Supportato bilayers Planar per la formazione degli Studi di sinapsi immunologica e Kinapse

Biology

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Summary

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Qui vi mostriamo i metodi per l'ancoraggio delle proteine ​​di adesione cellulare conosciuto per modulare la formazione di sinapsi il foglio superiore della bilyer lipidi e visualizzare formazione di sinapsi usando la microscopia TIRF.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

Supportati doppi strati planari sono strumenti potenti che possono essere utilizzati per modellare le interazioni molecolari in una sinapsi immunologica. Per simulare le interazioni tra i linfociti e le cellule presentanti l'antigene, si usa Ni2 +-chelante lipidi per ancorare l'adesione delle cellule e proteine ​​ricombinanti MHC il foglio superiore di un doppio strato di poli-istidina tag. Doppi strati planari sono generate da preparazione dei lipidi, trattando le superfici di vetro, dove si forma il doppio strato, e poi formando il doppio strato in una sezione specializzata che contiene un flusso di celle dove i linfociti saranno aggiunti. Poi, doppi strati sono accusati di Ni e il suo-tagged proteine ​​ricombinanti sono aggiunti. Infine, i linfociti vengono iniettati nella cellula di flusso e microscopia TIRF possono essere utilizzati per la formazione di sinapsi immagine ed i meccanismi che controllano la locomozione delle cellule T, siti di smistamento dei recettori, e siti di degradazione del recettore.

Protocol

1. Preparare i lipidi

  1. Al fine di collegare le proteine ​​il foglio superiore di un doppio strato, usiamo Ni 2 + lipidi chelanti, che ancorano proteine ​​ricombinanti con poli-istidina tag. Alcuni tipi di cellule possono aderire in modo non specifico per Ni 2 + rivestite doppi strati, ma le cellule T generalmente non, rendendo questo metodo ottimale per studiare l'attivazione delle cellule T.
  2. La soluzione doppio strato lipidico è costituito da preparando una soluzione di 20% di Ni 2 + lipidi chelante fosfatidilcolina e 80% per l'importo adeguato a un tubo di vetro con 1-2 ml di cloroformio-metanolo.
    1. Far evaporare il solvente sotto un flusso di azoto in un ambiente caldo (30-37 ° C), acqua sporca. Questo richiede di solito circa 15 minuti.
    2. Rimuovere eventuali solvente rimanente sotto alto vuoto, utilizzando un liofilizzatore per 90 minuti.
  3. Sciogliere i lipidi nel 2% diottile-glucoside detergente in tampone Tris-salino, che crea una soluzione di detergente misto / fosfolipidi micelle. La concentrazione dei fosfolipidi finale dovrebbe essere 0,4 mm. Per formare liposomi, Dializzare di questa soluzione con 3 cambi di Tris-salino per rimuovere liposomi detergente e forma. Di solito lavoro con volumi dell'ordine di 1 ml con 6 mm di diametro Spectra / Por # 2 tubi con un cut-off di circa 10 kDa. Stiamo attenti a escludere qualsiasi s bolle d'aria per il fissaggio del tubo. Noi di solito sterile-filtro questa soluzione e fare la dialisi in condizioni di pulizia, la movimentazione usando guanti di etanolo al 70% sterilizzati.
  4. Questa soluzione dovrebbe essere cristallino. E 'conservato in gas argon per evitare l'ossidazione. Se la soluzione è torbida, poi multi-parete vescicole sono stati generati, e sarà necessario ricominciare da capo.

2. Determinare la quantità di ICAM-1 e MHC si depositano sul doppio strato planare

  1. Per impostare l'esperimento, è prima necessario determinare la quantità di ICAM-1 e MHC sono depositate su una superficie dato di Ni 2 + chelanti bilayer a una data concentrazione di proteina solubile. Per fare questo, bilayers deposito il 5 micrometri di diametro perle di vetro, incubare le perle di vetro con le soluzioni di proteine ​​che approssimano quelli delle celle di flusso utilizzato per l'imaging, e leggere la densità delle proteine ​​da un saggio di flusso immunofluorometric. Condizioni
  2. Gli anticorpi coniugati con fluoresceina con un numero noto di fluorescina per molecola vengono utilizzati per rilevare la superficie è legato proteine. Fluoresceina sfere standard sono utilizzati per calibrare il microfluorimeter flusso.
  3. Creeremo le condizioni che approssimano quelle cellule presentanti l'antigene con 200 molecules/μm2 di ICAM-1 e 0,2-20 molecules/μm2 di I-Ek-MCC91-103 complessi.

3. Pulizia del vetro di copertura scivola per la formazione di doppi strati planari

  1. Doppi strati planari forma spontaneamente quando i liposomi fusibile di vetro, ma solo se il bicchiere sia ben pulito.
  2. Quando si lavora con Piranha, abbiamo indossare idonei indumenti protettivi, tra cui un grembiule acido e pesante, guanti resistenti agli acidi. Con attenzione separare i rifiuti da rifiuti organici e smaltire in modo corretto.
  3. Per preparare la soluzione Piranha acido, aggiungere 75 ml di acido solforico concentrato in un recipiente asciutto, ed aggiungere con cautela 25 ml di acqua ossigenata al 30%. La soluzione si riscalda rapidamente fino a oltre 100 ° C.
  4. Immergere i coprioggetti secco nella soluzione per 15 minuti. Rimuovere dalla soluzione e sciacquare con acqua purificata per un minuto su ogni lato. Asciugare il coprioggetto utilizzando una fonte di vuoto per drenare l'acqua purificata. Lasciare che la soluzione Piranha raffreddare e aggiungere al contenitore dei rifiuti Piranha, che è lasciata con il tappo sciolti, ben marcato nella cappa. Quando tutti i liposomi, coprioggetto, e le proteine ​​sono preparati, la sinapsi immunologica è pronto per essere formata.

4. Formare i doppi strati

  1. Per formare i doppi strati, il nostro laboratorio utilizza Bioptechs FCSII camere, che hanno il vantaggio di riscaldamento integrato. Il sistema FCSII è su una base in acciaio inox fascette insieme un collettore microfluidica con una guarnizione 0,5 millimetri superiore, una diapositiva microaqueduct rivestito con ossido di indio e stagno per il riscaldamento su una superficie, con scanalatura fluidico dall'altro lato, una polvere 0,25 millimetri guarnizione che definisce l'altezza della camera di flusso e il Piranha pulito coprioggetto 40 mm rotondo sul quale si forma il doppio strato.
  2. Mentre il vetrino, sul quale si forma il doppio strato, deve essere altamente idrofili e pulito, la diapositiva microacqueduct effettivamente funziona meglio se è più idrofobo. Rendere il idrofobo microaqueduct più si ottiene trattando con l'1% HSA per 60 minuti a temperatura ambiente, poi lavaggio con acqua pura e il completo indurimento dopo questo processo di condizionamento, così come tra usi. Il rivestimento di proteine ​​denaturate lasciata da questa procedura consente di 1 ml di sospensione di liposomi per formare una rotonda, hemispherical goccia che è> 0,25 mm di altezza.
  3. Per assemblare la cella a flusso e la forma doppi strati planari, posto il collettore, con i tubi diretta verso l'alto, su una superficie piana. Poi, collocare il 0. Guarnizione 5 mm con fori posizionato sopra i tubi fluidico, assicurandosi che sia seduto piatto. Posizionare con delicatezza il lato microaqueduct sulla guarnizione con i canali fluidico rivolto verso l'alto, e assicurarsi che i sedili piatto senza applicare alcuna pressione verso il basso, fino a verificare che i fori nella diapositiva allinearsi con i tubi microfluidica. Stendere la polvere guarnizione 0,25 mm con un taglio rettangolare sulla parte superiore della diapositiva microaqueduct modo che il canale sia in linea con i canali fluidici e non ci sono spazi d'aria principali.
  4. Posto fino a 5 gocce x 1 ml di sospensione liposomi sulla superficie del vetrino microaqueduct in un modello tale che il centro a centro distanza tra ogni goccia è di 2,5 mm. Il 5 gocce di liposomi possono avere composizioni diverse, ma in questo caso ci sarà solo formano due doppi strati, uno senza Ni 2 + + lipidi chelante e uno con il 10% Ni 2 + + lipidi chelanti.
  5. Una volta che queste gocce sono in atto, posizionare con attenzione il coperchio scivolare sulla superficie in un unico movimento. Morsetto nella base il più rapidamente possibile. Le gocce liposomi dovrebbe entrare in contatto con la polizza di copertura. Questo contatto non deve essere spezzato, dal momento che bilayers hanno probabilmente già formate, qualsiasi interruzione può provocare doppi strati difettoso.
  6. E 'importante ricordarsi di segnare le posizioni dei doppi strati con pochi punti di inchiostro piccolo della diapositiva microacqueduct ausilio per il posizionamento del vetrino sul microscopio. Attendere 20 minuti per assicurarsi che il sistema è equilibrato. Trasferire tutte le soluzioni utilizzando una siringa da 20 ml collegata a circa 20 cm di tubo flessibile ed un rubinetto a 3 vie. Collegare un altro porto del rubinetto di arresto nella cella di flusso per un breve tratto di tubo ridurre al minimo il volume morto tra il rubinetto e la cella di flusso. Riempire la siringa con HEPES soluzione tampone contenente 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM di glucosio e 1% di albumina umana.
  7. Primo il tubo e rubinetto quindi non ci sono bolle d'aria. Collegare questo alle cellule di flusso e pressione a 5 ml in un unico movimento mentre si guarda per assicurarsi che bolle d'aria passare il doppio strato. Ora, avrete il vostro doppi strati.

In questo articolo video supporta "Hunter Gatherer e Back: Le sinapsi immunologica e Kinapses come variazioni sul tema di locomozione ameboide" di Michael L. Dustin , Annual Review di Biologia Cellulare e dello Sviluppo , Volume 24, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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