العدلة عزل بروتوكول

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

العدلات هي من بين الخلايا الأولى للوصول في موقع رد الفعل المناعي للالتهابات ، وخضعت للدراسة وظائفها وآليات على نطاق واسع في المختبر. نظهر متدرجة الكثافة الطريقة المعيارية الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام وسائل الإعلام فصل متاحة تجاريا.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

المحببة النوى العدلة (PMN) هي الكريات البيض الأكثر وفرة في البشر وبين الخلايا الأولى للوصول في موقع رد الفعل المناعي للالتهابات. نظرا لدورها الرئيسي في الالتهاب ، وتدرس على نطاق واسع وظائف العدلات مثل الحركة والإنتاج خلوى ، البلعمة ، ومكافحة الأورام الخلية. لتوصيف وظائف محددة من العدلات ، وهي طريقة نظيفة وسريعة وموثوقة للفصل بينها وبين غيرها من خلايا الدم غير المرغوب فيه في الدراسات المختبرية ، وخصوصا العدلات قصيرة الأمد ويجب استخدامها خلال 2-4 ساعات من جمعها. هنا ، علينا أن نظهر متدرجة الكثافة الطريقة المعيارية الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام وسائل الإعلام المتاحة تجاريا الانفصال التي هي مزيج من الصوديوم وmetrizoate ديكستران 500. الإجراء يتكون من طبقات الدم كله على مدى الانحدار متوسطة الكثافة ، الطرد المركزي ، والفصل بين طبقة العدلة ، وتحلل من الكريات الحمراء المتبقية. ثم يتم غسل الخلايا ، وعدها ، ومعلق في المخزن الى التركيز المطلوب. عندما يقوم بشكل صحيح ، وقد تبين هذا الأسلوب لعينات من محصول> العدلات 95 ٪ مع بقاء> 95 ٪.

Protocol

العدلة عزل بروتوكول

  1. جمع كل الكواشف إلى درجة حرارة الغرفة.
  2. جمع 5.0 مل من وسائل الإعلام في عزلة العدلة أنبوب الطرد المركزي. مل بعناية 5.0 طبقة من الدم على وسائل الإعلام الانفصال. تنفيذ هذه الخطوة ببطء وبعناية ، ومع طرف ماصة على مقربة من سطح وسائل الإعلام إلى تجنب الاختلاط الدم ووسائل الإعلام.
  3. الطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي ل500 35 دقيقة في 20-25 درجة مئوية. ينبغي للفصل الدم إلى 6 فرق متميزة : البلازما ، وحيدات ، ووسائل الإعلام العزلة ، والعدلات ، وسائل الاعلام مزيدا من العزلة ، وخلايا الدم الحمراء بيليه (الشكل 1). إذا كانت هذه العصابات ليست واضحة ، كانت عملية الفصل ليست نظيفة وستكون هناك حاجة لتكرارها.
  4. إزالة بعناية أكبر ثلاث طبقات (البلازما ، وحيدات ، ووسائل الإعلام العزلة) باستخدام ماصة. التخلص من هذه الطبقات.
  5. ماصة بعناية طبقة من العدلات وجميع وسائل الإعلام عزلة تحت العدلات. وضع الحل في أنبوب الطرد المركزي نظيفة.
  6. تمييع الحل العدلة إلى 10 مل مع HBSS دون كا 2 + / + 2 ملغ. عكس الأنبوب عدة مرات لوقف الخلايا.
  7. الحل العدلة الطرد المركزي في 350 RCF لمدة 10 دقائق. وينبغي أن يكون حاضرا بيليه حمراء في أسفل الأنبوب ، وتحتوي على العدلات المتبقية خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء). إزالة طاف مع ماصة بعناية بحيث لا بالانزعاج بيليه.
  8. لكرات الدم الحمراء وليز المتبقية ، إضافة 2 مل تحلل الخلايا الحمراء العازلة للأنبوب. لresuspend ، وبيليه دوامة القارورة في وضع 3-4. تجنب زيادة الإعداد دوامة 4 أعلاه ، لأن هذا قد يؤدي إلى تفعيل العدلات. قد يكون من الضروري دوامة لعدة ثوان ، أو إلى "نبض" الدوامة حل لبيليه.
  9. أنبوب الطرد المركزي في 250 RCF لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع ماصة. كرر العملية lysing إذا لزم الأمر.
  10. إضافة 500 HBSS ميكرولتر دون كا 2 + / + 2 ملغ لكل أنبوب. مرة أخرى ، إلى دوامة resuspend الكرية في وضع 3-4. مخفف الى 10 مل مع HBSS دون كا 2 + / + 2 ملغ.
  11. أنابيب الطرد المركزي في 250 RCF لمدة 5 دقائق. نضح في وطاف تجاهل.
  12. Resuspend وبيليه في 250 HBSS ميكرولتر / الحل HSA (2 ٪ HSA). ثم الخلايا قد تحسب وتعديلها لتركيز المطلوب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يتم استخدام أسلوب التدرج كثافة الفصل لعزل العدلات الإنسان من الدم الكامل باستخدام مزيج من الصوديوم وmetrizoate ديكستران 500. ويستند هذا الأسلوب على طريقة فصل الكريات البيضاء وحيدة النواة التي Boyum (1968) الذي تم تعديله من قبل لفصل العدلة فيرانتي وثونغ (1980).

بعد جمعها من المانحين ، قد يكون anticoagulated الدم الكامل مع EDTA ، سيترات ، أو الهيبارين. نظرا لأنها لم تدم طويلا ، يجب استخدام العدلات ضمن 2-4 ساعات من جمعها. الإجراء يتكون من طبقات الدم كله على مدى الانحدار متوسطة الكثافة ، الطرد المركزي ، والفصل بين طبقة العدلة ، وتحلل من الكريات الحمراء المتبقية. ثم يتم غسل الخلايا ، وعدها ، ومعلق على التركيز المطلوب.

إذا الفرق الستة هي لا تختلف بعد خطوة الطرد المركزي الأول ، لم تكن عملية الانفصال النظيف وسوف تحتاج إلى أن يتكرر. لفصل نظيفة ، وتأكد من أن وسائل الإعلام لم تنته العزلة أو ملوثة. قد تكون أيضا فصل ناجحة إذا المتبرعين بالدم قد استهلك الكحول أو الأدوية في الساعات ال 72 السابقة لجمع الدم.

لمنع تفعيل العدلات أثناء إجراء الانفصال ، فمن الأفضل استخدام HBSS دون CA2 + / + Mg2 ، وقد ثبت منذ الأيونات إلى خلايا الوزراء. وينبغي أيضا إعادة تعليق من الكريات يتم تنفيذ ببطء ، ويجب أن تبقى في دوامة إعدادات تنشيط المنخفضة إلى منتصف نطاق الخلايا بحيث لا يصبح.

عندما يقوم بشكل صحيح ، وقد تبين هذا الأسلوب لعينات من محصول> العدلات 95 ٪ مع بقاء> 95 ٪. ويمكن تقييم الجدوى التي النقاء ووصفها مع الخلايا العدلة CD66b علامة معينة واستبعاد التريبان صبغة زرقاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة HL56621 R01.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics