Enriquecimiento de los tejidos de los mamíferos y los ovocitos del xenopus con el colesterol

Biochemistry

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Summary

Se presentan dos métodos de enriquecimiento del colesterol: la aplicación de ciclodextrina saturada con colesterol para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos, y el uso de dispersiones basadas en fosfolípidos enriquecidos con colesterol (liposomas) para enriquecer los ovocitos de Xenopus. Estos métodos son instrumentales para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica.

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Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

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Abstract

El enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos, incluyendo los ovocitos de Xenopus utilizados para estudiar la función celular, se puede lograr utilizando una variedad de métodos. Aquí, describimos dos enfoques importantes utilizados para este propósito. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y células con colesterol usando ciclodextrina saturada con colesterol usando arterias cerebrales (tejidos) y neuronas hipocampales (células) como ejemplos. Este enfoque se puede utilizar para cualquier tipo de tejido, células o líneas celulares. Un enfoque alternativo para el enriquecimiento del colesterol implica el uso de lipoproteínas de baja densidad (LDL). La ventaja de este enfoque es que utiliza parte de la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula. Sin embargo, mientras que el enfoque de ciclodextrina se puede aplicar para enriquecer cualquier tipo de interés celular con el colesterol, el enfoque LDL se limita a las células que expresan receptores LDL (por ejemplo, células hepáticas, células derivadas de la médula ósea como leucocitos de sangre y macrófagos tisulares), y el nivel de enriquecimiento depende de la concentración y la movilidad del receptor LDL. Además, las partículas de LDL incluyen otros lípidos, por lo que la administración de colesterol no es específica. En segundo lugar, describimos cómo enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol utilizando una dispersión basada en fosfolípidos (es decir, liposomas) que incluye el colesterol. Los ovocitos de xenopus constituyen un popular sistema de expresión hetóloga utilizado para estudiar la función celular y proteica. Tanto para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en ciclodextrina del tejido de mamíferos (arterias cerebrales) como para el enfoque de enriquecimiento de colesterol basado en fosfolípidos de los ovocitos de Xenopus, demostramos que los niveles de colesterol alcanzan un máximo de 5 minutos de incubación. Este nivel de colesterol permanece constante durante períodos prolongados de incubación (por ejemplo, 60 min). Juntos, estos datos proporcionan la base para condiciones temporales optimizadas para el enriquecimiento de colesterol de tejidos, células y ovocitos de Xenopus para estudios funcionales destinados a interrogar el impacto del enriquecimiento de colesterol.

Introduction

El colesterol, un lípido celular importante, desempeña numerosos roles funcionales y estructurales críticos1,2,3,4,5,6,7,8,9. Desde la regulación de las propiedades físicas de la membrana plasmática hasta asegurar la viabilidad celular, el crecimiento, la proliferación y servir como una molécula de señalización y precursora en una gran cantidad de vías bioquímicas, el colesterol es un componente imperativo necesario para la función celular y orgánica normal. Como resultado, deficiencia de colesterol resulta en malformaciones físicas graves y una variedad de trastornos. Por otro lado, incluso un pequeño aumento del colesterol por encima de los niveles fisiológicos (2-3x) es citotóxico1,2,10 y se ha asociado con el desarrollo de trastornos, incluyendocardiovasculares 11,12,13 y enfermedades neurodegenerativas14,15,16,17. Por lo tanto, para interrogar las funciones críticas del colesterol y determinar el efecto de los cambios en los niveles de colesterol, se han desarrollado diferentes enfoques que alteran el contenido de colesterol en tejidos, células y ovocitos de Xenopus.

Alteración de los niveles de colesterol en los tejidos y células de los mamíferos
Se pueden aprovechar varios enfoques para disminuir los niveles de colesterol en tejidos y células18. Un enfoque implica su exposición a estatinas disueltas en suero deficiente en lipoproteínas para inhibir la HMG-CoA reductasa, que controla la tasa de síntesis de colesterol19,20. Sin embargo, estos medicamentos para reducir el colesterol también inhiben la formación de productos no esteroles a lo largo de la vía del mevalonato. Por lo tanto, se añade una pequeña cantidad de mevalonato para permitir la formación de estos productos21 y mejorar la especificidad de este enfoque. Otro enfoque para disminuir los niveles de colesterol implica el uso de -ciclosdextrinas. Estos monómeros de glucopranosa poseen una cavidad hidrofóbica interna con un diámetro que coincide con el tamaño de los esteroles22,lo que facilita la extracción de colesterol de las células, agotando así su contenido de colesterol nativo23. Un ejemplo es el 2-hidroxipropil--ciclodextrina (HP-CD), un medicamento preclínico que actualmente se está probando para el tratamiento de la enfermedad de Niemann-Pick tipo C, un trastorno metabólico mortal genéticamente heredado caracterizado por el almacenamiento de colesterol lisosomal24. El nivel de agotamiento del colesterol depende del derivado específico utilizado. Por ejemplo, la HP-CD extrae el colesterol con una capacidad inferior a la derivada metilada, metil--ciclodextrina (M-CD)24,25,26,27,28,29,30. En particular, sin embargo, -ciclosdextrinas también pueden extraer otras moléculas hidrófobas además del colesterol, que luego puede resultar en efectos inespecíficos31. A diferencia del agotamiento, las células y los tejidos se pueden enriquecer específicamente con colesterol a través del tratamiento con la ciclodextrina que ha sido presaturado con colesterol23. Este enfoque también se puede utilizar como un control para la especificidad de las ciclosdextrinas utilizadas para el agotamiento del colesterol31. El agotamiento del colesterol de los tejidos y las células es sencillo y se puede lograr exponiendo las células durante 30-60 min a 5 mM M-CD disuelto en el medio utilizado para almacenar las células. Este enfoque puede resultar en una disminución del 50% en el contenido de colesterol (por ejemplo, en las neuronas del hipocampo32, las arterias cerebrales de rata33). Por otro lado, la preparación del complejo de ciclodextrina-colesterol para el enriquecimiento de colesterol de tejido y células es más compleja, y se describirá en la sección de protocolo.

Un enfoque alternativo para enriquecer los tejidos y las células que utilizan la ciclodextrina saturada con colesterol implica el uso de LDL, que se basa en receptores LDL expresados en los tejidos/células18. Si bien este enfoque ofrece la ventaja de utilizar la maquinaria de homeostasis de colesterol natural de la célula, tiene varias limitaciones. En primer lugar, los tejidos y células que no expresan el receptor LDL no se pueden enriquecer con este enfoque. En segundo lugar, las partículas de LDL contienen otros lípidos además del colesterol. Específicamente, LDL se compone de la proteína ApoB100 (25%) y los siguientes lípidos (75%): colesterol de 6-8%, éster de colesteryl de 45-50%, fosfolípidos de 18-24% y triacilgliceroles de 4-8%34. Por lo tanto, la administración de colesterol a través de partículas DE LDL es inespecífica. En tercer lugar, el porcentaje de aumento en el contenido de colesterol por LDL en los tejidos y células que expresan el receptor LDL puede ser significativamente menor que el aumento observado utilizando ciclodextrina saturada de colesterol. Por ejemplo, en un estudio anterior, el enriquecimiento de las arterias cerebrales de roedores con colesterol a través de LDL dio lugar a sólo un aumento del 10-15% en los niveles de colesterol35. Por el contrario, el enriquecimiento de estas arterias con ciclodextrina saturada de colesterol como se describe en la sección de protocolo dio lugar a >50% aumento en el contenido de colesterol (Ver sección Resultados Representativos, Figura 1).

Alteración de los niveles de colesterol en los ovocitos de Xenopus
Los ovocitos de xenopus constituyen un sistema de expresión hetólogo comúnmente utilizado para el estudio de la función celular y proteica. Estudios anteriores han demostrado que la relación de colesterol a fosfolípidos molares en los ovocitos de Xenopus es de 0,5 x 0,136. Debido a este alto nivel intrínseco de colesterol, aumentar el contenido de colesterol en este sistema es un reto, sin embargo, se puede lograr utilizando dispersiones hechas de fosfolípidos de membrana y colesterol. Los fosfolípidos que hemos elegido para este fin son similares a los utilizados para la formación de bicapas de lípidos planas artificiales e incluyen L-a-fosfatidiletanolamina (POPE) y 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serina (POPS), como se describe en la sección de protocolo. Este enfoque puede resultar en >50% de aumento en el contenido de colesterol (ver sección Resultados representativos, Figura 2).

Un enfoque alternativo para enriquecer los ovocitos de Xenopus con dispersiones basadas en fosfolípidos implica el uso de ciclodextrina saturada de colesterol, que es similar a la forma en que se enriquecen los tejidos y las células. Sin embargo, hemos encontrado que este enfoque es de baja reproducibilidad y eficiencia, con un aumento promedio del 25% en el contenido de colesterol. Esto es posiblemente debido a la diferente capacidad de carga de estos dos enfoques (ver sección Resultados representativos, Figura 3). Por el contrario, se ha demostrado que el uso de ciclodextrina para agotar el colesterol de los ovocitos de Xenopus puede resultar en una disminución del 40% en el contenido de colesterol36.

Aquí, nos centramos en el enriquecimiento de colesterol de los tejidos y células de los mamíferos a través de la aplicación de ciclodextrina saturada de colesterol, y de los ovocitos de Xenopus usando liposomas. Ambos enfoques se pueden aprovechar para delinear el efecto del aumento de los niveles de colesterol en la función proteica. Los mecanismos de modulación del colesterol de la función proteica pueden implicar interacciones directas8 y/o efectos indirectos9. Cuando el colesterol afecta la función proteica a través de interacciones directas, el efecto de un aumento en los niveles de colesterol en la actividad proteica es probablemente independiente del tipo de célula, sistema de expresión, o enfoque de enriquecimiento. Por ejemplo, utilizamos estos dos enfoques para determinar el efecto del colesterol en la proteína G cerrada internamente rectificando los canales de potasio (GIRK) expresados en miocitos auriculares37, neuronas hipocampales32,38, HEK29339 células, y xenopus ovocitos32,37. Los resultados obtenidos en estos estudios fueron consistentes: en los tres tipos de células de mamíferos y en los ovocitos anfibios el colesterol upregulated función del canal GIRK (ver sección Resultados Representativos, Figura 4, para las neuronas del hipocampo y los experimentos correspondientes en ovocitos de Xenopus). Además, las observaciones realizadas en estos estudios también fueron coherentes con los resultados de los estudios realizados en micocitos auriculares37,,40 y neuronas hipocampales32,,38 recién aisladas de animales sometidos a una dieta alta en colesterol40. En particular, el enriquecimiento de colesterol de las neuronas hipocampales que utilizan M-CD revirtió el efecto de la terapia con atorvastatina utilizada para abordar el impacto de la dieta alta en colesterol tanto en los niveles de colesterol como en la funciónGIRK 38. En otros estudios, investigamos el efecto de las mutaciones en la sensibilidad al colesterol del canal de potasio Ki2.1 rectificando internamente Kir2.1 utilizando ambos ovocitos de Xenopus y células HEK29341. Una vez más, el efecto de las mutaciones en la sensibilidad del canal fue similar en los dos sistemas.

Las aplicaciones de ambos métodos de enriquecimiento para determinar el impacto de los niveles elevados de colesterol en la función molecular, celular y orgánica son numerosas. En particular, el uso de complejos de ciclodextrina-colesterol para enriquecer las células y tejidos es muy común en gran medida debido a su especificidad. Ejemplos recientes de este enfoque incluyen la determinación del impacto del colesterol en la activación del canal HERG y los mecanismos subyacentes42, el descubrimiento de que el colesterol activa el receptor acoplado a la proteína G Suavizado para promover la señalización de erizo43, y la identificación del papel del colesterol en la biomecánica de células madre y la adipogénesis a través de proteínas de vinculador asociadas a la membrana44. En nuestro propio trabajo, utilizamos el enriquecimiento de tejido de mamíferos con el complejo M-CD:colesterol para estudiar el efecto del enriquecimiento de colesterol en la función básica y el perfil farmacológico de los canales de calcio y voltaje cerrados de gran conductancia (BK, MaxiK) en el músculo liso vascular35,,45,,46. En otros estudios, utilizamos el enfoque de dispersión basado en fosfolípidos para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol para determinar las funciones de diferentes regiones en los canales Kir2.1 y GIRK en sensibilidad al colesterol41,,47,48,49, así como para determinar los sitios de unión del colesterol putativo en estos canales32,50,51.

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Protocol

Todos los procedimientos experimentales con animales se realizaron en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Tennessee (UTHSC). El cuidado de los animales y los protocolos experimentales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la UTHSC, que es una institución acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International.

1. Enriquecimiento de tejidos y células utilizando metil--ciclodextrina saturada de colesterol

NOTA: El protocolo de enriquecimiento de colesterol a continuación es adecuado para tejidos, células y líneas celulares. Como ejemplo, describimos los pasos realizados para enriquecer las arterias cerebrales de los mamíferos. Se proporcionan resultados representativos tanto para las arterias cerebrales (Figura 1) como para las neuronas (Figura 4).

  1. Preparación de la Enfermedad saturada de colesterol
    1. Pesar 0,064 g de M-CD y disolverlo en un matraz que contenga 10 ml de solución salina tamponada de fosfato (PBS) para obtener una concentración final de 5 mM. Revuelva la solución con una barra de agitación para asegurarse de que el M-CD esté completamente disuelto.
    2. Pesar 0.0024 g de colesterol en polvo y añadirlo al mismo matraz para obtener una concentración de colesterol de 0,63 mM. A continuación, revuelva la solución vigorosamente. Usa una espátula para romper tantos trozos de colesterol como sea posible (algunos trozos permanecerán hasta la incubación).
    3. Cubra el matraz con al menos dos capas de película de parafina y agítese lentamente (30 oscilaciones/min) en un baño de agua de 37oC durante la noche. Este paso es crítico.
    4. Después de 8-16 h, enfríe la solución a temperatura ambiente (RT) y luego filtre a través de un filtro de jeringa de poliétersulfone de 0,22 m en una botella de vidrio.
      NOTA: Para alcanzar diferentes concentraciones de colesterol en solución, ajuste las cantidades de colesterol y DeC en proporción simple. Es importante mantener la relación molar M-CD:colesterol en 8:1 para obtener la saturación del portador de metil--ciclodextrina con colesterol. La solución que enriquece el colesterol se puede utilizar inmediatamente o en el transcurso de varios días si se almacena a 4 oC. Sin embargo, la capacidad enriquecedora del colesterol disminuye con el tiempo a medida que aparecen los agregados de colesterol, y la solución se vuelve turbia.
  2. Tratamiento de las arterias cerebrales con M-CD saturado con colesterol
    1. Eutanasia a una rata Sprague Dawley (250-300 g) colocándola en una cámara con 2% de isoflurano. Luego, decapita a la rata anestesia usando una guillotina afilada o un gran par de tijeras afiladas.
      NOTA: Si se realizan estos procedimientos con regularidad, es útil desarrollar un cronograma para el afilado de guillotina. Además, un par separado de tijeras debe ser dedicado para la decapitación de roedores. La decapitación de roedores es un procedimiento terminal; por lo tanto, los instrumentos no tienen que ser estériles. La limpieza con agua jabonosa después de cada uso es suficiente.
    2. Coloque la cabeza de la rata mirando hacia adelante, lejos del investigador. Coloque la parte puntiaguda de un par de tijeras de tamaño medio entre el cráneo y el tallo cerebral, y corte lateralmente en ambos lados.
    3. Usa fórceps para abrir el cráneo superior tirando hacia arriba de la base del cráneo donde se hicieron los cortes laterales y retira cuidadosamente el cerebro. Asegúrese de cortar los nervios ópticos que sostienen el cerebro dentro del cráneo.
    4. Ponga el cerebro en un vaso de precipitados con PBS en hielo después de retirarlo.
      NOTA: El cerebro se puede almacenar en hielo durante 4-6 h a 4 oC.
    5. En un ambiente no estéril transfiera el cerebro de la rata a un cuenco de disección encerado con suficiente PBS para sumergirlo. Fija el cerebro para evitar que se mueva.
      NOTA: El paso 1.2.5 se puede llevar a cabo en RT si se realiza rápidamente. De lo contrario, debe hacerse sobre hielo.
    6. Utilice fórceps afilados y pequeñas tijeras quirúrgicas para diseccionar las arterias cerebrales y sus ramas que forman el Círculo de Willis en la base del cerebro bajo el microscopio bajo el microscopio en PBS en RT. Sea suave al diseccionar para asegurarse de que el tejido arterial no se estira o se corta. Este paso es crítico.
    7. Enjuague brevemente los segmentos de la arteria (hasta 1 cm de largo) en PBS, ya sea en una placa de 96 pocillos o en un plato de 35 mm para extraer la sangre sobrante, y luego colóquelos durante 10 minutos en suficiente de la solución que enriquece el colesterol (preparada en el paso 1.1) para cubrir los segmentos de la arteria entera. Utilice un plato de 35 mm si hay una gran cantidad de solución que enriquece el colesterol y una placa de 96 pozos si las arterias son pequeñas o si hay una escasez de solución que enriquece el colesterol.
      NOTA: El mismo enfoque se puede utilizar para enriquecer otros tejidos y células con colesterol usando un tiempo de incubación de 60 minutos. Por ejemplo, este enfoque se ha utilizado anteriormente para el enriquecimiento de colesterol de arterias cerebrales de ratón35,45, neuronas hipocampales32, miocitos auriculares37,y HEK 293 células39. El tiempo mínimo de incubación debe determinarse para cada tejido o tipo de célula en función de la validación del enriquecimiento de colesterol en diferentes puntos de tiempo con un ensayo sensible al colesterol (por ejemplo, la determinación bioquímica de la cantidad de colesterol en el tejido mediante la tinción con el colorante de fluorescencia sensible al colesterol filipin).
  3. Manchar el tejido arterial con el esteroide sensible a la fluorescencia tinte filipin para determinar cualquier alteración en los niveles de colesterol.
    NOTA: En la sección Resultados representativos, demostramos los resultados de dos enfoques para evaluar los cambios en los niveles de colesterol: un ensayo bioquímico realizado mediante la aplicación de un kit basado en oxidasa de colesterol disponible comercialmente (ver Tabla de materiales)y la tinción con el filipin de tinte de fluorescencia sensible a los esteroides. El primer enfoque se puede realizar siguiendo las instrucciones del fabricante. El protocolo para este último enfoque se proporciona a continuación.
    1. Utilizando un frasco fresco de polvo de filipin, prepare una solución de 10 mg/ml en solución de dimetilsulfóxido (DMSO). Este paso es crítico.
      NOTA: La solución resultante es sensible a la luz. Si se prepara correctamente, la solución de filipinoin stock es amarillento. Un poco de polvo de filipin puede pegarse a la tapa del frasco. Por lo tanto, es importante enjuagar el frasco y la tapa con disolvente DMSO para retener toda la cantidad de filipin. Una vez preparado, el stock de filipin debe utilizarse en el plazo de varios días. Filipin pierde por completo su capacidad de fluorescencia después de 5 días, incluso cuando se almacena en la oscuridad a -20 oC.
    2. Retire los segmentos de las arterias de la solución que enriquece el colesterol y lávelos 3 veces con PBS durante 5 min.
    3. Fijar los segmentos de la arteria en 4% paraformaldehído durante 15 minutos en hielo.
      ADVERTENCIA: Paraformaldehído es sensible a la luz. Por lo tanto, el trabajo debe llevarse a cabo en la oscuridad.
    4. Coloque los segmentos de la arteria en 0.5% Tritón en PBS a RT durante 10 minutos para permeabilizar el tejido y facilitar la penetración del tinte.
    5. Lave los segmentos de la arteria 3 veces con PBS durante 5 minutos en una coctelera. Este paso es crítico.
      NOTA: Cuando el Tritón se ha lavado completamente, no debe haber burbujas en la superficie de la solución PBS.
    6. Diluir la solución de material de filipin en PBS a una concentración final de 25 g/ml. Retire las arterias que forman la solución de PBS y colóquelas en la solución de filipin diluido durante 1 h en la oscuridad. Este paso es crítico.
    7. Lavar el filipin encerrando los segmentos de la arteria 3 veces con PBS durante 5 minutos en una coctelera. Este paso es crítico.
    8. Enjuague brevemente los segmentos de las arterias con agua destilada, absorba el líquido excesivo con una servilleta de papel y monte las arterias en un portaobjetos utilizando medios de montaje disponibles comercialmente (consulte Tabla de materiales).
    9. Cubra la arteria con un cubreobjetos evitando rodar o torcer la arteria y ponga los portaobjetos para que se sequen en un área oscura a RT durante 24 horas.
    10. Después de que el medio de montaje se seque, sellar los bordes de la cubierta con esmalte de uñas transparente, y dejar que el esmalte de uñas se seque durante 10-15 min. Almacene las diapositivas en la oscuridad a -20 oC.
    11. Equilibrar las diapositivas a RT antes de la toma de imágenes.
    12. Imagen del tejido con un microscopio de fluorescencia o un lector de fluorescencia con la excitación fijada en 340-380 nm y emisión a 385-470 nm.
      ADVERTENCIA: Fotoblanques de Filipin rápidamente; por lo tanto, las muestras tienen que ser imágenes rápidamente.

2. Enriquecimiento de ovocitos de Xenopus mediante dispersiones basadas en fosfolípidos enriquecidos con colesterol (liposomas)

  1. Preparación de soluciones
    1. Para preparar una solución de colesterol en stock, disolver 10 mg de colesterol en polvo en 1 ml de cloroformo en un vaso de vidrio de 10 ml o botella. Transfiera la solución a una botella de vidrio tapada de 1,5 ml.
      ADVERTENCIA: En vista de la toxicidad y rápida evaporación del cloroformo, trabajar en la campana y mantener los reactivos en el hielo.
    2. Preparar un tampón de 150 mM de KCl, Tris-HEPES de 10 mM, pH a 7,4 para fosfolípidos enriquecidos con colesterol. Para ello, disolver en un matraz Erlenmeyer 5.5905 g de KCl y 0.6057 g de Tris en agua de doble destilación a un volumen total de 0.5 L. En otro matraz, disolver 5.5905 g de KCl y 1.19155 g de HEPES en agua de doble destilación hasta un total de 0.5 L de volumen. Mezcle las dos soluciones en un matraz Erlenmeyer de 1 L y ajuste el pH a 7,4 con HCl.
      NOTA: Almacene la solución resultante de 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES a 4 oC.
    3. Para preparar el tampón ND96 pre-medium oocyte (bajo K+, low Ca2+), combine 1 ml de 2 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2,45,5 mL de 2 M NaCl y 5 ml de 1/1 M NaOH-HEPES en un matraz Erlenmeyer de 1 L. Añadir 900 ml de agua de doble destilación y ajustar el pH a 7.4 con HCl. Transfiera la solución a un cilindro de 1 L y lleve el volumen a 1 L con agua de doble destilación. A continuación, agregue 1,8 ml de 1 M CaCl2 y filtre la solución.
      NOTA: Las ligeras variaciones en las relaciones entre los componentes utilizados para realizar una solución ND96 no parecen ser críticas para el enriquecimiento de colesterol, posiblemente porque la solución ND96 no se utiliza durante el propio paso de enriquecimiento, sino para el almacenamiento. Un ejemplo es una solución de 1 L que tiene una concentración ligeramente menor de iones de sodio y cloruro, y se hace combinando 2 ml de 1 M KCl, 1 mL de 1 M MgCl2, 82,5 ml de 1 M NaCl, 5 ml de 1 M HEPES y 1,8 ml de 1 M CaCl2 (Ca2+ se omite para obtener una solución libre de Ca2+). Ajuste el pH de la solución a 7.4 con NaOH. Almacene la solución de cultivo de ovocitos ND96 resultante a 4 oC durante un máximo de 1 mes.
  2. Preparación de la dispersión basada en fosfolípidos con liposomas de colesterol
    1. En un tubo de vidrio de 12 ml, combine 200 ml de cada una de las siguientes soluciones de lípidos disueltos con cloroformo de 10 mg/ml: L--fosfatidiletanolamina, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serina, y colesterol.
    2. Evaporar el cloroformo en la campana para secar lentamente bajo una corriente de nitrógeno. Este paso es crítico.
    3. Suspenda los lípidos en 800 ml de solución tamponada que consista en 150 mM de KCl y 10 mM Tris-HEPES a pH a 7,4, y cúbralos con película de parafina.
    4. Sonicar suavemente a 80 kHz durante 10 min hasta que se forme una mezcla lechosa. Este paso es crítico.
      ADVERTENCIA: Al sonicar, la dispersión en el tubo de vidrio debe vibrar suavemente, formando pequeñas ondas. Las gotas de dispersión no deben estar saltando dentro del tubo.
  3. Enriquecedor de ovocitos de Xenopus con colesterol
    NOTA: Los ovarios que contienen ovocitos de rana se pueden obtener de dos fuentes: En primer lugar, las ranas hembra Xenopus laevis se pueden alojar con el propósito de la cirugía interna. Este procedimiento debe ser aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales. En segundo lugar, los ovarios enteros se pueden comprar a proveedores comerciales. Como alternativa a la compra o el aisleo de ovarios enteros y luego digerirlos como se describe en los pasos 2.3.1-2.3.4, los ovocitos individuales están disponibles comercialmente para su compra. Si se utilizan estos últimos, se pueden omitir los pasos 2.3.1-2.3.4.
    1. Mantener los ovarios recién obtenidos a 14 oC en una solución ND96. En estas condiciones, los ovarios se pueden almacenar hasta 1 semana.
    2. Para obtener ovocitos individuales, interrumpa el saco ovárico en varios lugares utilizando fórceps afilados. Coloque los trozos de ovario en una placa de 60 mm, con 5 ml de Nd96 libre de Ca2+complementado con 0,5 mg/ml de colagenasa. Agitar en un agitador orbital a 60 oscilaciones/min durante 15 min a RT.
      NOTA: Este paso asegurará la digestión del saco ovárico. Para preservar la actividad enzimática, evite almacenar la colagenasa que contenga ND96 durante largos períodos de tiempo (>1 h). Incluso el almacenamiento breve debe realizarse a temperaturas frías de menos de 15 oC.
    3. Usando una pipeta de transferencia con una punta ancha, pipetee vigorosamente la solución que contiene ovocitos hacia arriba y hacia abajo aproximadamente 5-10 veces para separar los ovocitos individuales. En este paso, la solución se oscurecerá.
    4. Enjuague rápidamente los ovocitos con Ca2+-free ND96 hasta que la solución se vuelva transparente.
    5. Transfiera ovocitos individuales a la solución ND-96 que contiene Ca2+,complementada con 2 mg/ml de gentamicina utilizando una pipeta de transferencia con punta estrecha.
      NOTA: Este paso es esencial cuando es necesario almacenar los ovocitos. Los ovocitos individuales se pueden almacenar en una incubadora durante varios días a 14-17 oC. Sin embargo, los ovocitos muertos que son blanquecinos deben eliminarse al menos una vez al día para evitar la contaminación de la solución con sustancias químicas tóxicas.
    6. Transferir 90 l de la dispersión basada en fosfolípidos enriquecidos con colesterol en un pozo de una placa de 96 pocillos.
    7. Transfiera hasta seis ovocitos del medio ND96 al pozo con el menor medio posible. Este paso es crítico.
      ADVERTENCIA: No exponga los ovocitos al aire durante la transferencia para mantener los ovocitos intactos.
    8. Coloque la placa de 96 pocillos en un rotador de plataforma tridimensional para proporcionar un pequeño movimiento orbital a los ovocitos en la célula durante 5-10 min.
    9. Agregue una gota de ND96 en el pozo, y transfiera los ovocitos enriquecidos con colesterol de la placa de pozo 96 a una placa de 35 mm con ND96 para su uso inmediato. Este paso es crítico.
    10. Utilice un kit basado en la oxidasa de colesterol disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales)para evaluar los cambios en los niveles de colesterol siguiendo las instrucciones del fabricante.

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Representative Results

El uso de ciclodextrina saturada con colesterol como un medio para enriquecer los tejidos y las células con colesterol está bien establecido. Aquí, primero demostramos la aplicación de este enfoque ampliamente utilizado para enriquecer las arterias cerebrales de ratas con colesterol usando M-CD saturado de colesterol. La Figura 1A muestra un ejemplo de una capa muscular lisa de la arteria cerebral con imágenes y demuestra el aumento dependiente de la concentración en fluorescencia asociada a la filipina obtenida tras el enriquecimiento tisular con concentraciones crecientes de colesterol que oscilan entre 6,25 m-6,25 mM para 1 h. La cuantificación correspondiente de los datos de imagen se representa en la Figura 1B. En particular, el aumento en los niveles de colesterol 2 h después del período de incubación de 1 h fue del 50% del aumento observado inmediatamente después del tratamiento con el complejo M-CD:colesterol. Como se demuestra en la Figura 1C para la muestra tratada con 0,625 mM de colesterol durante 1 h, es necesario realizar estudios funcionales utilizando los tejidos tratados tan pronto como sea posible después de que se complete el enriquecimiento de colesterol. Además, mientras que un tiempo de incubación de 1 h se utiliza comúnmente para enriquecer los tejidos y células con colesterol utilizando este enfoque, 5 min de incubación es generalmente suficiente para lograr un aumento estadísticamente significativo en el contenido de colesterol de la arteria cerebral según lo determinado por un ensayo bioquímico basado en la oxidasa de colesterol, como se muestra en la Figura 1D. El aumento en el contenido de colesterol se mantuvo en el mismo nivel cuando el tiempo de incubación se incrementó a 60 min(Figura 1D).

La eficacia de los liposomas enriquecidos con colesterol como medio para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol se demuestra en la Figura 2A-C. Si bien no se observó ningún cambio significativo en los niveles de colesterol en las dispersiones basadas en fosfolípidos de control que carecían de colesterol(Figura 2A),los niveles de colesterol aumentaron significativamente después de sólo 5 minutos de tratamiento con las dispersiones basadas en fosfolípidos que incluían colesterol, y permanecieron en el mismo nivel cuando el tiempo de incubación se incrementó a 60 min(Figura 2B). Se observó un efecto similar en dos lotes diferentes de ovocitos que se obtuvieron de dos ranas. Sin embargo, en particular, tanto los niveles iniciales de colesterol como el cambio en el contenido de colesterol variaron entre los dos lotes: en el lote 1, la concentración inicial de colesterol fue de 64 g de colesterol por mg de proteína, mientras que la concentración inicial en el lote 2 fue de 45 g de colesterol por mg de proteína, que es del 70% de los niveles iniciales de colesterol en el lote 1. Después de un tratamiento de 60 minutos, la concentración de colesterol en el lote 1 fue de 124 g de colesterol por mg de proteína, mientras que en el lote 2 fue de 67 g de colesterol por mg de proteína. Por lo tanto, mientras que la concentración de colesterol aumentó en más del 90% en el lote 1, aumentó en un 50 % en el lote 2. Sin embargo, el aumento sustancial de los niveles de colesterol en ambos lotes proporciona los medios para investigar el efecto de un aumento en los niveles de colesterol en la función de las proteínas expresadas en este sistema de expresión hetólogo. Además, el enfoque de dispersión basado en fosfolípidos para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol parece ser más eficaz que la aplicación de ciclodextrina saturada con colesterol como se hace en tejidos y células. Como se demuestra en la Figura 3, la aplicación de complejos de ciclodextrina-colesterol para enriquecer los ovocitos utilizando 5mM de ciclodextrina dio lugar a un aumento promedio de sólo el 25 % en los niveles de colesterol.

La eficacia del enfoque basado en ciclodextrina para enriquecer las células también se demuestra en las neuronas recién aisladas de la región CA1 del hipocampo(Figura 4A). Como se muestra en la Figura 4B, la incubación de las neuronas en m-CD saturado con colesterol durante 60 min dio lugar a un aumento de más de 2 veces en los niveles de colesterol según lo determinado por la fluorescencia asociada a la filipina. Usando este enfoque, probamos el efecto del aumento del colesterol en los canales GIRK expresados en las neuronas del hipocampo. Como demuestra la Figura 4C, este cambio en los niveles de colesterol dio lugar a un aumento significativo en las corrientes GIRK. Del mismo modo, probamos el efecto del enriquecimiento de colesterol en la subunidad GIRK primaria expresada en el cerebro, GIRK2, utilizando el sistema de expresión hetróloga de los ovocitos xenopus. Con este fin, sobreexpresamos el GIRK2 (GIRK2_E152D), un mutante de poros de GIRK2 que aumenta su expresión de membrana y actividad52 en los ovocitos de Xenopus, y enriquecemos los ovocitos con colesterol durante 60 minutos utilizando el enfoque de dispersión basado en fosfolípidos. Como demuestran las figuras 4D-F, el aumento en los niveles de colesterol dio lugar a un aumento significativo en las corrientes similar al efecto del aumento de los niveles de colesterol en las neuronas en la función del canal GIRK. Estos datos demuestran además la eficacia, consistencia y utilidad de los dos enfoques descritos anteriormente para determinar el impacto del aumento de los niveles de colesterol en la actividad proteica y la función celular.

Figure 1
Figura 1: Enriquecimiento representativo de las arterias cerebrales de ratas con colesterol usando metil-ciclodextrina saturada de colesterol. (A) Un ejemplo de una capa muscular lisa de la arteria cerebral con imágenes que demuestra el aumento dependiente de la concentración en fluorescencia asociada a la filipina obtenida tras el enriquecimiento tisular con concentraciones crecientes de colesterol que oscilan entre 6,25 m a 6,25 mM durante 1 h. (B) Cuantificación de los datos de imagen en (A). La medición de la intensidad de fluorescencia de toda la imagen se realizó utilizando la función "Medida" incorporada en el software comercial. En cada concentración de colesterol, se recogieron imágenes de 3 de las arterias que se cosecharon de donantes animales separados. Para cada concentración de colesterol, los datos se presentan como el error medio de la norma. (C) Niveles de colesterol en los segmentos de la capa muscular lisa de la arteria cerebral inmediatamente después de un período de incubación de 1 h con 0,625 mM de colesterol, y 3 h después del inicio del tratamiento (es decir, 1 h de incubación seguida de 2 h en PBS). (D) Dependencia de los niveles de colesterol en el tiempo de incubación según lo determinado por un ensayo bioquímico basado en la oxidasa de colesterol. Una diferencia significativa se indica con un asterisco (*p a 0,05). Los paneles (A) (concentraciones de colesterol 0 mM-0,625 mM), (B) y (C) se han modificado de Norte y otros45. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Enriquecimiento representativo de los ovocitos de Xenopus con colesterol mediante liposomas. (A) Cambio de pliegue en los niveles de colesterol de control de los ovocitos de Xenopus incubados en liposomas sin colesterol durante 5-60 min. (B) Cambio de pliegue en los niveles de colesterol de los ovocitos de Xenopus incubados en liposomas enriquecidos con colesterol durante 5-60 min. La barra de control representada se refiere a la incubación en liposomas libres de colesterol durante 5 min y se muestra como una comparación. (C) Comparación del efecto del enriquecimiento de colesterol de dos lotes diferentes de ovocitos de Xenopus utilizando liposomas enriquecidos con colesterol durante 5 y 60 min. Una diferencia significativa se indica con un asterisco (*p a 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Enriquecimiento representativo de los ovocitos de Xenopus con colesterol usando metil-o-ciclodextrina saturado de colesterol. (A) Cambio de pliegue en los niveles de colesterol de control de los ovocitos de Xenopus incubados en medios ND96 de control durante 5-60 min. (B) Cambio de pliegue en los niveles de colesterol de los ovocitos de Xenopus incubados en M-CD saturado con colesterol durante 5-60 min. La barra de control representada se refiere a la incubación en medios de control durante 5 min y se muestra como una comparación. Una diferencia significativa se indica con un asterisco (*p a 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Ejemplos representativos de estudios de enriquecimiento de colesterol sobre la función proteica en células y ovocitos de Xenopus: el impacto del colesterol en la proteína G rectificando internamente los canales de potasio. (A) Señal de fluorescencia asociada a Filipin de la neurona piramidal CA1 hipocampal de ratas en control (izquierda) frente a colesterol enriquecido (derecha). (B) Resumen de los datos de las señales de fluorescencia asociadas al filipino obtenidas a partir de neuronas piramidales CA1 de hipocampo recién aisladas y de control y enriquecidas con colesterol. El enriquecimiento del colesterol se logró incubando las neuronas en la Enfermedad saturada de colesterol durante 1 h (n x 12-14). (C) Corriente iónica (I)-tensión (V) curva que representa el efecto del enriquecimiento de colesterol como se describe en (B) en corrientes GIRK en neuronas hipocampales de la región CA1. (D) Rastros representativos que muestran el efecto del enriquecimiento del colesterol utilizando liposomas a base de fosfolípidos enriquecidos con colesterol en GIRK2 (GIRK2_E152D) expresados en ovocitos de Xenopus a -80 mV y +80 mV. (E) Resumen de datos de (D) a -80 mV (n a 6-9). Una diferencia significativa se indica con un asterisco (*p a 0,05). Las subfiguras (B-E) han sido modificadas de Bukiya et al.32. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Los métodos para enriquecer los tejidos y células de los mamíferos y los ovocitos de Xenopus con colesterol constituyen una poderosa herramienta para investigar el efecto de los niveles elevados de colesterol en especies moleculares individuales, en sistemas macromoleculares complejos (por ejemplo, proteínas), y en la función celular y de órganos. En este documento, hemos descrito dos enfoques complementarios que facilitan esos estudios. En primer lugar, describimos cómo enriquecer los tejidos y las células con colesterol usando M-CD saturado con colesterol. Demostramos que en los segmentos de las arterias cerebrales, este enfoque dio lugar a un aumento del 50% en los niveles de colesterol. Además, en un estudio reciente, mostramos que el mismo enfoque conduce a un aumento de más de 2 veces en el contenido de colesterol en las neuronas del hipocampo de la región CA1. En contraste, sin embargo, el empleo de este enfoque como un medio para enriquecer los ovocitos de Xenopus dio lugar a sólo un aumento del 25 % en el contenido de colesterol en los ovocitos de Xenopus. Por lo tanto, para enriquecer los ovocitos de Xenopus, hemos desarrollado un enfoque de dispersión basado en fosfolípidos que resulta consistentemente en al menos un aumento del 50% en los niveles de colesterol. Es posible que la ventaja de este enfoque para enriquecer los ovocitos de Xenopus se deba a una mayor capacidad de carga en comparación con la capacidad de carga del enfoque complejo M-CD:cholesterol. También es posible que mientras que el enfoque complejo M-CD:colesterol está optimizado para enriquecer tejidos y células, se requiere una mayor optimización del protocolo para mejorar su aplicación para enriquecer los ovocitos de Xenopus.

La dispersión basada en fosfolípidos utilizada para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol incluye dos lípidos que se utilizan ampliamente para crear bicapas lipídicas planas (es decir, L---fosfatidiletanolamina y 1-palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Sin embargo, en un estudio anterior, se demostró que los ovocitos de Xenopus también podrían enriquecerse usando colesterol de liposomas que incluían fosfatidilcolina y cholate36. Este método dio lugar a un aumento en la relación molar colesterol/fosfolípido en la membrana plasmática de 0,5 a 0,9 a 0,1 con un porcentaje medio de enriquecimiento del 71%. Este porcentaje medio de enriquecimiento es muy similar al nivel medio de aumento en el contenido de colesterol que observamos (-70,5%), lo que sugiere que la elección de los fosfolípidos utilizados para formar la dispersión no es crítica para enriquecer los ovocitos de Xenopus con colesterol utilizando este enfoque.

Cada protocolo descrito implica varios pasos críticos. Después de preparar una mezcla de m-CD:colesterol en una proporción molar de 8:1 para asegurar la saturación de La Enfermedad con colesterol, es fundamental cubrir el matraz con al menos dos capas de película de parafina y ponerlo en un baño de agua de 37 oC que sacude lentamente durante la noche. Al disecting tejidos para el tratamiento del colesterol es importante ser suave para asegurarse de que el tejido no se estira o se corta. Después de permeabilizar el tejido para facilitar la penetración del tinte, es fundamental lavar a fondo los segmentos de tejido en PBS. La tinción de tejido en la fillipina debe realizarse en la oscuridad, y la fillipina debe lavarse meticulosamente después de que se complete la tinción. Al preparar dispersiones a base de fosfolípidos enriquecidas con colesterol, es fundamental asegurarse de que la dispersión en el tubo de vidrio vibra suavemente, formando pequeñas ondas, para evitar la separación del colesterol de la dispersión. Para el tratamiento del colesterol de los ovocitos de Xenopus, es importante transferir los ovocitos del medio ND96 al pozo con la dispersión basada en fosfolípidos enriquecidos con colesterol con el menor medio posible sin exponer los ovocitos al aire para mantener los ovocitos intactos. Es importante tener en cuenta que debido a la maquinaria intrínseca en los tejidos, células, y los ovocitos de Xenopus, los niveles de colesterol pueden equilibrarse, y luego volver a sus niveles originales con el tiempo. En consecuencia, los estudios funcionales deben llevarse a cabo inmediatamente después del tiempo de incubación. Aquí, hemos demostrado esta noción en las arterias cerebrales enriquecidas con colesterol, mostrando que el aumento en los niveles de colesterol 2 h después de un período de incubación de 1 h fue aproximadamente la mitad del aumento observado inmediatamente después del período de incubación.

A pesar de seguir los pasos críticos descritos anteriormente, pueden surgir varios desafíos. Por ejemplo, un aumento en los niveles de colesterol no se puede observar después del tratamiento que enriquece el colesterol. Si este es el caso, puede ser necesario aumentar la concentración de colesterol en los medios que enriquecen el colesterol. Lo mismo se aplica para el enriquecimiento de colesterol de tejidos, células y ovocitos de Xenopus. Sin embargo, en la preparación de los tratamientos utilizando el enfoque complejo de La CdCd:colesterol, la cantidad de M-CD debe aumentarse con el aumento en la concentración de colesterol para mantener una relación molar de 8:1 con colesterol. Además, puede ser necesario preparar una solución fresca que enriquece el colesterol, porque el colesterol tiende a precipitarse fuera de la solución, y la solución pierde su eficiencia enriquecedora del colesterol. Después del enriquecimiento de colesterol, es posible que no se observe una señal de filipin. Si este es el caso, puede ser necesario utilizar un polvo de filipin fresco para preparar un nuevo stock y repetir el experimento. La fluorescencia filipina disminuye rápidamente, y la solución en stock no se puede almacenar durante más de varios días. Una limitación de la tinción de filipin es que parece reconocer esteroides aparte del colesterol. Por ejemplo, recientemente hemos demostrado un aumento en la señal de fluorescencia asociada a filipin en las arterias cerebrales de rata después del enriquecimiento con coprostanol45. Por lo tanto, los resultados de la tinción de filipin deben interpretarse con precaución y, en caso de duda, deben emplearse enfoques alternativos para corroborar los resultados. Una posibilidad sería realizar un ensayo bioquímico a través de la aplicación de un kit basado en oxidasa de colesterol disponible comercialmente.

En resumen, los enfoques presentados son muy eficaces para lograr el enriquecimiento de colesterol de cerca o superior al 50%. De hecho, el enfoque complejo de m-CD:colesterol que resulta en el 50 % en los niveles de colesterol en las arterias cerebrales es mucho más eficiente que el uso de LDL para enriquecer estos tejidos, lo que se traduce en un simple aumento del 10 % en el colesterol35. Lo mismo se aplica a la aplicación de dispersiones basadas en fosfolípidos enriquecidos con colesterol (liposomas) para enriquecer los ovocitos de Xenopus. Como se describió anteriormente, Este enfoque resulta consistentemente en al menos un 50% aumento en los niveles de colesterol. Es importante destacar que estos dos enfoques para el enriquecimiento de colesterol resultados de rendimiento in vitro que son comparables con el aumento de colesterol obtenido sometiendo a los animales a una dieta alta en colesterol32,37,40,53,54. Además, a diferencia de las dietas de colesterol alto de semanas de duración, los enfoques in vitro requieren solo unos minutos de tiempo de incubación para alcanzar un aumento estadísticamente significativo y estable en el nivel de colesterol.

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Disclosures

El Dr. A. M. Dopico es un empleado federal especial, a tiempo parcial, y miembro actual del Consejo Consultivo Nacional sobre Abuso de Alcohol y Alcoholismo.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por una Beca de Desarrollo Científico (11SDG5190025) de la Asociación Americana del Corazón (a A.R.-D.), y por el Instituto Nacional de Salud R01 otorga AA-023764 (a A.N.B.), y HL-104631 y R37 AA-11560 (a A.M.D.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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