טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון
Summary
אנו מתארים טכניקה פשוטה עלות נמוכה להכנסת ריכוז גבוה של צבעי ניאון וסידן רגיש אל הנוירונים או כל בדרכי העצבית באמצעות טפטפת יניקה פוליאתילן.
Abstract
תיוג מדרדר של נוירונים הוא אנטומי רגיל שיטת 1,2 כי שימש גם לטעון סידן מתח רגישים צבעים לתוך נוירונים 3-6. באופן כללי, צבעים חלים גם גבישים מוצקים או על ידי הזרקה בלחץ מקומי באמצעות בטפי להחדרת נוזלים זכוכית. עם זאת, זה יכול לגרום לדילול של עוצמת תיוג לצבוע מופחת, במיוחד כאשר כמה שעות נדרשים עבור דיפוזיה צבע. כאן אנו מדגימים טכניקה פשוטה בעלות נמוכה להכנסת צבעי ניאון ו יון רגיש אל הנוירונים באמצעות שאיבה פוליאתילן פיפטה פתרון מלא צבע. שיטה זו מציעה דרך אמינה לשמירה על ריכוז גבוה של צבע במגע עם אקסונים בכל הליך הטעינה.
Protocol
Dextrans פלורסנט שימשו ככלים אנטומיים לפעילות ההדמיה העצבית 1-4. שדות ואח', (2009) 4 שפורסם פרוטוקול ליישום יון מתח רגישים צובעת את שטחי axonal עם דגש על חוט השדרה כמערכת מודל. כאן אנו מתארים את הליך מפורט יותר על יישום צבע פלואורסצנטי ו / או יון רגיש השורשים הגח…
Discussion
<p class="jove_content"> אנחנו מתארים כאן פרוטוקול פשוט וחסכוני מציגה צבעים לתוך נוירונים, עצבים קטעי השדרה. שיטה זו כרוכה בחשיפת מסלולים אנטומיים המזוהים לפתרון צבע ריכוז גבוה למשך כל תהליך הטעינה. התוצאה היא תיוג מדרדר של אתר היעד עם רקע קצת לעומת microinjections, יישומים אמבטיה וטכניקות electroporation. עם זאת, שיטה מוגבלת …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content"> עבודה זו נתמכה על ידי תוכנית המיפוי של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ במכון הלאומי לבריאות. אנו רוצים גם להודות לד"ר ג'ורג' Mentis תרומות קודמות שלו לשיטה וכן את הנתונים באיור 3.</p
Materials
| Material Name | Company | Catalogue number | Comments | |
| Tubing | PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) | Clay Adams Brand Intermedic | 427421 | For Type I & Type II pipettes |
| NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) | PharMed BPT, Cole-Parmer | AY242002 | For Flexible tubing | |
| Syringe | 1ml insulin Syringe U-100 | Becton Dickenson | 329650 | |
| Needle | 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle | MONOJECT | 200136 | Connecting Type II pipette to syringe |
| Alcohol Lamp | ||||
| Stopcock | Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter | Baxter Healthcare Corp. | 2C6241 | Use with syringe |
| Holder | H-1 electrode holder | Narishige | H-1/12 | |
| Magnet stand | Narishige | GJ-8 | ||
| Micromanipulator | Narishige | M-3333 | ||
| Tweezers | S&T DUMONT Swiss 00632-11 | DUMONT | JF-5 TC | |
*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
- O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
Cite This Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).