Faire patch pipettes et électrodes Sharp avec un extracteur programmable

Published 10/08/2008
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Biology

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Summary

Cette vidéo montre comment utiliser un tire-programmables pour les pipettes de patch et électrodes pointu pour l'électrophysiologie. La même procédure peut être utilisée pour faire une variété d'outils de verre, y compris les aiguilles d'injection.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

Microélectrodes de verre (aussi appelé pipettes) ont été un cheval de bataille de l'électrophysiologie pendant des décennies. Aujourd'hui, ces pipettes sont fabriqués à partir de capillaires en verre à l'aide d'un tire-programmables. Ces instruments de la chaleur du capillaire en utilisant soit un filament métallique ou d'un laser et d'en tirer le verre en utilisant la gravité, un moteur ou les deux. Pipettes pour patch-clamp sont formées en utilisant la chaleur et ne la gravité, tandis que des électrodes pour l'enregistrement intracellulaire forte d'utiliser une combinaison de la chaleur, la pesanteur, et un moteur. La procédure utilisée pour faire des pipettes d'enregistrement intracellulaire est semblable à celui utilisé pour faire des aiguilles d'injection pour une variété d'applications, y compris l'injection dans des ovocytes de Xenopus ARNc. En général, capillaire en verre <1,2 mm de diamètre est utilisé pour faire des pipettes pour l'enregistrement de patch-clamp, tandis que plus étroit de verre est utilisé pour l'enregistrement intracellulaire (diamètre extérieur = 1,0 mm). Pour chaque outil, l'extracteur est programmé de façon légèrement différente. Cette vidéo montre comment faire les deux types de pipettes d'enregistrement en utilisant des programmes pré-établis extracteur.

Protocol

Pipettes de traction

En utilisant une microélectrode extracteur comme le Sutter P-97 Flaming / Brown, tirer un ensemble d'environ 10-20 pipettes.

  1. Sélectionnez votre verre capillaire. Nous utilisons borosilicate capillaires (Sutter BF150-110-10, 1,5 mm de diamètre extérieur, diamètre intérieur de 1.1mm, 10cm de long). Conservez le verre avec soin afin qu'il reste propre et sans poussière.
  2. Concevoir un programme de traction. Nous utilisons un programme en 5 étapes, avec la chaleur et la vitesse de descente à chaque étape, et une traction sur la petite la dernière étape. Livre de Sutter pipette est une excellente référence pour l'élaboration de programmes appropriés.
  3. Examiner les embouts de pipette sous un microscope pour déterminer le diamètre d'ouverture et de douceur. Jeter rugueux, inégaux des conseils, ou irrégulière. Un bon protocole tirant devrait s'assurer qu'ils sont rares. Pour la norme patch-clamp, les ouvertures de pointe doit être microns 1-3 dans diamètre. Un cône fort (émoussé la pointe) entraîne une diminution de résistance pour le diamètre même ouverture. La forme et la taille peut être modifiée par le polissage de pression.

Pipettes de polissage au feu

  1. Mettre en place une plate-forme de polissage (microforge) avec un filament de chauffage de platine contrôlés par une pédale. Un kit utile est disponible à partir ALA scientifique (CPM-2) ou un appareil similaire peut être assemblé au coup par coup.
  2. En option: Manteau de la pipette avec un isolant pour diminuer la capacité et améliorer les caractéristiques de bruit. Nous utilisons de la cire dentaire. Sylgard 184 ™ (poly-diméthyl siloxane élastomère également connu comme PDMS) est également une option.
  3. Si vous utilisez de la cire, garder une petite réserve fondue à proximité. Avec une pression d'air sur le dos de la pipette pour garder la cire d'entrer dans la pipette, tremper brièvement pointe dans la cire liquide et à enlever. Avec Sylgard, stocker élastomère préparé en aliquots congelés et peindre la pointe de la pipette sous un microscope. Chauffer pour guérir l'élastomère.
  4. Placez la pipette (couché ou non) dans l'appareil de polissage et de mettre le bout ~ 50 microns à partir du filament. Gardez à l'esprit que le filament se développer lorsqu'il est chauffé.
  5. Recommandé: Suivez le protocole distinct pour "polir la pression" pour changer la forme de la pipette pour une résistance optimale et diamètre de la pointe.
  6. Une brève impulsion de chaleur (1-2 secondes) est suffisant pour enlever la cire de la pointe de la pipette et lisse du verre.
  7. Placez la pipette fini dans une boîte fermée à l'abri de la poussière, répétez l'opération pour 10 pipettes de succès.

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Discussion

Le protocole est illustré ici, dans une utilisation quotidienne dans les laboratoires d'électrophysiologie et est également utilisé pour faire des aiguilles d'injection pour les cellules et les animaux. Avec un extracteur programmables, il est facile de faire des pipettes pour une variété d'utilisations. Avec une attention et des soins, le filament sur votre extracteur va durer un an ou plus. Bonne chance avec vos expériences.

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Acknowledgements

Nous remercions les organismes de financement et fondations suivantes pour le soutien: National Institutes of Health, National Science Foundation, l'American Heart Association, la Muscular Dystrophy Association, le B. Donald E. Baxter et Delia Fondation, le Fonds de dotation et les Klingenstein McKnight for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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