Memeli Dokuları ve Kenopus Oositlerinin Kolesterol ile Zenginleşmesi

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kolesterol zenginleştirme iki yöntem sunulmaktadır: siklodekstrin memeli doku ve hücreleri zenginleştirmek için kolesterol ile doymuş uygulanması, ve kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipid tabanlı dağılımları kullanımı (lipozomlar) Xenopus oositleri zenginleştirmek için. Bu yöntemler moleküler, hücresel ve organ fonksiyonu nda yüksek kolesterol düzeylerinin etkisini belirlemek için etkilidir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Slayden, A., North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol. J. Vis. Exp. (157), e60734, doi:10.3791/60734 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Hücre fonksiyonlarını incelemek için kullanılan Xenopus oositleri de dahil olmak üzere memeli doku ve hücrelerinin kolesterol zenginleştirme, çeşitli yöntemler kullanılarak gerçekleştirilebilir. Burada bu amaçla kullanılan iki önemli yaklaşımı açıklıyoruz. İlk olarak, serebral arterler (dokular) ve hipokampal nöronlar (hücreler) kullanarak kolesterol ile doymuş siklodekstrin kullanarak kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için nasıl örnek olarak açıklayın. Bu yaklaşım, doku, hücre veya hücre hatları her türlü için kullanılabilir. Kolesterol zenginleştirme için alternatif bir yaklaşım düşük yoğunluklu lipoprotein kullanımını içerir (LDL). Bu yaklaşımın avantajı hücrenin doğal kolesterol homeostaz makine nin bir kısmını kullanmasıdır. Ancak, siklodekstrin yaklaşımı kolesterol ile ilgi herhangi bir hücre tipi zenginleştirmek için uygulanabilir ise, LDL yaklaşımı LDL reseptörlerini ifade hücreleri ile sınırlıdır (örneğin, karaciğer hücreleri, kan lökositler ve doku makrofajları gibi kemik iliği kaynaklı hücreler), ve zenginleştirme düzeyi konsantrasyon ve LDL reseptörünün hareketliliğine bağlıdır. Ayrıca, LDL parçacıkları diğer lipidler içerir, bu nedenle kolesterol iletimi nonspesifiktir. İkinci olarak, xenopus oositleri kolesterol içeren fosfolipid bazlı dağılım (yani lipozomlar) kullanarak kolesterolle nasıl zenginleştirebileceğimizi açıklıyoruz. Kenopus oositler hücre ve protein fonksiyonlarını incelemek için kullanılan popüler bir heterolog ekspresyon sistemi oluşturur. Memeli dokusunun (serebral arterlerin) siklodekstrin bazlı kolesterol zenginleştirme yaklaşımı ve Xenopus oositlerinin fosfolipid bazlı kolesterol zenginleştirme yaklaşımı için kolesterol düzeylerinin 5 dk inkübasyondan sonra maksimuma ulaştığını göstermiş oluruz. Bu kolesterol seviyesi uzun kuluçka dönemlerinde sabit kalır (örn. 60 dk). Birlikte, bu veriler dokuların kolesterol zenginleştirme için optimize edilmiş zamansal koşulları için temel sağlamak, hücreler, ve fonksiyonel çalışmalar için Ksenin oositler kolesterol zenginleştirme etkisini sorgulamayı amaçlayan.

Introduction

Kolesterol, önemli bir hücresel lipid, çok sayıda kritik fonksiyonel ve yapısal roller oynar1,2,3,4,5,6,7,8,9. Plazma zarının fiziksel özelliklerini düzenlemekten hücre canlılığını, büyümesini, çoğalmasını sağlamaya ve biyokimyasal yolların bolbir çok suni ve öncü molekül olarak hizmet, kolesterol normal hücre ve organ fonksiyonu için gerekli bir zorunlu bileşenidir. Sonuç olarak, kolesterol eksikliği ciddi fiziksel malformasyonlar ve çeşitli bozukluklar ile sonuçlanır. Öte yandan, fizyolojik düzeyleri (2-3x) üzerinde kolesterol bile küçük bir artış sitotoksik1,2,10 ve kardiyovasküler 11 dahil bozuklukların gelişimi ile ilişkiliolmuştur,12,13 ve nörodejeneratif hastalıklar14,15,16,17.11 Böylece kolesterolün kritik fonksiyonlarını sorgulamak ve kolesterol düzeylerindeki değişikliklerin etkisini belirlemek için dokularda, hücrelerde ve Kenopus oositlerinde kolesterolün içeriğini değiştiren farklı yaklaşımlar geliştirilmiştir.

Memeli doku ve hücrelerinde kolesterol düzeylerinin değiştirilmesi
Doku ve hücrelerde kolesterol düzeylerini azaltmak için çeşitli yaklaşımlar harnessed olabilir18. Bir yaklaşım kolesterol sentezi oranını kontrol HMG-CoA redüktaz inhibe etmek için lipoprotein eksikliği serum da çözünmüş statinler onların maruz içerir19,20. Ancak, Bu kolesterol düşürücü ilaçlar da mevalonat yolu boyunca non-sterol ürünlerin oluşumunu inhibe. Bu nedenle, mevalonat küçük bir miktar bu ürünlerin oluşumuna izin vermek için eklenir21 ve bu yaklaşımın özgüllüğünü artırmak. Kolesterol düzeylerini düşürmek için başka bir yaklaşım β-siklodekstrinkullanımı içerir. Bu glucopyranose monomerler steroller in boyutu eşleşen bir çapı ile bir iç hidrofobik kavite sahip22, hangi hücrelerden kolesterol çıkarılmasını kolaylaştırır, bu nedenle kendi yerli kolesterol içeriği onları tüketen23. 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD), şu anda Niemann-Pick tip C hastalığının tedavisi için test edilen bir preklinik ilaç, lizozomal kolesterol depolama ile karakterize genetik olarak kalıtsal ölümcül metabolik bozukluk24. Kolesterol tükenmesi düzeyi kullanılan özel türev bağlıdır. Örneğin, HPβCD metillenmiş türev daha düşük kapasiteli kolesterol ayıklar, metil-β-siklodekstrin (MβCD)24,25,26,27,28,29,30. Özellikle, ancak, β-siklodekstrinler de kolesterol ek olarak diğer hidrofobik molekülleri ayıklayabilir, daha sonra nonspesifik etkilere neden olabilir31. Tükenmeaksine, hücreler ve dokular özellikle kolesterol ile presaturated olmuştur β-siklodekstrin ile tedavi yoluyla kolesterol ile zenginleştirilmiş olabilir23. Bu yaklaşım kolesterol tükenmesi için kullanılan β-siklodekstrinlerin özgüllüğü için bir kontrol olarak da kullanılabilir31. Doku ve hücrelerden kolesterol ün tükenir ve hücrelerin depolanmasında kullanılan ortamda çözünmüş 30-60 dk ila 5 mM MβCD hücreleri teşhir edilerek elde edilebilir. Bu yaklaşım kolesterol içeriğinde % 50 azalmaya neden olabilir (örneğin, hipokampal nöronlarda32, sıçan serebral arterler33). Diğer taraftan, doku ve hücrelerin kolesterol zenginleştirme için β-siklodekstrin-kolesterol kompleksi hazırlanması daha karmaşıktır ve protokol bölümünde açıklanacaktır.

Kolesterol ile doymuş β-siklodekstrin kullanarak doku ve hücrelerin zenginleşmesine alternatif bir yaklaşım ldl kullanımını içerir, dokularda ifade LDL reseptörleri dayanır18. Bu yaklaşım hücrenin doğal kolesterol homeostaz makine kullanarak avantajı sunarken, çeşitli sınırlamalar vardır. İlk olarak, LDL reseptörü ifade etmez dokular ve hücreler bu yaklaşım kullanılarak zenginleştirilmiş olamaz. İkincisi, LDL parçacıkları kolesterol ek olarak diğer lipidler içerir. Özellikle LDL, ApoB100 (%25) proteininden oluşur. ve aşağıdaki lipidler (%75): ~6-8% kolesterol, ~ 45-50% kolesteril ester, ~ 18-24% fosfolipidler, ve ~ 4-8% triacylglycerols34. Bu nedenle, LDL parçacıkları ile kolesterol teslim nonspesifiktir. Üçüncü olarak, LDL reseptörünü ifade eden doku ve hücrelerde LDL ile kolesterol içeriğindeki artış yüzdesi, kolesterole doymuş siklodekstrin kullanılarak gözlenen artıştan önemli ölçüde daha düşük olabilir. Örneğin, bir önceki çalışmada, LDL yoluyla kolesterol ile kemirgen serebral arterlerin zenginleşmesi kolesterol düzeylerisadece%10-15 artış ile sonuçlandı 35 . Buna karşılık, protokol bölümünde açıklandığı gibi siklodekstrin ile doymuş siklodekstrin ile bu arterlerin zenginleşmesi kolesterol içeriğinde >%50 artışa yol açmıştır (Bkz. Temsilsonuçları bölümü, Şekil 1).

Xenopus oositlerinde kolesterol düzeylerinin değiştirilmesi
Kenopus oositler genellikle hücre ve protein fonksiyonu nu incelemek için kullanılan heterolog bir ekspresyon sistemi oluşturur. Daha önceki çalışmalar, Kenopus oositlerinde fosfolipid molar oranına kolesterol oranının 0.5 ± 0.136olduğunu göstermiştir. Kolesterol bu içsel yüksek düzeyde nedeniyle, bu sistemde kolesterol içeriğini artırmak zordur, henüz membran fosfolipidler ve kolesterol yapılan dispersiyonlar kullanılarak elde edilebilir. Bu amaçla seçtiğimiz fosfolipidler, protokol bölümünde açıklandığı gibi yapay düzlemsel lipid çift katmanlı oluşturmak için kullanılanlara benzer ve l-α-fosfatidyletanolamine (PAPA) ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine (POPS) içerir. Bu yaklaşım kolesterol içeriğinde >%50 artışa neden olabilir (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 2).

Fosfolipid bazlı dağılımlar ile Xenopus oositleri zenginleştirmek için alternatif bir yaklaşım siklodekstrin kolesterol ile doymuş kullanımını içerir, dokular ve hücrelerin zenginleştirilmiş şekilde benzer. Ancak, biz kolesterol içeriğinde ~ 25% artış ortalama ile, düşük tekrarlanabilirlik ve verimlilik olarak bu yaklaşımı bulduk. Bunun nedeni muhtemelen bu iki yaklaşımın farklı yükleme kapasitesinden kaynaklanmaktadır (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 3). Buna karşılık, Xenopus oositler kolesterol tüketmek için siklodekstrin kullanarak kolesterol içeriğinde ~ 40% azalmaya neden olabilir gösterilmiştir36.

Burada, kolesterol ile doymuş siklodekstrin uygulaması ile memeli doku ve hücrelerinin kolesterol zenginleştirme odaklanmak, ve lipozomlar kullanarak Xenopus oositler. Her iki yaklaşım da artan kolesterol düzeylerinin protein fonksiyonu üzerindeki etkisini ifade etmek için kullanılabilir. Protein fonksiyonunun kolesterol modülasyonu mekanizmaları doğrudan etkileşimleri içerebilir8 ve/veya dolaylı etkiler9. Kolesterol doğrudan etkileşimler yoluyla protein fonksiyonunu etkilediğinde, kolesterol düzeylerindeki artışın protein aktivitesi üzerindeki etkisi büyük olasılıkla hücre tipinden, ekspresyon sisteminden veya zenginleştirme yaklaşımından bağımsızdır. Örneğin, atriyal miyosit37 , hipokampal nöronlar3232,38, HEK29339 hücreleri ve Xenopus oositler32,37ifade potasyum (GIRK) kanalları nda içe doğru doğru lanse g-protein üzerindeki kolesterol etkisini belirlemek için bu iki yaklaşım kullanılmıştır. Bu çalışmalarda elde edilen sonuçlar tutarlıydı: memeli hücrelerinin her üç türünde ve amfibi oositlerde kolesterol yukarı tgüllü GIRK kanal fonksiyonunda (Bkz. Temsili Sonuçlar bölümü, Şekil 4, hipokampal nöronlar ve Xenopus oositlerinde ilgili deneyler). Ayrıca, bu çalışmalarda yapılan gözlemler de atriyal miyositler 37yapılan çalışmaların sonuçları ile tutarlı idi37 ,40 ve hipokampal nöronlar32,38 taze yüksek kolesterol diyet tabi hayvanlardan izole40. Özellikle, MβCD kullanarak hipokampal nöronların kolesterol zenginleştirme kolesterol düzeyleri ve GIRK fonksiyonu hem yüksek kolesterol diyet etkisini ele almak için kullanılan atorvastatin tedavisinin etkisini tersine38. Diğer çalışmalarda, potasyum kanalı Kir2.1'in kolesterol duyarlılığı üzerindeki etkilerini hem Xenopus oositleri hem de HEK293 hücreleri41kullanarak araştırdık. Yine mutasyonların kanalın hassasiyeti üzerindeki etkisi iki sistemde de benzerdi.

Moleküler, hücresel ve organ fonksiyonu üzerinde yüksek kolesterol düzeylerinin etkisini belirlemek için her iki zenginleştirme yöntemlerinin uygulamaları çoktur. Özellikle siklodekstrin-kolesterol komplekslerinin hücre ve dokuları zenginleştirmek için kullanılması özgüllüğü nedeniyle çok yaygındır. Bu yaklaşımın son örnekleri HERG kanal aktivasyonu ve altta yatan mekanizmalar üzerinde kolesterol etkisinin belirlenmesi içerir42, kolesterol Kirpi sinyalizasyon teşvik etmek için düzeltilmiş G protein istemli reseptör aktive keşif43, ve membran ilişkili bağlayıcı proteinler aracılığıyla kolesterol rolünün belirlenmesi44. Kendi çalışmamızda, mβCD ile memeli doku zenginleştirme kullandı: kolesterol kompleksi temel fonksiyonu ve kalsiyum farmakolojik profili üzerindeki etkisini incelemek için- ve büyük iletkenlik voltaj kapılı kanalların (BK, MaxiK) vasküler düz kas35,45,46. Diğer çalışmalarda, biz kolesterol duyarlılığı41, 47, 48 , 49 farklı bölgelerin rollerini belirlemek için kolesterol ile Xenopus oositler zenginleştirmek için fosfolipid tabanlı dağılım yaklaşımı kullanılan 41,47,48,49, yanı sıra bu kanallarda putatif kolesterol bağlayıcı siteleri belirlemek için32,50,51.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm deneysel işlemler Tennessee Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'nde (UTHSC) gerçekleştirildi. Hayvanların bakımı ve deneysel protokoller, Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği tarafından akredite edilmiş bir kurum olan UTHSC Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından gözden geçirildi ve onaylandı.

1. Kolesterol ile doymuş metil-β-siklodekstrin kullanarak doku ve hücrelerin zenginleşmesi

NOT: Aşağıdaki kolesterol zenginleştirme protokolü dokular, hücreler ve hücre hatları için uygundur. Örnek olarak, memeli serebral arterlerin zenginleştirilmesi için yapılan adımları açıklar. Hem serebral arterler (Şekil 1)hem de nöronlar için(Şekil 4)temsili sonuçlar sağlanmaktadır.

  1. Kolesterol ile doymuş MβCD hazırlanması
    1. MβCD'nin 0,064 g ağırlığında ve 5 mM MβCD'lik son konsantrasyonu elde etmek için 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi içeren bir şişede çözün. MβCD'nin tamamen çözülmediğinden emin olmak için çözeltiyi bir karıştırma çubuğuyla karıştırın.
    2. Kolesterol tozu 0.0024 g tartmak ve 0.63 mM kolesterol konsantrasyonu elde etmek için aynı şişe ekleyin. Sonra şiddetle çözüm karıştırın. Mümkün olduğunca çok sayıda kolesterol parçaları (bazı parçalar kuluçka kadar kalacak) kırmak için bir spatula kullanın.
    3. Şişeyi en az iki kat parafin filmle kaplayın ve bir gecede 37 °C'lik su banyosunda yavaşça (~30 salınım/dak) çalkalayın. Bu adım çok önemlidir.
    4. 8-16 saat sonra çözeltiyi oda sıcaklığına (RT) soğutun ve 0,22 m'lik polyethersulfone şırınga filtresinden cam şişeye süzün.
      NOT: Çözeltide farklı kolesterol konsantrasyonlarına ulaşmak için hem kolesterol hem de MβCD miktarlarını basit orantılı olarak ayarlayın. MβCD:kolesterol molar oranını 8:1'de korumak ve metil-β-siklodekstrin taşıyıcısının kolesterol ile doygunluğu elde etmek önemlidir. Kolesterol zenginleştirici çözelti, 4 °C'de depolanırsa hemen veya birkaç gün boyunca kullanılabilir. Ancak, kolesterol zenginleştirici yeteneği kolesterol agregaları görünür gibi zaman içinde azalır, ve çözüm bulutlu olur.
  2. Serebral arterlerin MβCD ile kolesterol ile dolup tetkik
    1. Bir Sprague Dawley sıçanı (250-300 g) %2 isoflurane ile bir odaya yerleştirerek ötenazi. Sonra, keskin bir giyotin veya makas büyük bir keskin çifti kullanarak anestezi sıçan decapitate.
      NOT: Bu yordamları düzenli olarak gerçekleştiriyorsanız, giyotin keskinleştirme için bir zamanlama geliştirmek yararlıdır. Ayrıca, kemirgen decapitation için ayrı bir makas ayrılmış olmalıdır. Kemirgen decapitation terminal bir prosedürdür; bu nedenle, aletleri steril olması gerekmez. Her kullanımdan sonra sabunlu su ile temizlik yeterlidir.
    2. Farenin başını öne bakacak şekilde, araştırmacıdan uzağa yerleştirin. Kafatası ve beyin sapı arasında makas orta büyüklükte bir çift sivri parçası yerleştirin ve yanal her iki tarafta kesti.
    3. Üst kafatası açık gözetlemek için motorps kullanın lateral kesikler yapıldı kafatasıtabanıüzerinde çekerek ve dikkatle beyin kaldırmak. Kafatası içinde beyin tutan optik sinirleri kesmek için emin olun.
    4. Çıkarıldıktan sonra beyni PBS ile bir kabın içine koyun.
      NOT: Beyin 4 °C'de 4-6 saat buz üzerinde saklanabilir.
    5. Steril olmayan bir ortamda, fare beynini batıracak kadar PBS'li mumlu bir diseksiyon kabına aktarın. Hareket etmesini engellemek için beyni sabitle.
      NOT: Hızlı bir şekilde yapılırsa 1.2.5 adım RT'de yapılabilir. Aksi takdirde, buz üzerinde yapılması gerekir.
    6. Keskin forsepsler ve küçük cerrahi makas serebral arterler ve RT PBS mikroskop altında beynin tabanında Willis Daire oluşturan dalları incelemek için kullanın. Bu adım çok önemlidir.
    7. Kısaca arter segmentleri durulayın (kadar 1 cm uzunluğunda) PBS ya 96 iyi plaka veya 35 mm çanak kalan kan kaldırmak için, ve sonra yeterli içine 10 dakika için yerleştirin kolesterol zenginleştirici çözüm (adım 1.1 hazırlanan) tüm arter segmentleri kapsayacak şekilde. Arterler küçükse veya kolesterol zenginleştiren çözüm sıkıntısı varsa, bol miktarda kolesterol zenginleştiren bir solüsyon ve 96 iyi plaka varsa 35 mm çanak kullanın.
      NOT: Aynı yaklaşım 60 dk kuluçka süresi kullanarak kolesterol ile diğer doku ve hücreleri zenginleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bu yaklaşım daha önce fare serebral arterlerin kolesterol zenginleştirme için kullanılmıştır35,45, hipokampal nöronlar32, atriyal miyositler37, ve HEK 293 hücreleri39. Kolesterole duyarlı bir test ile farklı zaman noktalarında kolesterol zenginleştirmenin doğrulanmasına bağlı olarak her doku veya hücre tipi için en az kuluçka süresinin belirlenmesi gerekir (örn. kolesterole duyarlı floresan boya ile boyanarak dokudaki kolesterol miktarının biyokimyasal belirlenmesi).
  3. Kolesterol düzeylerinde herhangi bir değişiklik belirlemek için steroid duyarlı floresan boya filipin ile arter dokusu leke.
    NOT: Temsili Sonuçlar bölümünde, kolesterol düzeylerindeki değişiklikleri değerlendirmek için iki yaklaşımın sonuçlarını gösteriyoruz: ticari olarak kullanılabilen kolesterol oksidaz bazlı kiti (bkz. Malzemeler Tablosu)uygulaması ve steroide duyarlı floresan boya filipin ile boyama yoluyla yapılan biyokimyasal tahkikat. İlk yaklaşım üreticinin talimatlarına uyarak gerçekleştirilebilir. İkinci yaklaşım için protokol aşağıda verilmiştir.
    1. Taze bir şişe filipin tozu kullanarak, dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mg/mL stok çözeltisi hazırlayın. Bu adım çok önemlidir.
      NOT: Ortaya çıkan çözelti ışığa duyarlıdır. Doğru hazırlanırsa, filipin stok çözeltisi sarımsıdır. Bazı filipin tozu şişe kapağına yapışabilir. Bu nedenle, filipin tüm miktarını korumak için DMSO çözücü ile şişe ve kap durulamak önemlidir. Bir kez hazırlandıktan sonra, filipin stok birkaç gün içinde kullanılmalıdır. Filipin 5 gün sonra floresan yeteneğini tamamen kaybeder, karanlıkta -20 °C'de depolandığında bile.
    2. Kolesterol zenginleştiren çözeltiden arter segmentleri çıkarın ve 5 dakika PBS ile 3x yıkayın.
    3. Buz üzerinde 15 dakika için% 4 paraformaldehit arter segmentleri düzeltin.
      DİkKAT: Paraformaldehit ışığa duyarlıdır. Bu nedenle, çalışma karanlıkta yapılmalıdır.
    4. Doku permeabilize ve boya penetrasyon kolaylaştırmak için 10 dakika boyunca RT PBS% 0.5 Triton içine arter segmentleri yerleştirin.
    5. Bir shaker üzerinde 5 dakika için PBS ile arter segmentleri 3x yıkayın. Bu adım çok önemlidir.
      NOT: Triton tamamen yıkandığında, PBS çözeltisinin yüzeyinde kabarcık olmamalıdır.
    6. PBS'deki filipin stok çözeltisini 25 g/mL'lik son konsantrasyona seyreltin. Arterler PBS çözeltisi formu çıkarın ve karanlıkta 1 saat için seyreltilmiş filipin çözeltisi yerleştirin. Bu adım çok önemlidir.
    7. Bir shaker üzerinde 5 dakika için PBS ile arter segmentleri 3x durulama tarafından filipin yıkayın. Bu adım çok önemlidir.
    8. Distile su ile kısa bir süre arter segmentleri durulayın, bir kağıt peçete ile aşırı sıvı absorbe, ve ticari olarak kullanılabilir montaj ortamı kullanarak bir slayt üzerine arterler monte (Malzeme Tablosubakınız).
    9. Arterin yuvarlanmasını veya bükülmesini önleyen bir kapak la kaplayın ve rt'de karanlık bir alanda 24 saat boyunca slaytları kurumaya ayarlayın.
    10. Montaj ortamı kurudıktan sonra, kapak lı kenarları açık ojeile kapatın ve ojeyi 10-15 dk kurumaya bırakın.
    11. Görüntülemeden önce slaytları RT'ye dengeleyin.
    12. 340-380 nm ve emisyon 385-470 nm olarak belirlenen uyarma ile bir floresan mikroskop veya floresan okuyucu ile doku görüntü.
      DİkKAT: Filipin photobleaches hızlı bir şekilde; bu nedenle, örneklerin derhal görüntülenilmesi gerekir.

2. Kolesterol le zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılımlar (lipozomlar) kullanılarak Xenopus oositlerin zenginleşmesi

  1. Çözümlerin hazırlanması
    1. Kolesterol bir stok çözüm hazırlamak için, 10 mL cam kabı veya şişe kloroform 1 mL kolesterol tozu 10 mg çözünür. Çözeltiyi 1,5 mL kapaklı cam şişeye aktarın.
      DİkKAT: Kloroformun toksisitesi ve hızlı buharlaşması göz önüne alındığında, kaputta çalışın ve reaktifleri buz üzerinde tutun.
    2. 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES, pH = 7.4 tampon kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipidler için hazırlayın. Bunun için, erlenmeyer şişesinde 5,5905 g KCl ve 0,6057 g Tris'i çift distile suda toplam 0,5 L hacimde çözün. Başka bir şişede, 5.5905 g KCl ve 1.19155 g HEPES'i çift distile suda toplam 0,5 L hacimde çözün. İki çözeltiyi 1 L Erlenmeyer şişesinde karıştırın ve pH'ı HCl ile 7.4'e ayarlayın.
      NOT: Elde edilen 150 mM KCl, 10 mM Tris-HEPES çözeltisini 4 °C'de saklayın.
    3. ND96 pre-medium oosit culturing (düşük K+, düşük Ca2+) tampon hazırlamak için, 1 mL 2 M KCl, 1 mL 1 MgCl2, 45.5 mL 2 M NaCl ve 1 L Erlenmeyer şişede 5 mL 1 M NaOH-HEPES birleştirmek. 900 mL çift distile su ekleyin ve HCl ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Çözeltiyi 1 L silindire aktarın ve hacmi çift distile suyla 1 L'ye getirin. Daha sonra 1 M CaCl2 1,8 mL ekleyin ve çözeltifiltre.
      NOT: ND96 çözeltisi yapmak için kullanılan bileşenler arasındaki oranlar arasındaki küçük değişimler kolesterol zenginleştirme için kritik görünmüyor, muhtemelen ND96 çözeltisi zenginleştirme adımı sırasında değil, depolama için kullanılır çünkü. Bir örnek, sodyum ve klorür iyonlarının biraz daha düşük konsantrasyonuna sahip 1 L çözeltisi, 1 MK'lık 2 mL, 1 mL 1 M MgCl2,1 M NaCl'nin 82,5 mL'si, 1 M N HePES'in 5 mL'si ve 1,8 mL'lik 1 M CaCl2 'nin (Ca2+ serbest çözeltielde edilmesi için atlanır) birleştirilmesiyle yapılır.2+ NaOH ile çözeltinin pH'ını 7.4'e ayarlayın. Elde edilen ND96 oosit kültür çözeltisini 4 °C'de 1 aya kadar saklayın.
  2. Kolesterol lipozomları ile fosfolipid bazlı dağılım hazırlanması
    1. 12 mL cam tüpte, aşağıdaki 10 mg/mL kloroform-çözünmüş lipid çözeltilerinin 200 μL'sini birleştirir: L-α-fosfatidyletanolamin, 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine ve kolesterolü.
    2. Bir azot akışı altında yavaşça kuruması için kaputtaki kloroformu buharlaştırın. Bu adım çok önemlidir.
    3. PH = 7.4'te 150 mM KCl ve 10 mM Tris-HEPES'ten oluşan 800 μL tamponlu çözeltideki lipitleri askıya alın ve parafin filmle kaplayın.
    4. Sütlü bir karışım oluşana kadar 10 dk boyunca 80 kHz'de hafifçe sonicate. Bu adım çok önemlidir.
      DİkKAT: Sonicating, cam tüp içinde dağılım hafifçe titreşerek küçük dalgalar oluşturan gerekir. Dağılım damlaları tüpün içinde atlamaolmamalıdır.
  3. Xenopus oositlerini kolesterolle zenginleştirme
    NOT: Kurbağa yumurtası içeren yumurtalıklar iki kaynaktan elde edilebilir: Birincisi, Xenopus laevis dişi kurbağalar kendi içi cerrahi amacıyla barındırılabilir. Bu prosedür Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmalıdır. İkinci olarak, tüm yumurtalıklar ticari tedarikçilerden satın alınabilir. Tüm yumurtalıkları satın almak veya izole etmek ve 2.3.1-2.3.4 adımlarında açıklandığı gibi sindirerek, tek tek yumurtalar ticari olarak satın alınabilir. İkincisi kullanılırsa, 2.3.1-2.3.4 adımları atlanabilir.
    1. Taze elde edilen yumurtalıkları nd96 çözeltisinde ~14 °C'de tutun. Bu şartlar altında yumurtalıklar 1 haftaya kadar saklanabilir.
    2. Bireysel yumurta elde etmek için, keskin forceps kullanarak birden fazla yerde yumurtalık kesesini bozun. Yumurtalık parçalarını 0,5 mg/mL kollajenaz ile desteklenen 5 mL Ca2+içermeyen ND96 ile 60 mm'lik bir plakaya yerleştirin. RT'de 15 dk için 60 salınım/dk'da orbital shaker çalkalayın.
      NOT: Bu adım yumurtalık kesesi sindirim sağlayacaktır. Enzimatik aktiviteyi korumak için ND96 içeren kollajenazın uzun süre saklanmasından kaçının (>1 saat). 15 °C'nin altındaki soğuk sıcaklıklarda bile kısa depolama yapılmalıdır.
    3. Geniş uçlu bir transfer pipeti kullanarak, tek tek yumurtaları ayırmak için yumurta içeren çözeltiyi yaklaşık 5-10x yukarı ve aşağı incelikle. Bu adımda, çözüm karanlık dönecek.
    4. Çözelti saydam hale gelene kadar oositleriCa+içermeyen ND96 ile hızlıca durulayın.
    5. Dar uçlu bir transfer pipeti kullanarak 2 mg/mL gentamisin ile desteklenen Ca2+içeren ND-96 çözeltisine tek tek yumurta ları aktarın.
      NOT: Yumurtaların sakedilmesi gerektiğinde bu adım esastır. Tek tek yumurtalar 14-17 °C'de birkaç gün kuvözde saklanabilir. Ancak, beyazımsı ölü oositler toksik kimyasallar ile çözeltikontaminasyon önlemek için günde en az bir kez kaldırılmalıdır.
    6. Kolesterolle zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılımların 90 μL'sini 96 kuyunun bir kuyusu içine aktarın.
    7. ND96 ortamından en fazla altı oositi mümkün olduğunca az orta ile kuyuya aktarın. Bu adım çok önemlidir.
      DİkKAT: Yumurtaları sağlam tutmak için aktarım sırasında yumurtaları havaya maruz bırakmayın.
    8. 5-10 dakika hücredeki oositler için küçük bir yörünge hareketi sağlamak için üç boyutlu bir platform rotator üzerinde 96 iyi plaka yerleştirin.
    9. Kuyuya bir damla ND96 ekleyin ve kolesterolle zenginleştirilmiş yumurtaları 96 kuyu plakasından hemen kullanım için ND96 ile 35 mm'lik bir tabağa aktarın. Bu adım çok önemlidir.
    10. Üreticinin talimatlarına uyarak kolesterol düzeylerindeki değişiklikleri değerlendirmek için ticari olarak kullanılabilen kolesterol oksidaz bazlı kiti (Bkz. Malzemeler Tablosu)kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siklodekstrin kullanımı kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için bir araç olarak kolesterol ile doymuş iyi kurulmuştur. Burada ilk olarak sıçan serebral arterlerini kolesterol ile zenginleştiren bu yaygın yaklaşımın mβCD ile kolesterol emaresini ortaya koymaktadır. Şekil 1A, görüntülenmiş serebral arter düz kas tabakasının bir örneğini gösterir ve doku zenginleştirmesiyle elde edilen ve 6,25 μM-6,25 mM arasında değişen kolesterol konsantrasyonları ile elde edilen filipin Figure 1Bilişkili floresankonsantrasyona bağlı artışı gösterir. Özellikle, 1 saat kuluçka döneminden sonra kolesterol düzeylerinde 2 saat artış MβCD:kolesterol kompleksi ile tedaviden hemen sonra gözlenen artışın ~%50'si idi. Şekil 1C'nin 1 saat boyunca 0,625 mM kolesterol ile tedavi edilen numune için gösterdiği gibi, kolesterol zenginleştirme tamamlandıktan sonra tedavi edilen dokuları kullanarak fonksiyonel çalışmaların mümkün olan en kısa sürede yapılması gerekmektedir. Ayrıca, 1 saat kuluçka süresi yaygın olarak bu yaklaşımı kullanarak kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için kullanılırken, 5 dk inkübasyon genellikle bir kolesterol oksidaz bazlı biyokimyasal test tarafından belirlenen serebral arter kolesterol içeriğinde istatistiksel olarak anlamlı bir artış elde etmek için yeterlidir, Şekil 1D'detasvir edildiği gibi . Kuluçka süresi 60 dk'ya yükseltildiğinde kolesterol içeriğindeki artış aynı seviyede kalmıştır (Şekil 1D).

Xenopus oositlerini kolesterolle zenginleştirmek için kolesterolle zenginleştirilmiş lipozomların etkinliği Şekil 2A-C'degösterilmiştir. Kontrol fosfolipid bazlı dağılımlarda kolesterol ebiğinde anlamlı bir değişiklik gözlenmezken(Şekil 2A),kolesterol içeren fosfolipid bazlı dağılımlarla tedavinin sadece 5 dk'sından sonra kolesterol düzeyleri önemli ölçüde artmış ve kuluçka süresi 60 dk'ya yükseltildiğinde aynı seviyede kalmıştır(Şekil 2B). Benzer bir etki, iki kurbağadan elde edilen iki farklı yumurta parçasında gözlenmiştir. Özellikle, ancak, kolesterol hem de ilk düzeyleri ve kolesterol içeriğindeki değişim iki parti arasında değişmektedir: toplu 1, kolesterol ilk konsantrasyonu protein mg başına kolesterol 64 μg, toplu olarak ilk konsantrasyon u ise 2 protein mg başına kolesterol 45 μg oldu, hangi toplu kolesterol ilk düzeylerinin ~ 70% 1. 60 dk'lık bir tedavinin ardından, 1. Böylece, kolesterol konsantrasyonu toplu 1 ~% 90 üzerinde artmış ise, toplu 2 ~ % 50 oranında artmıştır. Bununla birlikte, her iki toplu işlemde kolesterol düzeylerinde önemli bir artış bu heterolog ifade sisteminde ifade proteinlerin fonksiyonu üzerinde kolesterol düzeylerinde bir artış etkisini araştırmak için araç sağlar. Ayrıca, kolesterol ile Xenopus oositler zenginleştirmek için fosfolipid tabanlı dağılım yaklaşımı doku ve hücrelerde yapılan kolesterol ile doymuş siklodekstrin uygulamasından daha etkili gibi görünüyor. Şekil 3'ün gösterdiği gibi, 5mM siklodekstrin kullanarak oositleri zenginleştirmek için siklodekstrin-kolesterol komplekslerinin uygulanması kolesterol düzeylerinde ortalama ~%25'lik bir artışa yol açmıştır.

Hücreleri zenginleştirmek için siklodekstrin bazlı yaklaşımın etkinliği de hipokampusCA1 bölgesinden yeni izole nöronlarda gösterilmiştir (Şekil 4A). Şekil 4B'nin gösterdiği gibi, MβCD'deki nöronların 60 dk boyunca kolesterolle doygunluğu, filipin ilişkili floresan tarafından belirlenen kolesterol düzeylerinde 2 kat üzerinde artışa yol açmıştır. Bu yaklaşımı kullanarak hipokampal nöronlarda ifade edilen GIRK kanallarında kolesterol artışının etkisini test ettik. Şekil 4C'nin de gösterdiği gibi kolesterol düzeylerindeki bu değişim GIRK akımlarında önemli bir artışa yol açmıştır. Benzer şekilde, xenopus oositler heterolog ifade sistemi kullanarak, beyinde ifade edilen birincil GIRK alt birimi, GIRK2 üzerinde kolesterol zenginleştirme etkisini test etti. Bu amaçla, Girk2'nin xenopus oositlerinde membran ekspresyonunu ve aktivitesini52 artıran bir gözenek mutantı olan GIRK2^ (GIRK2_E152D) aşırı ifade ettik ve fosfolipid bazlı dağılım yaklaşımını kullanarak yumurtaları 60 dk kolesterolle zenginleştirdik. Şekil 4D-F'nin gösterdiği gibi, kolesterol düzeylerindeki artış, nöronların artmış kolesterol düzeylerinin GIRK kanal fonksiyonu üzerindeki etkisine benzer akımlarda önemli bir artışa yol açmıştır. Bu veriler ayrıca protein aktivitesi ve hücresel fonksiyon üzerinde artan kolesterol düzeylerinin etkisini belirlemek için yukarıda açıklanan iki yaklaşımın etkinliğini, tutarlılığını ve yarar göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1: Sıçan serebral arterlerinin kolesterol ile doymuş metil-β-siklodekstrin kullanılarak kolesterolile temsili zenginleşmesi. (A) 6.25 μM-6.25 mM arasında değişen kolesterol konsantrasyonları ile doku zenginleştirmesiyle elde edilen filipin ilişkili floresan konsantrasyona bağlı artış gösteren bir görüntülenmiş serebral arter düz kas tabakası örneği 1 h. (B) Görüntüleme verilerinin nicelleştirilmesi (A). Görüntünün tamamının floresan yoğunluğu ölçümü ticari yazılımlarda yerleşik "Ölçüm" fonksiyonu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Her kolesterol konsantrasyonunda, ≥3 görüntüleri ayrı hayvan donörlerinden hasat edildi arterler toplandı. Her kolesterol konsantrasyonu için veriler ortalama ± standart hata olarak sunulur. (C) Serebral arter düz kas tabakasında kolesterol düzeyleri 0.625 mM kolesterol ile 1 saat kuluçka döneminden hemen sonra segmentleri, ve 3 h tedavinin başlangıcından sonra (yani, kuluçka 1 saat pbs 2 h takip). (D) Kolesterol oksidaz bazlı biyokimyasal test ile belirlenen kuluçka süresine kolesterol düzeylerinin bağımlılığı. Önemli bir fark yıldız işareti (*p ≤ 0.05) ile gösterilir. Paneller (A) (kolesterol konsantrasyonları 0 mM-0.625 mM), (B), ve (C) Kuzey ve ark.45modifiye edilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Xenopus oositlerinin lipozomlar kullanılarak kolesterolle temsili zenginleşmesi. (A) Kontrol Xenopus oositler kolesterol içermeyen lipozomlar içinde 5-60 dakika kuluçka kolesterol-oositkolesterol düzeyleri kat değişimi (B) 5-60 dakika kolesterol zenginleştirilmiş lipozomlar inkübe Xenopus oositlerin kolesterol düzeylerinde kat değişimi. Tasvir kontrol çubuğu 5 dakika boyunca kolesteroliçermeyen lipozomlarda kuluçka anlamına gelir ve bir karşılaştırma olarak gösterilir. (C) 5 ve 60 dakika boyunca kolesterol zenginleştirilmiş lipozomlar kullanarak Xenopus oositler iki farklı toplu kolesterol zenginleştirme etkisinin karşılaştırılması. Önemli bir fark yıldız işareti (*p ≤ 0.05) ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Xenopus oositlerinin kolesterol ile doymuş metil-β-siklodekstrin kullanılarak kolesterolle temsili zenginleşmesi. (A) Kontrol Xenopus oositler kolesterol düzeylerinde katlama 5-60 dk. (B) Kkuskus oositlerin kolesterol düzeylerinde 5-60 dk. ( B ) Katlama katlama değişimi MβCD içinde inkübe 5-60 dk kolesterol ile doymuş. Xenopus Betimlenen kontrol çubuğu 5 dakika boyunca kontrol medyasında kuluçka anlamına gelir ve bir karşılaştırma olarak gösterilir. Önemli bir fark yıldız işareti (*p ≤ 0.05) ile gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Kolesterol zenginleştirme çalışmalarının hücrelerde ve Ksenopus oositlerinde protein fonksiyonu üzerine yapılan çalışmalara örnek: Kolesterolün G-protein üzerindeki etkisi potasyum kanallarını içe doğru durabilmektedir. (A) kontrol farelerden hipokampal CA1 piramidal nöron Filipin ilişkili floresan sinyali (sol) karşı kolesterol zenginleştirilmiş (sağ). (B) Kontrol ve kolesterol le zenginleştirilmiş taze izole hipokampal CA1 piramidal nöronlardan elde edilen filipin ilişkili floresan sinyallerinin özet verileri. Kolesterol zenginleştirme mβCD nöronlar 1 saat (n = 12-14) için kolesterol ile doymuş kuluçka ile elde edildi. ( C )(C) (I)-voltaj(V) eğrisi, CA1 bölgesindeki hipokampal nöronlarda (B)'deaçıklandığı gibi kolesterol zenginleştirmenin etkisini göstermektedir. (D) -80 mV ve +80 mV'de Xenopus oositlerinde ifade edilen GIRK2^ (GIRK2_E152D) üzerinde kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı lipozomlar kullanılarak kolesterol zenginleştirmenin etkisini gösteren temsili izler. (E)(D) 'nin -80 mV (n = 6-9) olarak özet verileri. Önemli bir fark yıldız işareti (*p ≤ 0.05) ile gösterilir. Alt figürler(B-E) Bukiya ve ark.32'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Memeli dokuları ve hücreleri ile Xenopus oositlerini kolesterolle zenginleştirme yöntemleri, yüksek kolesterol düzeylerinin bireysel moleküler türler, karmaşık makromoleküler sistemler (örneğin proteinler) ve hücresel ve organ fonksiyonu üzerindeki etkisini araştırmak için güçlü bir araçtır. Bu yazıda, bu tür çalışmaları kolaylaştıran iki tamamlayıcı yaklaşım tanımlanmıştır. İlk olarak, mβCD kolesterol ile doymuş kullanarak kolesterol ile doku ve hücreleri zenginleştirmek için nasıl açıklanmıştır. Serebral arter segmentlerinde bu yaklaşımın kolesterol düzeylerinde ~%50'lik bir artışa yol açtığını gösterdik. Ayrıca, yakın zamanda yapılan bir çalışmada, aynı yaklaşımın CA1 bölgesinden hipokampal nöronlarda kolesterol içeriğinde 2 x'in üzerinde bir artışa yol açtığını gösterdik. Buna karşılık, ancak, Xenopus oositler zenginleştirmek için bir araç olarak bu yaklaşımı n için istihdam Xenopus oositler kolesterol içeriğinde sadece ~ 25% artış sonuçlandı. Böylece, Xenopus oositleri zenginleştirmek için, sürekli kolesterol düzeylerinde en az ~ 50% artış ile sonuçlanan bir fosfolipid tabanlı dağılım yaklaşımı geliştirdik. Xenopus oositlerinin zenginleşmesi için bu yaklaşımın avantajının MβCD:kolesterol kompleksi yaklaşımının yükleme kapasitesine kıyasla gelişmiş yükleme kapasitesinden kaynaklanması mümkündür. MβCD:kolesterol kompleksi yaklaşımı doku ve hücreleri zenginleştirmek için optimize edilirken, Xenopus oositlerini zenginleştirmek için uygulamanın iyileştirilmesi için protokolün daha fazla optimizasyonu yapılması da mümkündür.

Kolesterol ile Xenopus oositleri zenginleştirmek için kullanılan fosfolipid bazlı dağılım yaygın düzlemsel lipid iki kat oluşturmak için kullanılan iki lipid içerir (yani, L-α-fosfatidyletanolamine ve 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-l-serine). Ancak, daha önceki bir çalışmada, Bu Xenopus oositler de fosfatidilkolin ve kolat36dahil lipozomlar kolesterol kullanılarak zenginleştirilmiş olabilir gösterilmiştir . Bu yöntem plazma zarındaki kolesterol/fosfolipid molar oranının 0,5 ± 0,1'den 0,9 ± 0,1'e yükselmesine ve ortalama zenginleştirme yüzdesinin %71'e yükselmesine neden oldu. Bu ortalama zenginleştirme yüzdesi, gözlemlediğimiz kolesterol içeriğindeki ortalama artış seviyesine çok benzer (~%70.5), bu yaklaşımı kullanarak Xenopus oositlerini kolesterolle zenginleştirmek için kullanılan fosfolipidlerin seçiminin kritik olmadığını düşündürmektedir.

Açıklanan her protokol birkaç kritik adım içerir. MβCD:kolesterol karışımını 8:1 molar oranında hazırladıktan sonra, MβCD'nin kolesterolle doygunluğu ndan emin olmak için, şişeyi en az iki kat parafin filmle kaplayıp bir gecede yavaşça sallayarak 37 °C su banyosuna koymak önemlidir. Kolesterol tedavisi için dokuları diseksiyon ederken doku gerilmiş veya kesilmiş olmadığından emin olmak için nazik olmak önemlidir. Boya penetrasyonunu kolaylaştırmak için dokuyu permeabilize ettikten sonra PBS'deki doku segmentlerinin iyice yıkanması çok önemlidir. Fillipin doku boyama karanlıkta yapılmalıdır ve dolgu işlemi tamamlandıktan sonra titizlikle yıkanmalıdır. Kolesterolle zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılımları hazırlarken, kolesterolün dağılmasından kaçınmak için cam tüpteki dağılmanın hafifçe titreşerek küçük dalgalar oluşturarak titreşmesini sağlamak önemlidir. Xenopus oositlerinin kolesterol tedavisi için, oositleri sağlam tutmak için yumurtaları havaya maruz bırakmadan, kolesterolle zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılımla ND96 ortamından kuyuya yumurtaların aktarılması önemlidir. Dokular, hücreler ve Kenopus oositlerdeki içsel makineler nedeniyle kolesterol düzeylerinin dengede kalıp zamanla orijinal seviyelerine geri dönebileceğini unutmamak önemlidir. Sonuç olarak, kuluçka süresinden hemen sonra fonksiyonel çalışmaların yapılması gerekmektedir. Burada kolesterol le zenginleştirilmiş serebral arterlerde bu düşünceyi gösterdik, 1 saat kuluçka döneminden sonra kolesterol düzeylerinde 2 saat artış, kuluçka döneminden hemen sonra gözlenen artışın yaklaşık yarısı olduğunu gösterdik.

Yukarıda açıklanan kritik adımları takip rağmen, çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. Örneğin, kolesterol zenginleştirici tedavi sonrasında kolesterol düzeylerinde bir artış gözlenmeyebilir. Bu durumda, kolesterol zenginleştiren ortamda kolesterol konsantrasyonu artırmak için gerekli olabilir. Aynı dokuların kolesterol zenginleştirme için de geçerlidir, hücreler, ve Xenopus oositler. Ancak, MβCD:kolesterol kompleksi yaklaşımı kullanılarak tedavilerin hazırlanmasında, kolesterol ile 8:1 molar oranını korumak için kolesterol konsantrasyonunun artması ile MβCD miktarı artırılmalıdır. Ayrıca, taze kolesterol zenginleştirici bir çözüm hazırlamak için gerekli olabilir, kolesterol çözeltinin dışında çökelti eğilimindedir çünkü, ve çözüm kolesterol zenginleştirici verimliliğini kaybeder. Kolesterol zenginleştirme sonrasında filipin sinyali gözlenmemesi mümkündür. Bu durumda, yeni bir stok hazırlamak ve deneyi tekrarlamak için taze filipin tozu kullanmak gerekebilir. Filipin floresan hızla azalır ve stok çözüm birkaç günden fazla saklanamaz. Filipin boyama bir sınırlama kolesterol dışında steroidler tanımak gibi görünüyor olmasıdır. Örneğin, son zamanlarda koprostanol ile zenginleştirme sonrasında sıçan serebral arterlerde filipin ilişkili floresan sinyali bir artış göstermiştir45. Bu nedenle, filipin boyama sonuçları dikkatle yorumlanmalıdır, ve şüphe olduğunda, sonuçları doğrulamak için alternatif yaklaşımlar kullanılmalıdır. Bir olasılık ticari olarak kullanılabilir kolesterol oksidaz bazlı kiti uygulaması yoluyla bir biyokimyasal test yapmak olacaktır.

Özetle, sunulan yaklaşımlar yakın veya% 50'yi aşan kolesterol zenginleştirme elde çok etkilidir. Nitekim, MβCD: serebral arterlerde kolesterol düzeylerinde ~ 50% sonuçları kolesterol kompleksi yaklaşım çok daha verimli ldl kullanarak bu dokuları zenginleştirmek için, hangi kolesterol sadece ~ 10% artış ile sonuçlanır35. Aynı xenopus oositler zenginleştirmek için kolesterol zenginleştirilmiş fosfolipid bazlı dağılımları (lipozomlar) uygulaması için de geçerlidir. Yukarıda açıklandığı gibi, bu yaklaşım sürekli kolesterol düzeylerinde en az% 50 artış ile sonuçlanır. Daha da önemlisi, yüksek,kolesterol diyet32,37,,40,53,54hayvanları maruz kalarak elde edilen kolesterol artışı ile karşılaştırılabilir in vitro verim sonuçları kolesterol zenginleştirme için bu iki yaklaşım . Ayrıca, hafta süren yüksek kolesterol diyetler aksine, in vitro yaklaşımlar kolesterol düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı ve istikrarlı bir artış ulaşmak için kuluçka süresi sadece birkaç dakika gerektirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. A. M. Dopico özel, yarı zamanlı, federal bir çalışan ve Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Ulusal Danışma Konseyi'nin şu anki üyesidir.

Acknowledgments

Bu çalışma, Amerikan Kalp Birliği'nden (A.R.-D.)'den (A.R.-D.)'ye ve National Institute of Health R01 tarafından (A.N.B.'ye) ve HL-104631 ve R37 AA-11560'a (A.M.D.'ye) bir Bilim Adamı Geliştirme Hibesi (11SDG5190025) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Invitrogen A12216
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific 23225
Pre-Diluted Protein Assay Standards BSA set Thermo Scientific 23208
Brain PE 25Mg in Chloroform Avanti Lipids 840022C
16:0-18:1 PS 25Mg Chloroform Avanti Lipids 840034C
Cholesterol 100Mg Powder Sigma C8667
KCl Fisher P217
Trizma base Sigma T6066
HEPES Corning 61-034-RO
MgCl2 Fisher M33
NaCl Fisher S271
KH2PO4 Fisher P285
MgSO4 EMD Chemicals MX0070-1
EDTA VWR E177
Dextrose Anhydrous Fisher BP350
NaHCO3 Sigma S6014
CaCl2 Sigma C3881
Blood Gas Tank nexAir
NaOH Fisher S318
1.5mL tubes Fisher S35818
Gastight Syringe 100uL Hamilton 1710
Microliter Syringe 25uL Hamilton 702
12 mL heavy duty conical centrifuge beaded rim tube Pyrex 8120-12
Chloroform Fisher C298
Support Stand Homescience Tools CE-STAN5X8
Universal Clamp, 3-Prong Homescience Tools CE-CLPUNIV
Sonicator Laboratory Supplies G112SP1G
3D rotator mixer Benchmark Scientific B3D 1308
96 well plate Sigma BR781602
N2 gas nexAir
Glass beakers 40ml-1L Fisher 02-540
Ice Machine Scotsman CU1526MA-1
Ice bucket Fisher 50-136-7764
1X PBS Corning 21-031-CM
TritonX Fisher BP151-100
Sonic Dismembrator Fisher Model 100
Eppendorf microcentrifuge Eppendorf Model 5417R
Amber bottles Fisher 03-251-420
Corning™ Disposable Glass Pasteur Pipets FIsher 13-678-4A
Parafilm FIsher 50-998-944
Isotemp™ BOD Refrigerated Incubator FIsher 97-990E
Oocytes Xenoocyte™ 10005
Rat Envigo Sprague Dawley weight 250g
Methyl-β-cyclodextrin Sigma C4555
Water bath incubator with shaker Precision 51221080 Lowest shaker setting O/N 37 °C
Filipin Sigma SAE0088-1ML
DMSO Fisher BP231
Paraformaldehyde 4% Mallinckrodt 2621
DI H2O University DI source
ProLong Gold antifade reagnet Invitrogen P10144
Microslides 75x25mm Frosted Diagger G15978A
Forceps Fine Science Tools 11255-20
Microscope Coverslip Diagger G15972B
Clear nail polish Revlon 771 Clear
Labeling Tape Fisher 15-901-20F
Securline Lab Marker II Sigma Z648205-5EA
BD 10mL Syringe Fisher 14-823-16E
1.2 μm syringe filter VWR 28150-958
KimWipes Fisher 06-666A
pH probe Sartorus py-p112s
pH meter Denver instrument Model 225
70% ETOH Pharmco 211USP/NF
Timer Fisher 02-261-840
Steno book Staples 163485

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Yeagle, P. L. Cholesterol and the cell membrane. Biochimica et Biophysica Acta. 822, 267-287 (1985).
  2. Yeagle, P. L. Modulation of membrane function by cholesterol. Biochimie. 73, 1303-1310 (1991).
  3. Gimpl, G., Burger, K., Fahrenholz, F. Cholesterol as modulator of receptor function. Biochemistry. 36, 10959-10974 (1997).
  4. Maxfield, F. R., van Meer, G. Cholesterol, the central lipid of mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology. 22, 422-429 (2010).
  5. Goluszko, P., Nowicki, B. Membrane cholesterol: a crucial molecule affecting interactions of microbial pathogens with mammalian cells. Infection and Immunity. 73, 7791-7796 (2005).
  6. Ramprasad, O. G., et al. Changes in cholesterol levels in the plasma membrane modulate cell signaling and regulate cell adhesion and migration on fibronectin. Cell Motility and Cytoskeleton. 64, 199-216 (2007).
  7. Rosenhouse-Dantsker, A., Mehta, D., Levitan, I. Regulation of Ion Channels by Membrane Lipids. Comprehensive Physiology. 2, 31-68 (2012).
  8. Direct mechanisms in cholesterol modulation of protein function. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1135 (2019).
  9. Cholesterol modulation of protein function: sterol specificity and indirect mechanisms. Advances in Experimental Medicine and Biology. Rosenhouse-Dantsker, A., Bukiya, A. N. Springer Nature. Switzerland. 1115 (2019).
  10. Kellner-Weibel, G., Geng, Y. J., Rothblat, G. H. Cytotoxic cholesterol is generated by the hydrolysis of cytoplasmic cholesteryl ester and transported to the plasma membrane. Atherosclerosis. 146, 309-319 (1999).
  11. Kruth, H. S. Lipoprotein cholesterol and atherosclerosis. Current Molecular Medicine. 1, 633-653 (2001).
  12. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. The New England Journal of Medicine. 340, 115-126 (1999).
  13. Steinberg, D. Atherogenesis in perspective: hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime. Nature Medicine. 8, 1211-1217 (2002).
  14. Ho, Y. S., Poon, D. C. H., Chan, T. F., Chang, R. C. C. From small to big molecules: How do we prevent and delay the progression of age- related neurodegeneration? Current Pharmaceutical Design. 18, 15-26 (2012).
  15. Stefani, M., Liguri, G. Cholesterol in Alzheimer's disease: Unresolved questions. Current Alzheimer Research. 6, 15-29 (2009).
  16. Ong, W. Y., Halliwell, B. Iron, atherosclerosis, and neurodegeneration: A key role for cholesterol in promoting iron-dependent oxidative damage? Annals of the New York Academy of Sciences. 1012, 51-64 (2004).
  17. Igoumenou, A., Ebmeier, K. P. Diagnosing and managing vascular dementia. Practitioner. 256, 13-16 (2012).
  18. Luu, W., Gelissen, I. C., Brown, A. J. Manipulating Cholesterol Status Within Cells. Methods in Molecular Biology. 1583, 41-52 (2017).
  19. Egom, E. E. A., Hafeez, H. Biochemistry of statins. Advances in Clinical Chemistry. 73, 127-168 (2016).
  20. Igel, M., Sudhop, T., von Bergmann, K. Pharmacology of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase inhibitors (statins), including rosuvastatin and pitavastatin. Journal of Clinical Pharmacology. 42, 835-845 (2002).
  21. Nakanishi, M., Goldstein, J. L., Brown, M. S. Multivalent control of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase. Mevalonate-derived product inhibits translation of mRNA and accelerates degradation of enzyme. The Journal of Biological Chemistry. 263, 8929-8937 (1988).
  22. López, C. A., de Vries, A. H., Marrink, S. J. Molecular Mechanism of Cyclodextrin Mediated Cholesterol Extraction. PLoS Computational Biology. 7, e1002020 (2011).
  23. Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C., Rothblat, G. H. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. Journal of Lipid Research. 38, 2264-2272 (1997).
  24. Dai, S., et al. Methyl-β-cyclodextrin restores impaired autophagy flux in Niemann-Pick C1-deficient cells through activation of AMPK. Autophagy. 13, 1435-1451 (2017).
  25. Chen, F. W., Li, C., Ioannou, Y. A. Cyclodextrin induces calcium- dependent lysosomal exocytosis. PLoS One. 5, e15054 (2010).
  26. Soga, M., et al. HPGCD outperforms HPBCD as a potential treatment for Niemann-Pick disease type C during disease modeling with iPS cells. Stem Cells. 33, 1075-1088 (2015).
  27. Maetzel, D., et al. Genetic and chemical correction of cholesterol accumulation and impaired autophagy in hepatic and neural cells derived from Niemann-Pick Type C patient-specific iPS cells. Stem Cell Reports. 2, 866-880 (2014).
  28. Sarkar, S., et al. Impaired autophagy in the lipid-storage disorder Niemann-Pick type C1 dis- ease. Cell Reports. 5, 1302-1315 (2013).
  29. Rosenbaum, A. I., Zhang, G., Warren, J. D., Maxfield, F. R. Endocytosis of beta-cyclodextrins is responsible for cholesterol reduction in Niemann-Pick type C mutant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 5477-5482 (2010).
  30. Yu, D., et al. Niemann-Pick Disease Type C: Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neuronal Cells for Modeling Neural Disease and Evaluating Drug Efficacy. Journal of Biomolecular Screening. 19, 1164-1173 (2014).
  31. Zidovetzki, R., Levitan, I. Use of cyclodextrins to manipulate plasma membrane cholesterol content: evidence, misconceptions and control strategies. Biochimica et Biophysica Acta. 1768, 1311-1324 (2007).
  32. Bukiya, A. N., Durdagi, S., Noskov, S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol up-regulates neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium (GIRK) channel activity in the hippocampus. The Journal of Biological Chemistry. 292, 6135-6147 (2017).
  33. Bukiya, A. N., Vaithianathan, T., Kuntamallappanavar, G., Asuncion-Chin, M., Dopico, A. M. Smooth muscle cholesterol enables BK β1 subunit-mediated channel inhibition and subsequent vasoconstriction evoked by alcohol. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 31, 2410-2423 (2011).
  34. Hegele, R. A. Plasma lipoproteins: genetic influences and clinical implications. Nature Reviews Genetics. 10, 109-121 (2009).
  35. Bisen, S., et al. Distinct mechanisms underlying cholesterol protection against alcohol-induced BK channel inhibition and resulting vasoconstriction. Biochimica et Biophysica Acta. 1861, 1756-1766 (2016).
  36. Santiago, J., et al. Probing the Effects of Membrane Cholesterol in the Torpedo californica Acetylcholine Receptor and the Novel Lipid-exposed Mutation αC418W in Xenopus Oocytes. The Journal of Biological Chemistry. 276, 46523-46532 (2001).
  37. Deng, W., et al. Hypercholesterolemia induces up-regulation of KACh cardiac currents via a mechanism independent of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate and Gβγ. The Journal of Biological Chemistry. 287, 4925-4935 (2012).
  38. Bukiya, A. N., Blank, P. S., Rosenhouse-Dantsker, A. Cholesterol intake and statin use regulate neuronal G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Journal of Lipid Research. 60, 19-29 (2019).
  39. Bukiya, A. N., et al. Cholesterol increases the open probability of cardiac KACh currents. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1848, 2406-2413 (2015).
  40. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Hypercholesterolemia effect on potassium channels. Hypercholesterolemia. Kumar, S. A. Intech. 95-119 (2015).
  41. Rosenhouse-Dantsker, A., et al. Distant cytosolic residues mediate a two-way molecular switch that controls the modulation of Kir channels by cholesterol and PI(4,5)P2. The Journal of Biological Chemistry. 287, 40266-40278 (2012).
  42. Chun, Y. S., Oh, H. G., Park, M. K., Cho, H., Chung, S. Cholesterol regulates HERG K+ channel activation by increasing phospholipase C β1 expression. Channels. 7, 275-287 (2013).
  43. Luchetti, G., et al. Cholesterol activates the G-protein coupled receptor Smoothened to promote Hedgehog signaling. eLife. 5, e20304 (2016).
  44. Sun, S., et al. Cholesterol-dependent modulation of stem cell biomechanics: application to adipogenesis. Journal of Biomechanical Engineering. In Press (2019).
  45. North, K., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Tyrosine 450 in the Voltage- and Calcium-Gated Potassium Channel of Large Conductance Channel Pore-Forming (slo1) Subunit Mediates Cholesterol Protection against Alcohol-Induced Constriction of Cerebral Arteries. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 367, 234-244 (2018).
  46. Bukiya, A. N., Dopico, A. M. Regulation of BK Channel Activity by Cholesterol and Its Derivatives. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1115, 53-75 (2019).
  47. Rosenhouse-Dantsker, A., Leal-Pinto, E., Logothetis, D. E., Levitan, I. Comparative analysis of cholesterol sensitivity of Kir channels: role of the CD loop. Channels. 4, 63-66 (2010).
  48. Rosenhouse-Dantsker, A., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol Sensitivity of Kir2.1 is controlled by a belt of residues around the cytosolic pore. Biophysical Journal. 100, 381-389 (2011).
  49. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S. Y., Logothetis, D. E., Levitan, I. Cholesterol sensitivity of Kir2.1 depends on functional inter-links between the N and C termini. Channels. 7, 303-312 (2013).
  50. Rosenhouse-Dantsker, A., Noskov, S., Durdagi, S., Logothetis, D. E., Levitan, I. Identification of novel cholesterol-binding regions in Kir2 channels. The Journal of Biological Chemistry. 288, 31154-31164 (2013).
  51. Bukiya, A. N., Rosenhouse-Dantsker, A. Synergistic activation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels by cholesterol and PI(4,5)P2. Biochimica et Biophysica Acta Biomembranes. 1859, 1233-1241 (2017).
  52. Yi, A., Lin, Y. F., Jan, Y. N., Jan, L. Y. Yeast screen for constitutively active mutant G protein-activated potassium channels. Neuron. 29, 657-667 (2001).
  53. Bukiya, A., Dopico, A. M., Leffler, C. W., Fedinec, A. Dietary cholesterol protects against alcohol-induced cerebral artery constriction. Alcoholism, Clinical and Experimental Research. 38, 1216-1226 (2014).
  54. Simakova, M. N., Bisen, S., Dopico, A. M., Bukiya, A. N. Statin therapy exacerbates alcohol-induced constriction of cerebral arteries via modulation of ethanol-induced BK channel inhibition in vascular smooth muscle. Biochemical Pharmacology. 145, 81-93 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics