مستو طبقات ثنائية لدعم تشكيل لدراسة نقاط الاشتباك العصبي والمناعي Kinapse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

طبقات ثنائية مستو المعتمدة هي أدوات قوية يمكن استخدامها في تصميم نموذج التفاعلات الجزيئية في المشبك المناعية. هنا ، وتبين لنا لترسيخ أساليب بروتينات التصاق الخلايا المعروفة لتعديل تشكيل المشبك إلى النشرة العلوي من bilyer الدهون ووضع تصور لتشكيل المشبك TIRF باستخدام المجهر.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

طبقات ثنائية مستو المعتمدة هي أدوات قوية يمكن استخدامها في تصميم نموذج التفاعلات الجزيئية في المشبك المناعية. لمحاكاة التفاعلات بين الخلايا الليمفاوية وخلايا مولدة عرض ، ونحن نستخدم Ni2 + - شيلاتينغ الدهون لترسيخ المؤتلف التصاق الخلايا والبروتينات MHC إلى النشرة العلوي من طبقة ثنائية مع بولي الحامض الاميني به. يتم إنشاء طبقات ثنائية مستو من خلال إعداد الدهون ، ومعالجة السطوح الزجاجية حيث ستشكل طبقة ثنائية ، وتشكيل طبقة ثنائية ثم في غرفة متخصصة تحتوي على تدفق الخلية حيث سيتم إضافة الخلايا الليمفاوية. وأضاف بعد ذلك ، واتهم طبقات ثنائية مع ني ونظيره الموسومة البروتينات المؤتلف. يمكن استخدامها أخيرا ، يتم حقن الخلايا الليمفاوية في الخلية وتدفق TIRF المجهري لتشكيل صورة المشبك والآليات التي تحكم تحرك الخلايا التائية ، ومواقع الفرز المستقبلة ، ومواقع للتدهور مستقبلات.

Protocol

1. إعداد الدهون

  1. من أجل ربط البروتينات إلى النشرة العلوي من طبقة ثنائية ، ونحن نستخدم ني 2 + الدهون مخلبية ، الذي ربط بروتينات المؤتلف مع بولي الحامض الاميني به. قد تلتزم بعض أنواع الخلايا غير خصيصا لطبقات ثنائية + المغلفة ني 2 ، ولكن الخلايا التائية عموما لا ، مما يجعل هذا الأسلوب الأمثل لتنشيط الخلايا T دراسة.
  2. يتم الحل عن طريق إعداد طبقة ثنائية الدهن حل ني 20 ٪ + 2 شيلاتينغ الدهون و 80 ٪ في فسفاتيديل كولين المبالغ المناسبة في انبوب من الزجاج مع 1-2 مل من الميثانول الكلوروفورم.
    1. يتبخر المذيب تحت تيار من غاز النيتروجين في الدافئة (30-37 درجة مئوية) حمام الماء. هذه تستغرق عادة حوالي 15 دقيقة.
    2. إزالة أي المذيبات المتبقية تحت تفريغ عالية ، وذلك باستخدام lyophilizer لمدة 90 دقيقة.
  3. حل الدهون في 2 ٪ - N - الأوكتيل غلوكوزيد المنظفات في تريس الملوحة العازلة ، مما يخلق حل المذيلات المنظفات / فسفوليبيد مختلطة. وينبغي تركيز فسفوليبيد النهائي سيكون 0.4 مم. لتشكيل الجسيمات الشحمية ، dialyze هذا الحل ، مقابل 3 تغييرات في تريس الملوحة لإزالة المنظفات وشكل الليبوزومات. ونحن نعمل مع وحدات التخزين عادة بناء على أمر من 1 مل مع قطرها 6 ملم سبكترا / بور أنابيب 2 # مع قطع حوالي 10 كيلو دالتون. نحن نحرص على استبعاد أي ليالي فقاعة الهواء عندما لقط الأنبوب. نحن عادة عقيمة ، تصفية هذا الحل وقيام غسيل الكلى في ظل ظروف نظيفة ، وكيفية التعامل معها باستخدام قفازات معقمة الايثانول 70 ٪.
  4. وينبغي أن يكون هذا الحل واضح وضوح الشمس. يتم تخزينه تحت غاز الارجون لمنع الأكسدة. إذا عكر الحل ، ثم تولدت متعددة الجدران الحويصلات ، وسوف تحتاج إلى البدء من جديد.

2. تحديد مدى تودع ICAM - 1 و MHC على طبقة ثنائية مستو

  1. من أجل إعداد التجربة ، فمن الضروري أولا لتحديد مقدار تودع ICAM - 1 و MHC على مساحة معينة من ني 2 طبقة ثنائية شيلاتينغ + عند تركيز معين من البروتينات القابلة للذوبان. للقيام بذلك ، طبقات ثنائية ودائع في 5 ميكرون الخرز الزجاجي القطر ، واحتضان والخرز الزجاجي مع حلول البروتين الذي التقريبية تلك الموجودة في الخلايا المستخدمة لتدفق التصوير ، وتلا كثافة البروتين ملزمة من قبل فحص تدفق immunofluorometric. بشروط
  2. وتستخدم الأجسام المضادة FITC المسمى مع الأرقام المعروفة في جزيء فلوريسئين الكشف عن البروتينات السطحية محدد. وتستخدم حبات فلوريسئين القياسية لمعايرة microfluorimeter التدفق.
  3. سوف نقيم تلك الظروف التي تقريبية عن مستضد تقديم الخلايا مع 200 من molecules/μm2 ICAM - 1 و 0،2-20 molecules/μm2 من EK - I - 103 - MCC91 المعقدة.

3. تنظيف الزجاج لتغطية وزلات تشكيل طبقات ثنائية مستو

  1. طبقات ثنائية شكل مستو بشكل عفوي عندما الليبوزومات الصمامات على الزجاج ، ولكن فقط إذا تم تنظيفها بشكل صحيح على الزجاج.
  2. عند العمل مع سمكة البيرانا ، ونحن ارتداء ملابس واقية كاملة ، بما في ذلك ساحة وحامض ، وحامض الثقيلة gauntlets مقاومة. فصل النفايات بعناية من النفايات العضوية والتخلص منها بشكل صحيح.
  3. لتحضير محلول حمض سمكة البيرانا ، إضافة 75 مل من حمض الكبريتيك المركز إلى دورق جاف ، وإضافة بدقة 25 مل من بيروكسيد الهيدروجين بنسبة 30 ٪. الحل تسخن بسرعة تصل إلى أكبر من 100 درجة مئوية.
  4. غمر coverslips الجافة في حل لمدة 15 دقيقة. إزالته من الحل وشطف في تنقية المياه لمدة دقيقة على كل جانب. تجفيف coverslips باستخدام مصدر فراغ لتصريف المياه النقية. السماح للسمكة البيرانا حل لتبرد ، وإضافة إلى سمكة البيرانا حاوية النفايات ، والذي ترك مع غطاء فضفاض ، وضعت بشكل جيد في غطاء الدخان. عندما يتم إعداد جميع الليبوزومات ، coverslips ، والبروتينات ، والمشبك مناعية جاهزة للتشكيل.

4. تشكيل طبقات ثنائية

  1. لتشكل طبقات ثنائية ، مختبرنا يستخدم Bioptechs FCSII الدوائر ، التي لديها مزايا التدفئة متكاملة. نظام FCSII على قاعدة أن الفولاذ المقاوم للصدأ المشابك معا مشعب ميكروفلويديك مع طوقا 0.5 مم العلوي ، شريحة microaqueduct مغلفة أكسيد القصدير الإنديوم للتدفئة على سطح واحد ، مع الأخدود fluidic على الجانب الآخر ، وخالية من الغبار 0.25 ملم تنظيف طوقا الذي يحدد ارتفاع للغرفة وسمكة البيرانا تدفق ال 40 ملم على ساترة الجولة التي شكلت طبقة ثنائية.
  2. في حين ينزلق الغطاء ، على أساسها يتم تشكيل طبقة ثنائية ، يجب أن يكون ماء للغاية ونظيفة ، والشريحة microacqueduct في الواقع يعمل على نحو أفضل لو كان أكثر مسعور. القرار هو تحقيق مزيد من مسعور microaqueduct عن طريق التعامل مع HSA 1 ٪ لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم غسل وتجفيف المياه النقية وتماما بعد تكييف هذه العملية ، وكذلك بين الاستخدامات. طلاء من التشويه والتحريف البروتينات التي خلفها هذا الإجراء يسمح 1 ميكرولتر من تعليق الحويصلية لتشكيل الجولة ، نصف الكرويةل قطرة هذا هو> 0.25 مم.
  3. لتجميع خلية تدفق وشكل طبقات ثنائية مستو ، ضع متعددة ، مع أنابيب موجهة إلى أعلى ، على سطح مستو. ثم ، ضع 0. 5 طوقا ملم مع الثقوب وضعه فوق أنابيب fluidic ، والتأكد من أن يجلس عليه المسطحة. المكان برفق على الجانب microaqueduct وحشية مع القنوات fluidic مواجهة ، والتأكد من انها المقاعد المسطحة دون تطبيق أي ضغوط هبوطية ، حتى التحقق من أن الثقوب في الشريحة مع محاذاة أنابيب ميكروفلويديك. وضع خالية من الغبار طوقا 0.25 ملم مع قطع مستطيلة من على قمة الشريحة microaqueduct بحيث تصطف القناة مع قنوات fluidic وهناك مسافات كبيرة الهواء.
  4. مكان ما يصل إلى 5 × 1 ميكرولتر من قطرات الحويصلية التعليق على سطح الشريحة microaqueduct في نمط مثل هذه المسافة إلى مركز الوسط بين كل قطرة هو 2.5 ملم. قد تنخفض 5 الحويصلية لها تراكيب مختلفة ، ولكن في هذه الحالة سوف نقوم شكل طبقات ثنائية اثنين فقط ، واحدة مع عدم وجود ني 2 + + الدهون مخلبية واحد مع 10 ٪ نيكل + 2 + الدهون مخلبية.
  5. مرة واحدة هذه القطرات هي في مكان ، ومكان بعناية غطاء ينزلق لأسفل على السطح في اقتراح واحد. المشبك على القاعدة في أسرع وقت ممكن. ينبغي أن يسقط الحويصلية اجراء اتصالات مع انزلاق الغطاء. لا ينبغي أن يكون هذا الاتصال مكسورة ، منذ طبقات ثنائية ربما شكلت بالفعل ؛ أي اضطرابات قد تؤدي إلى طبقات ثنائية معيبة.
  6. من المهم أن نتذكر أن علامة مواقف طبقات ثنائية مع بقع الحبر الصغيرة قليلة على الشريحة microacqueduct للمساعدة في تحديد المواقع ساترة على المجهر. الانتظار 20 دقيقة للتأكد من أن النظام قد معايرتها. نقل جميع الحلول باستخدام حقنة 20 مل متصلا إلى حوالي 20 سم من أنابيب مرنة ومحبس 3 الطريقة. توصيل منفذ آخر للمحبس إلى الخلية التدفق بطول قصيرة من الأنابيب لتقليل حجم القتلى بين محبس والخلية التدفق. ملء الحقنة مع HEPES - مخزنة المالحة التي تحتوي على 2 ملم MgCl 2 ، 1 ملم CaCl 2 ، 5 ملي الجلوكوز و 1 ٪ ألبومين المصل البشري.
  7. رئيس الأنبوب ومحبس حتى لا تكون هناك فقاعات الهواء. ربط هذا إلى الخلايا ، ودفع التدفق من خلال 5 مل في اقتراح واحد بينما كان يشاهد للتأكد من عدم وجود فقاعات الهواء يمر عبر طبقة ثنائية. الآن ، سيكون لديك طبقات ثنائية الخاص.

هذه المقالة الفيديو تدعم "هنتر إلى المجمع وعودة : الوصلات العصبية والمناعية وKinapses تنويعات على موضوع للتنقل Amoeboid" من قبل مايكل لام داستن ، الاستعراض السنوي للخلية وعلم الأحياء التنموي ، المجلد 24 ، 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics