Isolamento de neutrófilos Protocolo

Biology

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Summary

Neutrófilos estão entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória, e suas funções e mecanismos têm sido estudadas extensivamente in vitro. Demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos do sangue total usando a mídia de separação disponíveis comercialmente.

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Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil Isolation Protocol. J. Vis. Exp. (17), e745, doi:10.3791/745 (2008).

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Abstract

Neutrófilos granulócitos polimorfonucleares (PMN) são os leucócitos mais abundantes nos seres humanos e entre as primeiras células a chegar ao local da resposta imune inflamatória. Devido ao seu papel fundamental na inflamação, as funções de neutrófilos, como locomoção, produção de citocinas, fagocitose e combate de células tumorais são amplamente estudados. Para caracterizar as funções específicas de neutrófilos, um método limpo, rápido e confiável de separá-los de outras células sanguíneas é desejável para os estudos in vitro, especialmente desde que os neutrófilos têm vida curta e deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. Aqui, nós demonstramos um nível de densidade gradiente método de separação para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando a mídia separação comercialmente disponível que é uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspenso em tampão de concentração desejada. Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%.

Protocol

Isolamento de neutrófilos Protocolo

  1. Trazer todos os reagentes à temperatura ambiente.
  2. Coletar 5,0 ml de meios de isolamento de neutrófilos no tubo de centrifugação. Cuidadosamente camada de 5,0 ml de sangue sobre a mídia separação. Realizar esta etapa lenta e cuidadosamente, e com a ponta da pipeta perto da superfície da mídia para evitar a mistura do sangue e da mídia.
  3. Centrifugar a 500 RCF por 35 min a 20-25 ° C. O sangue deve separar em 6 bandas distintas: plasma, monócitos, meios de isolamento, neutrófilos, media mais de isolamento, e os glóbulos vermelhos pellet (Figura 1). Se essas bandas não são claras, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido.
  4. Remova cuidadosamente os três camadas (plasma, monócitos e meios de isolamento), utilizando uma pipeta. Elimine essas camadas.
  5. Pipeta com cuidado a camada de neutrófilos e de todos os meios de isolamento sob o neutrófilos. Coloque a solução em um tubo de ensaio limpo.
  6. Diluir a solução de neutrófilos para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg 2 + Ca 2. Inverter o tubo várias vezes para suspender as células.
  7. Centrifugar a solução de neutrófilos em 350 RCF por 10 minutos. A pelota vermelha deve estar presente no fundo do tubo, contendo neutrófilos e residual glóbulos vermelhos (hemácias). Remover o sobrenadante com uma pipeta com cuidado para que a pelota não é perturbado.
  8. Para lisar as hemácias residual, adicionar 2 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos no tubo. Para ressuspender o sedimento, vortex do frasco com um ajuste de 3-4. Evitar o aumento da configuração vórtice acima de 4, já que isso pode causar o neutrófilos para ativar. Pode ser necessário vortex por alguns segundos, ou a "pulso" do vórtice para dissolver o sedimento.
  9. Centrifugar o tubo a 250 rcf durante 5 min. Remover o sobrenadante com uma pipeta. Repita o processo de lise, se necessário.
  10. Adicionar 500 mL HBSS sem Ca 2 + / Mg 2 + para cada tubo. Mais uma vez, vórtice para ressuspender o sedimento em uma configuração de 3-4. Diluir para 10 ml com HBSS sem + / ​​Mg 2 + Ca 2.
  11. Centrifugar os tubos a 250 rcf durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e descartar.
  12. Ressuspender o sedimento em 250 mL HBSS / Solução HSA (2% HSA). Células podem então ser contados e ajustados a concentração desejada.

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Discussion

A densidade método de separação de gradiente é usado para isolar neutrófilos humanos a partir de sangue total utilizando uma mistura de sódio metrizoate e Dextran 500. Este método é baseado no método de separação de leucócitos mononucleares por Boyum (1968) que foi modificado para a separação de neutrófilos por Ferrante e Thong (1980).

Após a coleta de um doador, o sangue total pode ser anticoagulados com EDTA, citrato ou heparina. Uma vez que eles são de curta duração, os neutrófilos deve ser usado dentro de 2-4 horas após a coleta. O procedimento consiste de camadas de sangue toda a médio gradiente de densidade, a centrifugação, a separação da camada de neutrófilos, e lise de eritrócitos residual. Células são então lavados, contados, e ressuspendidas a concentração desejada.

Se as seis bandas não são distintos após a primeira etapa de centrifugação, o processo de separação não foi limpa e terá de ser repetido. Para a separação limpa, certifique-se que a meios de isolamento não tenha expirado ou contaminados. Separação também pode ser vencida se o doador de sangue tem consumido álcool ou medicamentos nas 72 horas anteriores à coleta de sangue.

Para evitar a ativação de neutrófilos durante o processo de separação, o melhor é usar HBSS sem Ca2 + / Mg2 +, uma vez que os íons têm sido mostrados para células prime. Ressuspensão de pellets também deve ser realizada lentamente, e as configurações de vórtices deve ser mantido na baixa a mid-range para que as células não são ativadas.

Quando realizada corretamente, este método tem se mostrado a ceder amostras de neutrófilos> 95% com> viabilidade de 95%. Pureza e viabilidade pode ser avaliada pela rotulagem as células com neutrófilos específicos marcador CD66b e exclusão de corante azul de tripano.

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Acknowledgments

Financiamento do NIH R01 HL56621.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Poly(R) Reagent Cedarlane Labs PolymorphprepTM can be used as an alternative
Hank’s Balanced Salt Solution without Calcium Chloride Reagent Invitrogen
Human Serum Albumin Reagent ZLB Bioplasma
Red Cell Lysis Buffer Reagent Roche Group
Centrifuge Tool
Vortexer Tool
Pasteur Pipettes and bulb Tool
PolymorphprepTM Reagent Axis-Shield Alternative reagent to Lymphocyte-Poly (R)
Syringe Filter Other EMD Millipore SLGV033RS Millex-GV, 0.22 μm, PVDF, 33 mm, gamma-sterilizable
Hank’s Balance Salt Solution with Calcium Chloride Reagent Invitrogen

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References

  1. Boyum, A. Separation of leucocytes from blood and bone marrow. Scand. J. Clin. Invest. 21, Suppl 97. 77-83 (1968).
  2. England, J. M., Rowan, R. M. The assignment of values to fresh blood used for calibrating automated blood cell counters. Clin. Lab. Haemat. 10, 203-212 (1988).
  3. Garcia, A. Comparison of two leukocyte extraction methods for cytomegalovirus antigenemia assay. J. Clin. Microbiol. 34, 182-184 (1996).
  4. Ferrante, A., Thong, Y. H. Optimal conditions for simultaneous purification of mononuclear and polymorphonuclear leucocytes from human peripheral blood by the Ficoll-Hypaque method. J. Immunol. Methods. 36, 109-109 (1980).

Comments

21 Comments

  1. what is the rational for using whole blood instead of purified white blood cells or enriched neutrophils for NBT test???

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 28, 2008 - 12:37 PM
  2. Why must HSA and not BSA be used? Do you have references for the effect of ETOH and drugs on separation success, and mechanism of action?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 29, 2008 - 11:21 AM
  3. BSA can activate neutrophils. Brian Siano, on behalf of Hana Oh and Scott Diamond

    Reply
    Posted by: Brian S.
    October 29, 2008 - 11:43 AM
  4. How many HBSS and how many HSA need for HBSS/HSA solution preparation?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    January 21, 2009 - 2:50 PM
  5. hi, why do you use HSA? or what is the action of HSA in buffer?  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 10, 2009 - 3:14 AM
  6. so many things contradict in the movie vs your text

    Reply
    Posted by: Laura K.
    December 4, 2009 - 4:00 PM
  7. From JoVE editor: video and text are complementary parts of each video-article. They are not necessarily 100% the same. There are things that are better described in video than in text, and vice versa. I think in this case the video part is very comprehensive and provides a very clear demonstration on how to do the experiment.

    Reply
    Posted by: Moshe P.
    December 7, 2009 - 3:22 PM
  8. Are there any other reasons why one will not get 6 bands of separation using Polymorphprep? My separation is still not perfect. Repeatign causes the monocyte layer to lower towards the neutrophils. Any suggestions? Donor blood is not affected as mentioned in your video.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2010 - 11:28 PM
  9. Any suggestions of modify this protocol so that it will work with NHP blood?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 14, 2011 - 6:36 PM
  10. Why is ²% HSA added in the last step? What is the advantage of doing that? And what happens is I dont add it?

    Reply
    Posted by: Alex B.
    July 6, 2011 - 3:59 AM
  11. DŒs HBBS for HBBS/HSA preparation contain Ca AND Mg or only Ca?

    Reply
    Posted by: Marija P.
    November 3, 2011 - 3:20 PM
  12. I believe the question above refers to the last step of resuspension of neutrophils. At this point you could use various types of buffer solutions that suite your specific experimental goals. If trying to create a suspension of neutrophils in a physiological saline buffer, both Ca and Mg can be added.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 3, 2011 - 3:27 PM
  13. I notice that the HBSS contains no phenol red in your neutrophil isolation method. I have noticed that phenol red is avoided (both during isolation and during experiments) in a number of papers implementing neutrophil isolation techniques. Any idea what phenol red dŒs to neutrophils? I have used a variation on the isolation technique (generously shared by Drs. Oh, Siano and Diamond) and ended by suspending my isolated neutrophils in RPMI with phenol red. Although phenol red might not be the (only) culprit, I am not seeing any neutrophil killing activity (ADCC assay).
    I plan to attempt the method provided in this video later this week. Any ideas about phenol red?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 9:58 AM
  14. We avoid pH indicator dyes because they often cause autofluorescence and lead to high background in fluorescent assays. We don't have any direct measurements of fluorescent dyes on neutrophil function.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    March 19, 2012 - 10:10 AM
  15. I have seen that during neutrophil isolation from my blood there is no layer of neutrophils while there is a thick band of ruptured RBC at that position,every time.Can anyone suggest me,what could be the reason for that?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2012 - 4:25 AM
  16. I'm getting the same result every time. Did you ever find out what's causing a thick band of RBC at the position of neutrophils bands?

    Reply
    Posted by: Zahra M.
    February 17, 2014 - 12:23 PM
  17. I have been in face of the same problem that part of RBC can not sediment to the bottom band. This almost happpens when centrifuging at 500RCF but hardly happen at 450 RCF. So I guess 500 RCF is inappropriate.

    Reply
    Posted by: Xu L.
    May 25, 2017 - 3:50 AM
  18. Is this protocol applicable to Dog and Rat Neutrophil isolation? If so, do I still use HSA?

    Reply
    Posted by: Vishnu U.
    June 27, 2012 - 3:04 PM
  19. I have a similar question. I am interested in using this protocol to isolate neutrophils from mouse whole blood. Did you ever find out if this protocol works for rat neutrophil isolation?

    Reply
    Posted by: Hanna M.
    January 29, 2014 - 1:59 PM
  20. Hi. It is said in the article that the neutrophil yield would be 2x10^6 per ml. Does that mean 2x10^6 per ml of whole blood used? So using 5 ml of blood (as used in the article) would yield 10 million neutrophils?
    I got an extremely low count for my neutrophils. about 2 million from 5ml blood. Can you please help me troubleshoot?
    Also, why did you mention 10-15ml blood (yielding x10^8 cells) in the beginning? Is it that you carry out the isolation from 10-15 ml blood in 2 or 3 parts of 5 ml each? Please help.
    Thanks.

    Reply
    Posted by: Sumana B.
    September 25, 2014 - 3:17 PM
  21. I a following this protocol, but running into clumping of the cells. Is there any way to prevent this from happening?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    August 9, 2017 - 9:52 PM

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