Ondersteunde Planar dubbellagen voor de vorming van studie van immunologische synapsen en Kinapse

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Hier tonen we methoden voor het verankeren van celadhesie eiwitten waarvan bekend is dat moduleren synapsvorming naar de bovenste folder van de lipide bilyer en synapsvorming met behulp van TIRF microscopie visualiseren.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ondersteund vlakke bilagen zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om de moleculaire interacties in een immunologische synaps model. Na te bootsen van de interacties tussen de lymfocyten en antigeen presenterende cellen, maken we gebruik Ni2 +-chelerende lipiden om recombinant celadhesie en MHC-eiwitten anker naar de bovenste folder van een bilaag met poly-histidine tags. Planar bilagen worden gegenereerd door het voorbereiden lipide, het behandelen van de glazen oppervlakken waar de bilaag zal vormen, en vervolgens de vorming van de dubbellaag in een gespecialiseerde kamer met een flow-cel waar de lymfocyten worden toegevoegd. Vervolgens bilagen zijn belast met Ni en zijn-tag recombinante eiwitten worden toegevoegd. Tot slot, lymfocyten worden geïnjecteerd in de flow cel en TIRF microscopie kan worden gebruikt om foto synapsvorming en de mechanismen die de controle T-cel motoriek, sites van de receptor sorteren, en de sites van receptor degradatie.

Protocol

1. De voorbereiding van de lipiden

  1. Om eiwitten koppelen aan de bovenste folder van een bilaag, gebruiken we Ni 2 + chelaterende lipiden, die recombinante eiwitten anker met poly-histidine tags. Bepaalde celtypen kunnen ook niet-specifiek voldoen aan Ni 2 +-coating dubbellagen, maar T-cellen over het algemeen niet, waardoor deze methode optimaal is voor het bestuderen van T-cel activatie.
  2. De lipide bilaag oplossing wordt gemaakt door het voorbereiden van een oplossing van 20% Ni 2 + chelaatvormende lipiden en 80% fosfatidylcholine in de juiste hoeveelheden in een glazen buis met 1-2 ml chloroform-methanol.
    1. Damp het oplosmiddel onder een stroom van stikstof gas in een warm (30-37 ° C) water bad. Dit duurt meestal ongeveer 15 minuten.
    2. Verwijder eventuele resterende oplosmiddel onder hoog vacuüm, met behulp van een vriesdroger voor 90 minuten.
  3. Los van de lipiden in 2% N-octyl-glucoside detergent in Tris-zout buffer, waarbij een oplossing van detergent gemengde / fosfolipide micellen creëert. De uiteindelijke fosfolipide concentratie moet 0,4 mm zijn. Om vorm liposomen, dialyze deze oplossing tegen drie veranderingen van Tris-zout tot afwasmiddel en vormen liposomen te verwijderen. We werken meestal met volumes in de orde van 1 ml met 6 mm diameter Spectra / por # 2 buis met een afgesneden ongeveer 10 kDa. We zijn voorzichtig aan een luchtbel s uit te sluiten wanneer klemmen de slang. We meestal steriel-filter deze oplossing en doen de dialyse onder schone omstandigheden, de behandeling met behulp van 70% ethanol gesteriliseerde handschoenen.
  4. Deze oplossing moet worden glashelder. Het is opgeslagen onder argon gas om oxidatie te voorkomen. Als de oplossing troebel, dan is multi-walled blaasjes zijn gegenereerd, en moet je opnieuw beginnen.

2. Het bepalen hoeveel ICAM-1 en MHC worden afgezet op de vlakke bilaag

  1. Met het oog op het opzetten van de experiment, is het eerst noodzakelijk om te bepalen hoeveel ICAM-1 en MHC worden afgezet op een bepaalde oppervlakte van Ni 2 + chelerende bilaag bij een bepaalde concentratie van oplosbare proteïne. Om dit te doen, stort dubbellagen op 5 micrometer diameter van glazen kralen, incubeer de glazen kralen met eiwitoplossingen onder omstandigheden die bij benadering die in de stroom cellen die worden gebruikt voor de beeldvorming, en de dichtheid van gebonden eiwit door een stroom immunofluorometric test te lezen.
  2. FITC-gelabelde antilichamen met bekende nummers van fluoresceïne per molecuul worden gebruikt om de oppervlakte-gebonden eiwitten te detecteren. Fluoresceïne standaard kralen worden gebruikt om de stroom microfluorimeter kalibreren.
  3. We zullen voorwaarden vast te leggen die bij benadering die op antigeen-presenterende cellen met 200 molecules/μm2 van ICAM-1 en 0.2 tot 20 molecules/μm2 van I-Ek-MCC91-103 complex.

3. Reinigen van het glas dekglaasjes voor het vormen van vlakke dubbellagen

  1. Vlakke bilagen vormen spontaan als de liposomen zekering glas, maar alleen als het glas wordt goed schoongemaakt.
  2. Bij het werken met Piranha, we dragen volledige beschermende kleding, waaronder een schort zuur en zwaar, zuurbestendig handschoenen. Zorgvuldig scheiden het afval van organische afvalstoffen en gooi op de juiste manier.
  3. Ter voorbereiding op de zure Piranha-oplossing, voeg 75 ml geconcentreerd zwavelzuur tot een droog bekerglas en voeg voorzichtig 25 ml van 30% waterstof peroxide. De oplossing warmt snel op tot meer dan 100 ° C.
  4. Dompel de droge dekglaasjes in de oplossing gedurende 15 minuten. Haal ze uit de oplossing en spoel in gezuiverd water voor een minuut aan elke kant. Droog de dekglaasjes met behulp van een vacuüm bron de afvoer het gezuiverde water. Laat de Piranha-oplossing om af te koelen, en om de Piranha afval container, die is vertrokken met de dop los, goed gemarkeerd in de zuurkast toe te voegen. Wanneer alle van de liposomen, dekglaasjes, en eiwitten zijn bereid, de immunologische synaps is klaar om te worden gevormd.

4. Het vormen van de bilagen

  1. Het vormen van de dubbellagen, ons lab gebruikt Bioptechs FCSII kamers, die de voordelen van geïntegreerde verwarming hebben. Het FCSII systeem is op een roestvrij stalen basis die klemmen samen een microfluïdisch spruitstuk met een 0,5 mm top pakking, een microaqueduct glijbaan bekleed met indium tin oxide voor de verwarming op een oppervlak, met vloeibare groef aan de andere kant, een stofvrije 0,25 mm pakking dat de hoogte van de stroming kamer en de Piranha definieert schoongemaakt 40 mm ronde dekglaasje waarop de bilaag wordt gevormd.
  2. Terwijl het dekglas, waarop de bilaag is gevormd, moet worden zeer hydrofiel en schoon, de microacqueduct slide werkt eigenlijk beter als het meer hydrofobe. Het maken van de microaqueduct meer hydrofobe wordt bereikt door behandeling met 1% HSA gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur, vervolgens wassen met zuiver water en drogen volledig na dit conditioneringsproces, evenals tussen toepassingen. De coating van gedenatureerde eiwitten achtergelaten door deze procedure kan een ui van liposoom schorsing het vormen van een ronde, hemispherical druppel die is> 0,25 mm hoog.
  3. Om de stroom cel en vorm planaire dubbellagen monteren, plaatst u het spruitstuk, met de buizen naar boven gericht, op een vlakke ondergrond. Plaats vervolgens de 0. 5 mm pakking met gaten gepositioneerd boven de vloeibare buizen, zorg ervoor dat deze vlak zit. Plaats voorzichtig de microaqueduct kant op de pakking met de vloeibare kanalen naar boven, en zorg ervoor dat flat stoelen zonder toepassing van enige neerwaartse druk, totdat na te gaan of de gaten in de glijbaan af te stemmen op de microfluïdische buizen. Leg de stofvrije 0,25 mm pakking met een rechthoekig uitgesneden op de top van de microaqueduct schuiven, zodat het kanaal is bekleed met de vloeibare kanalen en zijn er geen grote luchtruimten.
  4. Plaats maximaal 5 x 1 pl druppels liposoom schorsing op het oppervlak van de microaqueduct dia in een patroon zodanig dat de hart-op-hart afstand tussen elke druppel is 2,5 mm. De 5 liposoom druppels kunnen verschillende samenstellingen, maar in dit geval zullen we enige vorm twee dubbellagen, een zonder Ni 2 + + chelaatvormende lipiden en een met 10% Ni 2 + + chelerende lipiden.
  5. Zodra deze druppels zijn op hun plaats, plaatst u voorzichtig het deksel naar beneden glijden op het oppervlak in een beweging. Klem op de basis zo snel mogelijk. Het liposoom druppels moet contact maken met het dekglas. Dit contact mag niet worden verbroken, omdat de dubbellagen hebben waarschijnlijk al gevormd; eventuele storingen kan leiden tot gebrekkige dubbellagen.
  6. Het is belangrijk om te onthouden voor de posities van de dubbellagen merken met een paar kleine inktvlekken op de microacqueduct dia positionering van het dekglaasje op de microscoop hulp. Wacht 20 minuten om te controleren of het systeem in evenwicht is. Overdracht van alle oplossingen met behulp van een 20 ml spuit is aangesloten op ongeveer 20 cm van flexibele slang en een 3-weg kraan. Sluit een andere poort van de kraan om de stroom cel door een korte lengte van de slang aan de dode volume tussen de kraan en de stroom cel te minimaliseren. Vul de spuit met HEPES-gebufferde zoutoplossing die 2 mM MgCl2, 1 mM CaCl 2, 5 mM glucose en 1% humaan serumalbumine.
  7. Prime de slang en de kraan zodat er geen luchtbellen. Sluit deze aan op de stroom cellen en door te drukken 5 ml in een beweging tijdens het kijken om er zeker van dat er geen luchtbellen passeren de bilaag. Nu zal u uw dubbellagen.

Deze video artikel ondersteunt "Hunter Gatherer en Back: Immunologische synapsen en Kinapses als variaties op het thema van de Amoeboid Locomotion" van Michael L. Dustin , Annual Review of Cel-en Ontwikkelingsbiologie , Volume 24, 2008.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics