Machen Patch-Pipetten und Sharp Elektroden mit einem programmierbaren Puller

Published 10/08/2008
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Biology

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Summary

Dieses Video zeigt, wie eine programmierbare Abzieher verwenden, um Patch-Pipetten und scharfen Elektroden für die Elektrophysiologie zu machen. Das gleiche Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Glas-Tools, einschließlich Injektionsnadeln zu machen.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

Glas-Mikroelektroden (auch als Pipetten) haben ein Arbeitspferd der Elektrophysiologie seit Jahrzehnten. Heute sind solche Pipetten von Glaskapillaren erfolgt über eine programmierbare Abzieher. Solche Instrumente Wärme der Kapillare entweder mit einem Metallfaden oder einem Laser und zeichnen sich aus dem Glas mit der Schwerkraft, einen Motor oder beides. Pipetten für Patch-Clamp-Aufzeichnung werden unter Verwendung nur Hitze und Schwerkraft, während scharfe Elektroden für die intrazelluläre Aufnahme verwenden eine Kombination von Wärme, Schwerkraft und einem Motor. Das Verfahren zur intrazellulären Aufnahme Pipetten machen, ist ähnlich, die zur Injektionsnadeln für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich cRNA Injektion in Xenopus Oozyten zu machen. Im Allgemeinen, Kapillar-Glas <1,2 mm im Durchmesser wird verwendet, um Pipetten für Patch-Clamp-Aufnahme zu machen, während engeren Glas für die intrazelluläre Aufnahme (Außendurchmesser = 1,0 mm) verwendet wird. Für jedes Werkzeug ist der Abzieher programmiert etwas anders. Dieses Video zeigt, wie man beide Arten von Aufnahmen Pipetten mit vorher festgelegten puller Programme machen.

Protocol

Pulling Pipetten

Mit einer Mikroelektrode puller wie Sutter P-97 Flaming / Brown, ziehen eine Reihe von etwa 10-20 Pipetten.

  1. Wählen Sie Ihre Kapillare aus Glas. Wir verwenden Borosilikat Kapillaren (Sutter BF150-110 bis 10 mm, 1,5 mm Außendurchmesser, 1,1 mm Innendurchmesser, 10 cm lang). Bewahren Sie das Glas vorsichtig damit es sauber und staubfrei bleibt.
  2. Entwerfen Sie ein Ziehen Programm. Wir verwenden einen 5-Schritte-Programm, mit absteigender Hitze und Geschwindigkeit bei jedem Schritt, und ein kleiner Zug auf den letzten Schritt. Sutter ist Pipette Kochbuch ist eine hervorragende Referenz für die Entwicklung geeigneter Programme.
  3. Untersuchen Sie die Pipettenspitzen unter dem Mikroskop auf Öffnungsdurchmesser und Glätte zu bestimmen. Discard rau, uneben oder unregelmäßig Tipps. Ein guter Zug-Protokoll sollten dafür sorgen, diese sind selten. Für Standard-Patch-Clamp-Aufzeichnung, sollte Bahnöffnungen 1-3 Mikrometer im Durchmesser sein. Ein Steilkegel (stumpfe Spitze) führt zu Widerstand für den gleichen Öffnungsdurchmesser geringer. Form und Größe können durch Druck Polieren modifiziert werden.

Feuerpolieren Pipetten

  1. Richten Sie ein Polieren rig (microforge) mit einem Platin-Heizdraht durch ein Fußpedal gesteuert. Ein nützliches Kit ist ab ALA Scientific (CPM-2) oder eine ähnliche Vorrichtung kann stückweise zusammengesetzt werden.
  2. Optional: Bestreichen Sie die Pipette mit einem Isolator, um die Kapazität zu verringern und verbessern das Geräuschverhalten. Wir verwenden Dentalwachs. Sylgard 184 ™ (Poly-dimethyl Siloxanelastomer auch als PDMS) ist auch eine Option.
  3. Bei der Verwendung von Wachs, halten einen kleinen geschmolzenen Versorgung in der Nähe. Mit Luftdruck auf der Rückseite der Pipette auf Wachs von der Eingabe der Pipette zu halten, tauchen die Spitze kurz in das flüssige Wachs und zu entfernen. Mit Sylgard, speichern vorbereitet Elastomer in gefrorenen Aliquots und malen Sie die Pipettenspitze unter dem Mikroskop. Wärme an das Elastomer zu heilen.
  4. Platzieren Sie die Pipette (beschichtet oder nicht) in der Poliervorrichtung und bringen die Spitze ~ 50 Mikron aus dem Filament. Denken Sie daran, dass der Faden dehnt sich bei Erwärmung.
  5. Empfohlen: Folgen Sie der separaten Protokoll für "pressure polishing", um die Form der Pipette für optimale Festigkeit und Spitzendurchmesser ändern.
  6. Eine kurze Hitze-Impuls (1-2 Sekunden) ist ausreichend, um Wachs, das aus der Spitze der Pipette abnehmen und glatte Glas.
  7. Legen Sie die fertigen Pipette in einem geschlossenen Kasten, um vor Staub zu schützen, wiederholen Sie für 10 erfolgreiche Pipetten.

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Discussion

Das Protokoll dargestellt ist hier im täglichen Einsatz in der Elektrophysiologie Labor und wird auch zur Injektionsnadeln für Zellen und Tieren zu machen. Mit einer programmierbaren Abzieher, ist es leicht, Pipetten für eine Vielzahl von Anwendungen zu machen. Mit Aufmerksamkeit und Pflege, wird das Filament auf Ihren Abzieher für ein Jahr oder länger dauern. Viel Glück mit Ihrer Experimente.

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Acknowledgements

Wir danken folgenden Förderorganisationen und Stiftungen für die Unterstützung: National Institutes of Health, National Science Foundation, der American Heart Association, Gesellschaft für Muskeldystrophie, die Donald B. und Delia E. Baxter-Stiftung, die Klingenstein Fonds und der McKnight Endowment for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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