Unterstützte Planar-Membranen für die Bildung von Study of immunologischen Synapsen und Kinapse

Biology

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Summary

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Hier zeigen wir Methoden zur Verankerung Zelladhäsionsproteine ​​bekannt zu modulieren Synapsenbildung an der oberen Flugblatt der Lipid bilyer und visualisieren Synapsenbildung mit TIRF-Mikroskopie.

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Vardhana, S., Dustin, M. Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse. J. Vis. Exp. (19), e947, doi:10.3791/947 (2008).

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Abstract

Unterstützte planaren Doppelschichten sind leistungsfähige Werkzeuge, die verwendet werden, um die molekularen Wechselwirkungen in einer immunologischen Synapse Modell werden können. Zur Simulation der Wechselwirkungen zwischen Lymphozyten und Antigen-präsentierende Zellen, verwenden wir Ni2 +-Chelat-Lipide zur rekombinanten Zell-Adhäsion und MHC-Proteine ​​an der oberen Flugblatt einer Doppelschicht mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Planar-Doppelschichten sind durch die Vorbereitung Lipid, die Behandlung der Glasflächen, wo der Doppelschicht bilden, und dann bildet der Doppelschicht in einer spezialisierten Kammer mit einem Flow-Zelle, wo die Lymphozyten hinzugefügt werden generiert. Dann Doppelschichten sind mit Ni-und His-markierten rekombinanten Proteinen berechnet werden hinzugefügt. Schließlich Lymphozyten sind in die Messzelle und TIRF-Mikroskopie injiziert werden, um Bild Synapsenbildung und die Mechanismen genutzt werden, dass die Kontrolle T-Zell-Lokomotion, Websites von Rezeptor-Sortierung und Websites von Rezeptor-Abbau.

Protocol

1. Vorbereitung der Lipide

  1. Um Proteine ​​an die obere Flugblatt einer Doppelschicht Link verwenden wir Ni 2 + Komplexbildner Lipide, die rekombinante Proteine ​​mit Poly-Histidin-tags zu verankern. Bestimmte Zelltypen können nicht speziell an Ni 2 +-beschichtete Doppelschichten, aber T-Zellen in der Regel nicht, so dass diese Methode optimal für das Studium T-Zell-Aktivierung.
  2. Die Lipid-Doppelschicht-Lösung wird durch Herstellen einer Lösung von 20% Ni 2 + gemacht chelatisierenden Lipid-und 80% Phosphatidylcholin in die entsprechenden Beträge in ein Glasrohr mit 1-2 ml Chloroform-Methanol.
    1. Das Lösungsmittel wird unter einem Strom von Stickstoffgas in einem warmen (30-37 ° C) Wasserbad. Dies dauert in der Regel etwa 15 Minuten.
    2. Entfernen Sie alle verbleibenden Lösungsmittels im Hochvakuum mit einem Lyophilisator für 90 Minuten.
  3. Lösen Sie die Lipide in 2% N-Octyl-Glucosid Reinigungsmittel in Tris-Saline-Puffer, der eine Lösung von gemischt Waschmittel / Phospholipid-Micellen erzeugt. Die endgültige Phospholipidkonzentration sollte 0,4 mm betragen. Zur Bildung Liposomen, dialysieren diese Lösung gegen 3 Änderungen der Tris-Saline zu Wasch-und Form-Liposomen zu entfernen. Wir in der Regel mit einem Volumen Arbeit in der Größenordnung von 1 ml mit 6 mm Durchmesser Spectra / Por # 2 Schläuche mit einem Cut-off um 10 kDa. Wir sind darauf bedacht, jede Luftblase s auszuschließen beim Spannen des Rohres. Wir in der Regel steril-Filter diese Lösung und nicht die Dialyse unter sauberen Bedingungen, die Handhabung ist mit 70% Ethanol sterilisiert Handschuhe.
  4. Diese Lösung sollte klar sein. Es wird unter Argon-Gas, um Oxidation zu verhindern gespeichert. Wenn die Lösung trüb, dann mehrwandigen Bläschen erzeugt worden sind, und Sie müssen wieder von vorne anfangen.

2. Ermitteln, wie viel ICAM-1 und MHC auf der planaren Bilayer abgelagert werden

  1. Um das Experiment, ist es zunächst notwendig, um festzustellen, wie viel ICAM-1 und MHC auf einer gegebenen Fläche von Ni 2 + Chelat-Doppelschicht sind bei einer gegebenen Konzentration an löslichem Protein abgelagert. Um dies zu tun, Kaution Doppelschichten auf 5 Mikrometer Durchmesser Glasperlen, inkubieren Sie die Glasperlen mit Proteinlösungen unter Bedingungen, die annähernd denen in den Fluss-Zellen für die Bildgebung verwendet wird, und liest die Dichte des gebundenen Proteins durch eine Strömung immunofluorometric Assay.
  2. FITC-markierten Antikörpern mit bekannten Zahlen von Fluorescein pro Molekül verwendet, um die Oberflächen-gebundenen Proteine ​​nachzuweisen. Fluorescein-Standard Kügelchen verwendet werden, um den Fluss microfluorimeter kalibrieren.
  3. Wir schaffen Bedingungen, die annähernd denen von Antigen-präsentierenden Zellen mit 200 molecules/μm2 von ICAM-1 und 0,2-20 molecules/μm2 der I-Ek-MCC91-103-Komplex.

3. Reinigung der Glasdeckgläschen zur Bildung planarer Doppelschichten

  1. Planar Lipid-Doppelschichten bilden sich spontan, wenn die Liposomen Glaskolbensicherung, aber nur, wenn das Glas richtig gereinigt.
  2. Bei der Arbeit mit Piranha, tragen wir die volle Schutzkleidung, einschließlich einer Säure Schürze und schwer, säurebeständigen Handschuhen. Sorgfältig trennen die Abfälle aus organischen Abfällen und ordnungsgemäß entsorgen.
  3. Zur Vorbereitung der Säure Piranha-Lösung, 75 ml konzentrierte Schwefelsäure auf ein trockenes Becherglas und fügt vorsichtig 25 ml 30% iges Wasserstoffperoxid. Die Lösung schnell erwärmt sich auf mehr als 100 ° C.
  4. Tauchen Sie den trockenen Deckgläser in die Lösung für 15 Minuten. Entfernen Sie aus der Lösung und spülen Sie in gereinigtem Wasser für eine Minute auf jeder Seite. Trocknen Sie die Deckgläser mit einem Vakuum-Quelle zur Ableitung des gereinigten Wassers. Lassen Sie das Piranha-Lösung zu kühlen, und fügen Sie den Piranha Abfallbehälter, die mit der Kappe lose, auch im Abzug markiert links ist. Wenn alle der Liposomen, Deckgläser und Proteine ​​hergestellt werden, ist der immunologischen Synapse bereit, gebildet werden.

4. Die Ausbildung der Doppelschichten

  1. Zur Ausbildung der Doppelschichten, nutzt unser Labor Bioptechs FCSII Kammern, die die Vorteile der integrierten Heizung haben. Die FCSII System basiert auf einem Sockel aus Edelstahl, die Bügelhälften einem mikrofluidischen Verteiler mit einer 0,5 mm Top-Dichtung, ein microaqueduct Rutsche mit Indium-Zinn-Oxid für die Heizung auf einer Oberfläche beschichtet, mit fluidischen Nut auf der anderen Seite, eine staubfreie 0,25 mm Dichtung, dass die Höhe der Flusskammer und der Piranha definiert gereinigt 40 mm runden Deckglas, auf denen die Doppelschicht gebildet wird.
  2. Während das Deckglas, auf denen die Doppelschicht gebildet wird, muss stark hydrophil und sauber, die microacqueduct schieben tatsächlich funktioniert besser, wenn es mehr hydrophoben ist. Making the microaqueduct mehr hydrophobe durch Behandlung mit 1% HSA 60 Minuten bei Raumtemperatur erreicht wird, dann Waschen mit reinem Wasser und Trocknen vollständig nach dieser Konditionierung, sowie zwischen den Anwendungen. Die Beschichtung von denaturierten Proteinen durch dieses Verfahren verlassen können 1 ul Liposomensuspension zu einer Runde hemisphaerica Forml Tropfen,> 0,25 mm hoch ist.
  3. Um die Durchflusszelle und bilden planare Doppelschichten montieren, stellen die vielfältigen, mit den Rohren nach oben gerichtet, auf eine ebene Fläche. Legen Sie dann die 0. 5 mm Dichtung mit Löchern in den fluidischen Röhren positioniert, um sicherzustellen, dass es sitzt flach. Sanft legen Sie die microaqueduct Seite auf die Dichtung mit dem fluidischen Kanäle nach oben und stellen Sie sicher, es Sitze ohne jeglichen Druck nach unten flach, bis die Überprüfung, dass die Löcher in die Folie mit dem mikrofluidischen Rohre auszurichten. Legen Sie die staubfreie 0,25 mm Dichtung mit einem rechteckigen Ausschnitt auf der Oberseite des microaqueduct schieben, so dass die Kanal mit dem fluidischen Kanälen gesäumt und es gibt keine größeren Lufträumen.
  4. Legen Sie bis zu 5 x 1 ul Tropfen Liposomensuspension auf der Oberfläche des microaqueduct Folie in ein Muster, so dass die Mitte-zu-Mitte-Abstand zwischen den einzelnen Tropfen 2,5 mm ist. Die 5 Liposomen Tropfen können unterschiedliche Zusammensetzungen haben, aber in diesem Fall werden wir nur bilden zwei Doppelschichten, eine ohne Ni 2 + + Komplexbildner Lipide und eine mit 10% Ni 2 + + Komplexbildner Lipiden.
  5. Sobald diese Tropfen vorhanden sind, vorsichtig den Deckel nach unten rutschen auf der Oberfläche in einer Bewegung. Clamp auf den Boden so schnell wie möglich. Das Liposom Tropfen sollten Kontakt mit dem Deckglas zu machen. Dieser Kontakt sollte nicht gebrochen werden, da die Doppelschichten wahrscheinlich schon gebildet haben; etwaige Störungen können in defekten Doppelschichten führen.
  6. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, um die Positionen der Doppelschichten mit ein paar kleinen Tinte Flecken auf der microacqueduct Folie Positionierung des Deckglas unter dem Mikroskop Hilfe zu markieren. Warten Sie 20 Minuten, um sicherzustellen, hat das System äquilibriert. Übertragen Sie alle Lösungen mit einer 20 ml Spritze verbunden, über 20 cm Schlauch und einem 3-Wege-Hahn. Schließen Sie einen anderen Port des Hahnes auf die Messzelle mit einem kurzen Rohrstück das Totvolumen zwischen dem Hahn und der Durchflusszelle zu minimieren. Füllen Sie die Spritze mit HEPES-gepufferte Kochsalzlösung mit 2 mM MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 5 mM Glucose und 1% humanem Serumalbumin.
  7. Prime den Schlauch und Hahn so gibt es keine Luftblasen. Schließen Sie hier die Messzellen und durchzusetzen 5 ml in einer Bewegung, während Sie sicherstellen, dass keine Luftblasen in den Doppelschicht passieren. Jetzt haben Sie Ihre Doppelschichten.

Dieses Video Artikel unterstützt "Hunter Gatherer und zurück: immunologischen Synapsen und Kinapses als Variationen über das Thema der amöboiden Locomotion" von Michael L. Dustin , Annual Review of Cell and Developmental Biology , Band 24, 2008.

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Comments

3 Comments

  1. Hi guys, thanks for posting this video- very clearly presented. I just have a couple of questions about formation of the bilayers. Firstly, how do the bilayers turn out without the additional lyophilizing step to remove organic solvent? I find the bilayers form well by removing solvent with a nitrogen flow, and wonder how being more thorough improves the outcome. Secondly, how uniform are the bilayers you make? Do you ever have problems with the His-tagged proteins clustering into small domains? The flow cell looks like a great way of washing/adding reagents and cells! Best wishes, Paul Dunne, Department of Chemistry, University of Cambridge

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 3, 2009 - 11:42 AM
  2. Thanks for your interest. Regarding the vacuum step.  I learned this during a rotation with Alan Kleinfeld in 1985 and have done it religiously since then.  We have had some anecdotal experiences where the detergent solubilization step seemed to go poorly when the vacuum was marginal, but have not systematically studied the effect of leaving this step out.  It may depend upon the amount of phospholipid and how good you are at making a very thin film with the solvent evaporation step. His tagged MHCI and II, ICAM-1, PDL1 and CD86 have remained largely monodispersed.  We work at a pretty low density of <500 molecules/um^².  We and others have had many more problems working with GPI anchored proteins in liposomes, although CD48 and CD58 are very well behaved.  In general I think the his tagged proteins are easier to work with and can be cleaned up by gel filtration prior to deposition if the protein forms aggregates in solution.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 20, 2009 - 8:19 AM
  3. Thanks for your response.

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 9, 2009 - 5:34 AM

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