جعل التصحيح ، وماصات أقطاب شارب مع بولير برمجة

Published 10/08/2008
6 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

هذا الفيديو يوضح كيفية استخدام مجتذب برمجة لجعل ماصات التصحيح والأقطاب الكهربية حادة ل. ويمكن استخدام نفس الإجراء لتقديم مجموعة متنوعة من الأدوات الزجاجية ، بما في ذلك إبر الحقن.

Cite this Article

Copy Citation

L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

وقد microelectrodes الزجاج (وتسمى أيضا الماصات) في العمود الفقري لالكهربية على مدى عقود. اليوم ، يتم إجراء من هذا القبيل من الشعيرات الدموية الماصات الزجاج باستخدام مجتذب برمجة. هذه الصكوك الحرارة الشعرية إما باستخدام خيوط معدنية أو الليزر واستخلاص الزجاج باستخدام الجاذبية ، والسيارات أو كليهما. يتم تشكيل لماصات التصحيح ، المشبك تسجيل استخدام الحرارة فقط ، والجاذبية ، بينما الأقطاب حادة لتسجيل الخلايا استخدام مزيج من الحرارة والجاذبية ، والحركية ملف. الإجراء التي استخدمت لصنع الخلايا الماصة تسجيل مماثلة لتلك التي استخدمت لصنع إبر الحقن لمجموعة متنوعة من التطبيقات ، بما فيها الحقن في كرنا القيطم البويضات. في الزجاج ، ويستخدم عامة الشعرية <1.2 مم في القطر لجعل ماصات لتسجيل المشبك التصحيح ، بينما يستخدم لتسجيل أضيق الزجاج داخل الخلايا (القطر الخارجي = 1.0 ملم). لكل أداة ، هو برمجة مجتذب مختلف قليلا. هذا الفيديو يبين كيفية جعل كلا النوعين من ماصات تسجيل مجتذب باستخدام برامج محددة مسبقا.

Protocol

سحب ماصات

باستخدام microelectrode مجتذب مثل سوتر P - 97 يلهب / براون ، سحب مجموعة من حوالي 10-20 الماصات.

  1. حدد الزجاج الخاص الشعرية. نستخدم البورسليكات الشعيرات الدموية (سوتر BF150 - 110 - 10 ، القطر الخارجي 1.5mm ، 1.1mm قطرها الداخلي ، 10cm طويلة). مخزن الزجاج بعناية بحيث يبقى نظيفا والغبار الحرة.
  2. تصميم برنامج الانسحاب. نستخدم برنامج الخطوة 5 ، مع الحرارة وسرعة التنازلي في كل خطوة ، وسحب صغيرة على الخطوة النهائية. سوتر في ماصة كتاب طبخ مرجعا ممتازا لتطوير برامج مناسبة.
  3. دراسة نصائح ماصة تحت المجهر لتحديد قطرها الافتتاح وسلاسة. تجاهل الخام ، نصائح متفاوتا ، أو غير منتظمة. وينبغي أن يكون بروتوكول جيدة ضمان سحب هذه نادرة. لتسجيل التصحيح ، المشبك القياسية ، يجب أن تكون فتحات غيض 1-3 ميكرون في القطر. وتفتق الحاد (كليلة غيض) يؤدي إلى انخفاض المقاومة لفتح القطر نفسه. يمكن تعديل شكل وحجم الضغوط التي التلميع.

ماصات النار تلميع

  1. اقامة منصة تلميع (microforge) مع خيوط البلاتين التدفئة التي يسيطر عليها دواسة القدم. وهناك عدة مفيدة يتوفر من العلم ALA (CPM - 2) يمكن تجميعها أو جهاز مماثل مجزأة.
  2. اختياري : معطف ماصة مع عازل لتخفيض السعة وتحسين خصائص الضوضاء. نحن نستخدم الشمع الأسنان. Sylgard 184 ™ (بولي ميثيل siloxane الاستومر المعروف أيضا باسم PDMS) هو أيضا خيار.
  3. إذا باستخدام الشمع ، والحفاظ على كميات صغيرة المنصهر في مكان قريب. مع الضغط الجوي على الجزء الخلفي من ماصة للحفاظ على الشمع من دخول ماصة ، وتراجع لفترة وجيزة تلميح إلى الشمع السائل وإزالته. مع Sylgard وتخزين الاستومر أعد في aliquots المجمدة والطلاء غيض ماصة تحت المجهر. الحرارة لعلاج الاستومر.
  4. ضع ماصة (مغلفة أو لا) في جهاز تلميع وتقديم نصيحة ~ 50 ميكرون من خيوط. نضع في اعتبارنا أن خيوط سوف توسع عند تسخينها.
  5. وأوصت : اتبع بروتوكول منفصل عن "تلميع الضغط" لتغيير شكل ماصة للمقاومة الأمثل وقطر الحافة.
  6. نبضة قصيرة الحرارة (1-2 ثوان) كافية لإزالة الشمع من غيض من ماصة وناعمة الزجاج.
  7. ضع ماصة الانتهاء في صندوق مغلق للحماية من الغبار ، وكرر لمدة 10 ماصات ناجحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويوضح البروتوكول هو هنا في الاستخدام اليومي في المختبرات الكهربية وتستخدم أيضا لصنع إبر الحقن للخلايا والحيوانات. مع مجتذب برمجة ، فمن السهل أن تجعل ماصات لمجموعة متنوعة من الاستخدامات. مع الاهتمام والرعاية ، فإن خيوط مجتذب الخاص على الماضي لمدة سنة واحدة أو أكثر. حظا سعيدا مع التجارب الخاصة بك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

نشكر وكالات التمويل والمؤسسات التالية للحصول على الدعم : المعاهد القومية للصحة ، المؤسسة الوطنية للعلوم ، الجمعية الأمريكية للقلب ، الضمور العضلي جمعية ، ودونالد وباء ديليا E. مؤسسة باكستر ، وصندوق الوقف وKlingenstein ماكنايت علم الأعصاب.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Video Stats