Summary
Мы опишем простой и недорогой метод для внедрения высоких концентрациях люминесцентных и кальций-чувствительных красителей в нейронах или нейронных путей с помощью пипетки полиэтилена всасывания.
Abstract
Ретроградная маркировки нейронов является стандартным методом анатомического 1,2, что также используется для загрузки кальцием и напряжение чувствительных красителей в нейронах 3-6. Как правило, красители применяются в качестве твердых кристаллов или местных давление впрыска с использованием стеклянных пипеток. Тем не менее, это может привести к разбавления краски и снижения интенсивности маркировки, особенно, когда несколько часов, необходимых для красителей диффузии. Здесь мы показываем, простой и недорогой метод введения флуоресцентной и ионно-чувствительных красителей в нейроны с помощью пипетки полиэтилена всасывания заполнены раствором красителя. Этот метод предлагает надежный способ для поддержания высокой концентрации красителя в контакт с аксонами всей процедуры нагрузки.
Protocol
Флуоресцентные декстраны были использованы в качестве анатомических инструментов для работы с изображениями и активности нейронов 1-4. Поля и соавт. (2009) 4 опубликовал протокол для применения ионно-и напряжения чувствительных красителей аксонального путей с акцентом на спинной мозг в качестве модельной системы. Здесь мы опишем более подробный порядок применения люминесцентных и / или ионно-чувствительный краситель для сокращения вентральных корешков, спинного корнями или нейронных путей спинного мозга для экстракорпорального optophysiological и морфологических исследований.
1. Типа I и II типа пипетки
Для начала тянуть два коротких участках полиэтиленовых труб (PE90, Клей Адамс Марка) по пламенем спиртовки 7 производить пипетки с коническим советы. Одна пипетка (типа I) должны быть короткими (3-7 мм) с небольшой совет, который можно плотно держать корневой цели или путей (Внешний диаметр: 0,2-0,4 мм, внутренний диаметр: 0,1-0,3 мм). Затем потяните второй пипетки (тип-II) с более длительным (8-12 см) тоньше, вала и очень тонкий наконечник (Внешний диаметр: 0,2-0,3 мм, внутренний диаметр: 0,1-0,2 мм), который может быть вставлен в Type-я пипетировать насколько его кончик. Вторая тоньше пипетки будет использоваться для аспирации и внедрение искусственной цереброспинальной жидкости (aCSF) и раствора красителя соответственно от типа I пипетки.
2. Позиционирование типа I пипетировать
Проанализируйте и изоляции спинного мозга 8,9 и поместить его в ванну, superfused с охлажденной aCSF (~ 16 ° C) в течение всего процесса загрузки. Установите тип-I пипетировать на держатель электрода (H1/12 держатель электрода, Narishige), так что его спина открытие может быть легко подключен к шприца (1 мл U-100 инсулиновый шприц, Becton Dickenson или сопоставимых) с помощью гибкого шланга (Pharmed BPT, Коул-Parmer, # AY242002, 10 см) (рис. 1а, б).
3. Краска приложений
- С помощью шприца, первым делом обращаютaCSF в Type-я пипеткой (рис.1б, 2А), а затем аксонов путей или корень должны быть заполнены (рис. 2В). Гибкие шланги должны быть удалены с задней открытия. II типа пипетки прикреплен к другой шприц и вставляется в Type-я пипетировать проведения аксонального путей или корня. С помощью шприца прикреплены к типу II пипетки аспирата aCSF так, что остаточные aCSF просто охватывает аксонов тракта (Fig.1C, 2C-D). Затем снять типа II пипетки от типа я пипетки. Мониторинг aCSF уровне в течение нескольких минут, чтобы проверить герметичность на аксонов или нервов тракт (см. раздел 3 Устранение неполадок "хорошее уплотнение").
- Растворить краситель в aCSF или 0,2% тритона Х-100 в дистиллированной воде и провести его в Type-II пипетки, одновременно уделяя внимание не включать пузырьков воздуха. Вставьте типа II пипетки содержащей краситель в Type-я пипетки и в остаточной решение aCSF (рис. 2Е). Медленно отпуститекрасителя в aCSF помощью нежных положительным давлением (рис. 2F). Будьте осторожны, чтобы не вводить никаких пузырьков воздуха или вызвать смещение ткани-мишени внутри наконечника. Вывод второго типа пипетки, после достаточного количества красителя был выпущен (3-5 мкл раствора красителя).
4. Инкубация
Инкубируйте ткань в темной от 6 до 20 часов, в зависимости от типа эксперимента. После достаточного времени был разрешен для заполнения, мягко отстраниться электрод из ткани оставляя ткань готова для работы с изображениями или гистологии.
Поиск и устранение неисправностей
- Если ткани-мишени не входит легко в кончик типа I пипетки или свободные, проникая внутрь, затем кончиком диаметром неправильный размер. Если это произойдет, тянуть и использовать различные пипетки.
- Перед добавлением красителя aCSF в тип-I пипетки, чтобы убедиться, что достаточно aCSF остается, так что она может быть достигнута сII типа пипетки (рис. 2). В противном случае воздушный зазор будет существовать только краситель добавляется. Если это произойдет, не добавляют красители и удалить аксонов пути из пипетки, а затем сделать его обратно в достаточной aCSF должны быть достигнуты к II типа пипетки.
- Если уровень в aCSF типа I увеличивается пипетки после того, как отсасывали с Type-II пипетки, это означает, что печать с ткани не есть хорошо. Использование различных электродов, иначе краска будет разбавлять в маркировке процедуры.
- Если воздушный пузырь вводится типа I пипетки при введении красителя, слейте из пузыря путем продвижения II типа пипетки близко к пузырь и аккуратно применяя слабые отрицательные давления, используя прилагаемый шприц.
5. Представитель Результаты
Для иллюстрации применения метода, мы одновременно загружаемых мотонейронов, сенсорных афферентов и спинного интернейронов с тремя различными Dextпобежал конъюгированных флуоресцентных красителей (рис. 3А). Как показано на рис. 3B, три класса нейронов помечены; сенсорных афферентов (красный), интернейронов, выступающих в брюшной канатика (зеленый) и мотонейронов (синий).
Рисунок 1. Схематическое изображение пипетки типа I и II типа сборки. (A) типа I пипетки (голубой) помещается на держатель электрода так, чтобы он вернулся открытие может быть легко подключен к гибкому шлангу эластомер (б) и в котором Type-II пипетки можно вставить (C).
Рисунок 2. Схематическое изображение процесса загрузки мотонейронов с флуоресцентными красителями. (A) типа I пипетка находится рядом с вентральной корень должны быть заполнены. (Б) всасывания применяется к пипеткой сделать aCSF в пипетку следует корня. (C-D) Отсоедините гибкий шланг из эластомеров бэкэнда типа I пипетки и уменьшить количество aCSF применяя всасывания типа II пипетки. (E) Вставьте конец II типа пипетки содержащих растворенный краситель на оставшиеся в aCSF типа I пипетки. (EF) Медленно заполнить типа I пипетки с красителем, а затем удалить II типа пипетки.
Рисунок 3. Применение процедуру заполнения в изолированных мышей спинного мозга. (А) Схематическое изображение трех типов I пипетки используются для заполнения различных классов нейронов в спинном мозге. Мотонейронов (голубой, синий Каскад декстран) и сакральное сенсорных афферентов (красный, штат Техас, Красная декстран) были засыпаны через брюшной и спинной корни, соответственно. Флуоресцеина декстрана используется для загрузки спинного интернейронов (зеленый) аксоны которых поднимаются через брюшную канатика (VF). 1 мг каждый декстран красителя (10000 МВт, Molecular Probes)растворяют в 6 мкл дистиллированной воды, содержащей 0,2% Тритон Х-100 (B). Конфокальной образ раздела с сакральным шнур спинного мозга, в которых нейроны вернулись, помечены как описано в А. Отметим, что меченые сенсорных афферентов, прежде всего, ипсилатерального с несколькими контралатеральной проекции. Помечены мотонейроны являются ипсилатерального в заполненном вентральной корень в то время как меченый интернейронов являются контралатеральной в сторону заполнения (стрелки). Калибровка бар 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
References
- Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- McPherson, D. R., McClellan, A. D., O'Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
- Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O'Donovan, M. J.
- O'Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
- Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O'Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
- Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
- Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
- Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W.
- Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O'Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
- Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
- Blivis, D., Mentis, Z., O'Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
- O'Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
- Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
- Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).
