Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Published 10/08/2008
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Biology

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Summary

Questo video mostra come utilizzare un estrattore programmabile per rendere pipette cerotto e gli elettrodi taglienti per elettrofisiologia. La stessa procedura può essere usato per fare una varietà di strumenti in vetro, tra cui aghi da iniezione.

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L. Brown, A., E. Johnson, B., B. Goodman, M. Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller. J. Vis. Exp. (20), e939, doi:10.3791/939 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

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Abstract

Microelettrodi di vetro (chiamato anche pipette) sono state un cavallo di lavoro di elettrofisiologia per decenni. Oggi, pipette quali sono realizzati in vetro capillari con un estrattore programmabile. Tali strumenti di calore il capillare utilizzando un filamento di metallo o di un laser e tirare fuori il vetro con la gravità, un motore o entrambi. Pipette per il patch-clamp registrazione si formano con il calore e solo la gravità, mentre gli elettrodi taglienti per la registrazione intracellulare utilizzare una combinazione di calore, la gravità, e un motore. La procedura utilizzata per rendere pipette di registrazione intracellulare è simile a quello usato per fare aghi da iniezione per una varietà di applicazioni, tra cui l'iniezione cRNA in ovociti di Xenopus. In generale, capillare di vetro <1,2 mm di diametro è usato per fare pipette per la registrazione di patch clamp, mentre la stretta di vetro è utilizzato per la registrazione intracellulare (diametro esterno = 1,0 mm). Per ogni strumento, l'estrattore è programmato in modo leggermente diverso. Questo video mostra come fare entrambi i tipi di pipette di registrazione con programmi prestabiliti estrattore.

Protocol

Pipette tirando

Utilizzando un microelettrodo estrattore come il P-97 Sutter Flaming / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette.

  1. Selezionare il capillare di vetro. Noi usiamo borosilicato capillari (Sutter BF150-110-10, 1,5 millimetri di diametro esterno, diametro interno 1,1 millimetri, 10cm di lunghezza). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere.
  2. Progettare un programma di trazione. Usiamo un programma STEP 5, con il calore discendente e velocità ad ogni passo, e un divano piccolo il passo finale. Ricettario pipetta Sutter è un riferimento eccellente per lo sviluppo di programmi adatti.
  3. Esaminare i puntali al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Un protocollo dovrebbe garantire una buona trazione questi sono rari. Per standard di patch-clamp registrazione, aperture punta dovrebbe essere del diametro di 1-3 micron. Un cono ripido (punta smussata) porta ad una minore resistenza per il diametro dell'apertura stessa. Forma e dimensioni possono essere modificate con la lucidatura di pressione.

Fuoco lucidatura pipette

  1. Impostare un impianto di lucidatura (microforge) con un filamento di platino riscaldamento controllato da un pedale. Un kit utile è disponibile da ALA scientifico (CPM-2) o di un apparecchio simile può essere assemblato pezzo per pezzo.
  2. Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante per ridurre capacità e migliorare le caratteristiche del rumore. Noi usiamo per impronte dentarie. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil silossani elastomero noto anche come PDMS) è anche un'opzione.
  3. Se si utilizza la cera, tenere una piccola scorta fuso nelle vicinanze. Con la pressione dell'aria sul retro della pipetta per mantenere cera di entrare nella pipetta, immergere brevemente punta nella cera liquida e rimuovere. Con Sylgard, elastomeri negozio preparato in aliquote e congelati dipingere la punta della pipetta al microscopio. Di calore per curare l'elastomero.
  4. Posizionare la pipetta (patinata o meno) l'apparato lucidatura e portare la punta ~ 50 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato.
  5. Consigliato: Seguire il protocollo separato per "lucidare pressione" per cambiare la forma della pipetta per la resistenza ottimale e diametro della punta.
  6. Un impulso di calore breve (1-2 secondi) è sufficiente a rimuovere la cera dalla punta della pipetta e liscia del vetro.
  7. Posizionare la pipetta finito in una scatola chiusa per proteggere dalla polvere, ripetere per 10 pipette di successo.

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Discussion

Il protocollo è illustrato qui di uso quotidiano nei laboratori di elettrofisiologia ed è anche usato per fare aghi da iniezione di cellule e animali. Con un estrattore programmabile, è facile fare pipette per una varietà di usi. Con attenzione e cura, il filamento sul vostro estrattore durerà per un anno o più. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

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Acknowledgements

Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Micropipette Puller Instrument Sutter Instrument Co. P-97 Or similar instrument (e.g. Sutter P-87 or P-2000)
Glass Capillaries Reagent Sutter Instrument Co. BF150-86-10 Or, similar capillary glass. To make filling the pipette easier, use a capillary with a glass filament.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. Sutter Instrument. http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf (2008).

Comments

6 Comments

  1. This video is just misleading any new students that pulling patch pipetts are that simple. In reality, without knowing how to program the puller, how to choose right filaments-box or other types, how to instal and allign the filament..............pipette pulling is really incomplete story. To all students who will watch this video, I encourage to start with cook book and choose right cappilary tubes for your application. Don't take the words for granted that 1-3 micron tip is good for patching. Also, you don't have to always fire polish the capillary. Readymade fire polish capillary are available as well.  

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 1:19 AM
  2. Dear Austin L. Brown, Brandon E. Johnson, Miriam B. Goodman, Department of Molecular and Cellular Physiology, Stanford University Thanks for demonstrating the art of pulling and making patch type pipettes. Five things to note: 1) When patching cultured cells, it is best to use BF150-86-10 as you demonstrate in the video. You can use a one line program that loops 4-5 times and it is best to use a midpoint velocity (instructions found on page ²6 in the cookbook) to have a stable and reliable program. If for some reason the tip size or resistance is not exactly as you need, you can then write the program out into a 4 or 5 line program and adjust the heat or velocity on the last line to better control the tip morphology. I personally would not create a program with gradually descending heats and velocities as this seems a bit labor intensive and maybe confusing. It could also introduce some variability. But, if it works, stick with it. There are many roads leading to the same point (so to speak), and as long as your program is stable, you will have a high yield of usable pipettes. ²) When pulling patch pipettes for slice or whole tissue, it is best to use thin walled glass BF150-110-10 and a one line program that loops two times instead of 4-5. This will provide a slightly longer  taper and a more gradual approach to the tip. This more gradual taper is best for inserting the pipette through multiple cell/tissue layers as it reduces damage to the tissue. 3) Always run a ramp test when writing a new program or using a program/puller you are not familiar with. When using a box filament (which is best to generate short tapers and high cone angles), it is best to use the ramp value for the heat setting. When using a trough filament (which generates longer tapers) it is best to use ramp+10 or ramp+15 for your heat setting. 4) The NEW P-1000 pipette puller (which is being shown at the Neuroscience meeting in December ²008 in DC) has a Cookbook feature on the touch screen menu where you can search for and install a cookbook program. Starting programs can be found by designating the filament type, glass size, and application. It will then produce a program with which to get started....so there is less guess work! It also has a "Safe Heat Mode" which will reduce the incidence of burning out the filament. 5) When pulling sharp pipettes, you can go to the General Look Up Tables at the end of the Cookbook. Here you will find Type, A, B, C, D, and E programs. I recommend starting with a Type A for PAtch, and a Type B or C for sharp electrodes where the resistances are >²0 Megohms. If anyone out there need more help, feel free to call Sutter 415-883-01²8 and ask for me (Adair) and I will be happy to help with any additional concerns. Sincerely, Adair

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 31, 2008 - 2:36 PM
  3. To examine the obtained pipette (5-10micrometer radii) under a microscope, is the microscope special properties (stereo, invert, ....)? Could you infrom me about it, please? Thank you.

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 6, 2009 - 4:20 PM
  4. We use a Leica DM IL inverted microscope with a pl fluotar 100x objective.  The key is to have a high magnification, long-working distance objective.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 6, 2009 - 5:54 PM
  5. Thank you very much Mr. B.Johnson. Sincerely....

    Reply
    Posted by: Haluk B.
    February 7, 2009 - 9:53 PM
  6. Dear authors,
    Thank you for this great video. May I ask which dental wax you are using? Also, what is the temperature of the wax? Your help is greatly appreciated.

    Reply
    Posted by: Taro K.
    September 21, 2014 - 9:03 AM

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