzazione del protocollo è necessaria per migliorare la sua applicazione per l'arricchimento di Xenopus evociti.

La dispersione a base di fosfolipidi utilizzata per arricchire gli ovociti Xenopus con colesterolo include due lipidi che sono ampiamente utilizzati per creare bistrati lipidi planari (ad esempio, L-z-fosofililelolamina e 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Tuttavia, in uno studio precedente, è stato dimostrato che Xenopus ovociti potrebbero anche essere arricchiti utilizzando il colesterolo da liposomi che includeva fossphatidylcolincolina e cholate36. Questo metodo ha provocato un aumento del rapporto molare colesterolo/fosforiponellide nella membrana plasmatica da 0,5 x 0,1 a 0,9 x 0,1 con una percentuale media di arricchimento del 71%. Questa percentuale media di arricchimento è molto simile al livello medio di aumento del contenuto di colesterolo che abbiamo osservato (70,5%), suggerendo che la scelta dei fosfolipidi utilizzati per formare la dispersione non è fondamentale per arricchire gli evociti Xenopus con il colesterolo utilizzando questo approccio.

Ogni protocollo descritto prevede diversi passaggi critici. Dopo aver preparato una miscela di M-CD:colesterolo con un rapporto di 8:1 molare per garantire la saturazione di M-CD con colesterolo, è fondamentale coprire la fiaschetta con almeno due strati di pellicola di paraffina e impostarla in un bagno d'acqua a37 gradi durante la notte. Quando si sezionano i tessuti per il trattamento del colesterolo è importante essere gentili per garantire che il tessuto non sia allungato o tagliato. Dopo aver permeabilizzato il tessuto per facilitare la penetrazione del tinri, è fondamentale lavare accuratamente i segmenti di tessuto in PBS. La colorazione dei tessuti nel fillipin deve essere eseguita al buio e la fillipina deve essere meticolosamente sbiadita dopo il completamento della colorazione. Quando si preparano dispersioni a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo, è fondamentale garantire che la dispersione nel tubo di vetro violi delicatamente, formando piccole onde, per evitare la separazione del colesterolo dalla dispersione. Per il trattamento del colesterolo degli ovociti Xenopus, è importante trasferire gli ovociti dal mezzo ND96 al pozzo con la dispersione a base di fosfolipidi arricchita di colesterolo con il meno mezzo possibile, senza esporre gli ovociti all'aria per mantenere intatti gli ovociti. È importante notare che a causa del meccanismo intrinseco nei tessuti, cellule, e Xenopus ovociti, i livelli di colesterolo possono equilibrato, e poi tornare ai loro livelli originali nel tempo. Di conseguenza, gli studi funzionali devono essere effettuati immediatamente dopo il tempo di incubazione. Qui, abbiamo dimostrato questa nozione nelle arterie cerebrali arricchite con colesterolo, dimostrando che l'aumento dei livelli di colesterolo 2 h dopo un periodo di incubazione di 1 h era circa la metà dell'aumento osservato immediatamente dopo il periodo di incubazione.

Nonostante seguendo i passaggi critici descritti in precedenza, possono sorgere diverse sfide. Per esempio, un aumento dei livelli di colesterolo non può essere osservato dopo il trattamento di arricchimento del colesterolo. Se questo è il caso, potrebbe essere necessario aumentare la concentrazione di colesterolo nei media che arricchiscono il colesterolo. Lo stesso vale per l'arricchimento del colesterolo di tessuti, cellule, e Xenopus evociti. Tuttavia, nella preparazione di trattamenti che utilizzano l'approccio complesso M-CD:colesterolo, la quantità di M-CD dovrebbe essere aumentata con l'aumento della concentrazione di colesterolo per mantenere un rapporto di 8:1 molar con colesterolo. Inoltre, potrebbe essere necessario preparare una soluzione fresca che arricchisce il colesterolo, perché il colesterolo tende a precipitare fuori dalla soluzione e la soluzione perde la sua efficienza che arricchisce il colesterolo. Dopo l'arricchimento del colesterolo, è possibile che non si osservi un segnale filimeno. In questo caso, potrebbe essere necessario utilizzare una polvere filipina fresca per preparare un nuovo stock e ripetere l'esperimento. La fluorescenza filippina diminuisce rapidamente e la soluzione di stock non può essere conservata per più di diversi giorni. Una limitazione della colorazione filipina è che sembra riconoscere steroidi diversi dal colesterolo. Per esempio, abbiamo recentemente dimostrato un aumento del segnale di fluorescenza filippino associato nelle arterie cerebrali del ratto dopo l'arricchimento con coprostanol45. Pertanto, i risultati di colorazione filipin dovrebbero essere interpretati con cautela e, in caso di dubbio, dovrebbero essere utilizzati approcci alternativi per corroborare i risultati. Una possibilità potrebbe essere quella di eseguire un saggio biochimico attraverso l'applicazione di un kit a base di colesterolo ossidano disponibile in commercio.

In sintesi, gli approcci presentati sono molto efficaci nel raggiungimento dell'arricchimento del colesterolo di quasi o superiore al 50%. Infatti, l'approccio complesso m-CD:colesterolo che si traduce in 50% nei livelli di colesterolo nelle arterie cerebrali è molto più efficiente rispetto all'utilizzo di LDL per arricchire questi tessuti, che si traduce in un semplice aumento del 10% del colesterolo35. Lo stesso vale per l'applicazione di dispersioni a base di fosfolipidi arricchiti di colesterolo (liposomi) per arricchire xenopus ovociti. Come descritto sopra, Questo approccio si traduce costantemente in almeno un 50% aumento dei livelli di colesterolo. È importante sottolineare che questi due approcci per l'arricchimento del colesterolo in vitro producono risultati che sono paragonabili con l'aumento di colesterolo ottenuto sottoponendo gli animali a una dieta ad colesterolo alto32,37,40,5353,54. Inoltre, a differenza delle diete per colesterolo alto di settimane, gli approcci in vitro richiedono solo pochi minuti di tempo di incubazione per raggiungere un aumento statisticamente significativo e costante del livello di colesterolo.

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Disclosures

Dr. A. M. Dopico è un dipendente speciale, part-time, dipendente federale e attuale membro del National Advisory Council on Alcohol Abuse and Alcoholism.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da un borsedigio per lo sviluppo di scienziati (11SDG5190025) dell'American Heart Association (a A.R.-D.), e dal National Institute of Health R01 concede AA-023764 (a A.N.B.) e HL-104631 e R37 AA-11560 (a A.M.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

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