Summary
אנו מתארים טכניקה פשוטה עלות נמוכה להכנסת ריכוז גבוה של צבעי ניאון וסידן רגיש אל הנוירונים או כל בדרכי העצבית באמצעות טפטפת יניקה פוליאתילן.
Abstract
תיוג מדרדר של נוירונים הוא אנטומי רגיל שיטת 1,2 כי שימש גם לטעון סידן מתח רגישים צבעים לתוך נוירונים 3-6. באופן כללי, צבעים חלים גם גבישים מוצקים או על ידי הזרקה בלחץ מקומי באמצעות בטפי להחדרת נוזלים זכוכית. עם זאת, זה יכול לגרום לדילול של עוצמת תיוג לצבוע מופחת, במיוחד כאשר כמה שעות נדרשים עבור דיפוזיה צבע. כאן אנו מדגימים טכניקה פשוטה בעלות נמוכה להכנסת צבעי ניאון ו יון רגיש אל הנוירונים באמצעות שאיבה פוליאתילן פיפטה פתרון מלא צבע. שיטה זו מציעה דרך אמינה לשמירה על ריכוז גבוה של צבע במגע עם אקסונים בכל הליך הטעינה.
Protocol
Dextrans פלורסנט שימשו ככלים אנטומיים לפעילות ההדמיה העצבית 1-4. שדות ואח', (2009) 4 שפורסם פרוטוקול ליישום יון מתח רגישים צובעת את שטחי axonal עם דגש על חוט השדרה כמערכת מודל. כאן אנו מתארים את הליך מפורט יותר על יישום צבע פלואורסצנטי ו / או יון רגיש השורשים הגחון לחתוך, שורשים הגב או כל בדרכי עצבי של חוט השדרה של חוץ גופית מחקרים optophysiological ו מורפולוגי.
1. Type-I ו-II סוג טפטפות
התחל על ידי משיכת שני קטעים קצרים של צינורות פוליאתילן (PE90, מותג קליי אדמס) מעל להבה של נר אלכוהול 7 לייצר בטפי להחדרת נוזלים עם טיפים מחודדות. אחת פיפטה (Type-I) צריך להיות קצר (3-7 מ"מ) עם קצה קטן שיכול להחזיק חזק את שורש היעד או דרכי (קוטר חיצוני: 0.2-0.4 מ"מ, קוטר פנימי: 0.1-0.3 מ"מ). ואז למשוך פיפטה 2 (סוג-II) עם מוט ארוך (8-12 ס"מ), דק יותר עצה טובה מאוד (קוטר חיצוני: 0.2-0.3 מ"מ, קוטר פנימי: 0.1-0.2 מ"מ), כי יכול להיות מוכנס לתוך סוג, אני פיפטה עד עצה שלה. פיפטה דקה 2 ישמש לשאוב ולהציג מלאכותית הנוזל השדרתי (aCSF) פתרון צבע בהתאמה מ פיפטה סוג-I.
2. המיקום של סוג, אני פיפטה
לנתח ולבודד את חוט השדרה 8,9 ולמקם אותו באמבטיה, superfused עם aCSF צונן (~ 16 מעלות צלזיוס) לאורך כל תהליך הטעינה. מניחים את סוג-I פיפטה על בעל אלקטרודה (H1/12 בעל אלקטרודה, Narishige), כך פתח את גבו ניתן לחבר בקלות את המזרק (1ml U-100 מזרק אינסולין, בקטון דיקנסון או מקביל) באמצעות צינור גמיש (PharMed BPT, קול, בן הזוג, # AY242002: 10 ס"מ) (Fig.1A-B).
3. דיי יישום
- באמצעות מזרק, תחילה לציירaCSF אל פיפטה Type-I (Fig.1B: 2 א) ואחריו מערכת axonal או שורש להתמלא (איור 2 ב). צינורות גמישים אז יש להסיר הפתיחה האחורי. Type-II פיפטה מצורף מזרק אחר ונוסף Type-פיפטה אני מחזיק את דרכי שורש axonal או. שימוש במזרק המצורף פיפטה מסוג II, aspirate aCSF כך aCSF שיורית רק מכסה את דרכי axonal (Fig.1C, 2C-D). ואז לסגת מסוג II פיפטה מ פיפטה סוג אני. לפקח על רמת aCSF במשך כמה דקות כדי לוודא חותם טוב על מערכת העצבים או axonal (ראה סעיף 3 של פתרון בעיות עבור "חותם טוב").
- ממיסים את הצבע בתוך aCSF או 0.2% טריטון X-100 במים מזוקקים פעמיים ולמשוך אותה פיפטה Type-II תוך שימת לב שלא לכלול בועות אוויר. הכנס Type-II פיפטה המכיל צבע לתוך סוג, אני פיפטה אל הפתרון aCSF שיורי (2E איור). לאט לאט לשחררצבע לתוך aCSF באמצעות לחץ חיובי עדין (איור 2F). להיזהר לא להציג את כל בועות האוויר או לגרום לעקירה של רקמת היעד מבפנים עצה. משיכה מסוג II פיפטה אחרי כמות מספקת של הצבע כבר פורסמו (3-5 μL של פתרון צבע).
4. דגירה
דגירה רקמות בחושך בין 6 עד 20 שעות בהתאם לסוג הניסוי. לאחר מספיק זמן כבר אפשר למלא, בעדינות להתרחק האלקטרודה מרקמות עוזב רקמות מוכן הדמיה או היסטולוגיה.
פתרון בעיות
- אם רקמת המטרה לא נכנס בקלות לתוך קצה סוג, אני פיפטה או רופף פעם אחת בפנים, אז בקוטר עצה הוא בגודל הלא נכון. במקרה זה, להוציא ולהשתמש פיפטה אחרת.
- לפני הוספת צבע כדי aCSF ב פיפטה סוג-I, ודא aCSF מספיק עדיין, כך שניתן יהיה להגיע עםמסוג II פיפטה עצה (איור 2 ד). שאם לא כן, הפער האוויר יהיה קיים פעם צבע נוסף. אם זה יקרה, אל תוסיף צבע ולהסיר את דרכי axonal מ טפטפת ואז למשוך אותו בחזרה עם aCSF מספיק כדי להגיע אליו פיפטה Type-II.
- אם רמת aCSF את סוג, אני עולה פיפטה לאחר להישאף עם פיפטה Type-II, פירוש הדבר כי החותם עם רקמות לא טוב. השתמש אלקטרודה שונה, אחרת הצבע יהיה מדולל במהלך ההליך תיוג.
- אם בועת אוויר מוחדר פיפטה סוג, אני תוך הזרקת צבע, לנקז את הבועה על ידי קידום קרוב Type-II פיפטה עצה לבעבע בעדינות הפעלת לחץ שלילי חלש שימוש במזרק המצורף.
5. נציג תוצאות
Motoneurons כדי להמחיש את היישום של השיטה, העמסנו בו זמנית, afferents חושיות interneurons השדרה עם dext 3 שונהרץ למוצרי מצומדות צבעי ניאון (איור 3 א). כפי שמודגם באיור. 3B, שלושה סוגים של נוירון מסומנים; afferents חושיות (אדום), interneurons מקרין לתוך חבל הטבור הגחון (ירוק) ו motoneurons (כחול).
באיור 1. סכמטי המציג פיפטה Type-I ו-II סוג הרכבה. (א) Type-אני פיפטה (אור כחול) מושם על בעל אלקטרודה, כך היא חזרה פתיחתו ניתן לחבר בקלות צינורות אלסטומר גמיש (ב ') שלתוכו Type-II פיפטה ניתן להכניס (C).
איור 2. סכמטי המציג את תהליך הטעינה של motoneurons עם צבעי ניאון. (א) פיפטה סוג, אני ממוקם ליד השורש הגחוני להתמלא. (ב) יניקה מוחל על פיפטה לצייר aCSF אל פיפטה ואחריו השורש. (C-D) נתק את צינור אלסטומר גמיש מ backend של פיפטה Type-I ו להפחית את כמות aCSF על ידי יישום יניקה כדי פיפטה Type-II. (ה) הכניסו את קצה פיפטה Type-II המכיל צבע מומס לתוך aCSF שנותר פיפטה סוג-I. (EF) לאט לאט למלא את סוג פיפטה, אני עם צבע ולאחר מכן הסר Type-II פיפטה.
איור 3. היישום של הליך מילוי לחוט השדרה עכבר בודד. (א) סכמטי המראה את סוג 3, אני טפטפות המשמש למילוי כיתות עצביים שונים בחוט השדרה. Motoneurons (כחול, כחול אשד dextran) ו afferents חושיות קודש (אדום, טקסס האדום dextran) היו backfilled דרך השורשים הגחון ועל הגב, בהתאמה. Fluorescein dextran שימש כדי לטעון interneurons השדרה (ירוק) אשר אקסונים לעלות דרך חבל הטבור הגחון (VF). 1 מ"ג של כל צבע dextran (10,000 מגוואט; בדיקות מולקולריות)פורקה ב 6 מים מזוקקים μL המכיל 0.2% טריטון X-100 (ב). התמונה confocal סעיף מחוט עצם העצה של חוט השדרה שבו הנוירונים חזרו שכותרתו כמתואר הערה א 'כי afferents חושיות שכותרתו הם ipsilateral בעיקר עם תחזיות הנגדי בלבד. את motoneurons שכותרתו הם ipsilateral לשורש הגחון מלא ואילו interneurons שכותרתו הם הנגדי לצד מילוי (ראש חץ). כיול בר 200 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
