Summary

Ретроградная Загрузка нервов, урочища, и корешков спинного мозга с флуоресцентными красителями

Published: April 19, 2012
doi:

Summary

Мы опишем простой и недорогой метод для внедрения высоких концентрациях люминесцентных и кальций-чувствительных красителей в нейронах или нейронных путей с помощью пипетки полиэтилена всасывания.

Abstract

Ретроградная маркировки нейронов является стандартным методом анатомического 1,2, что также используется для загрузки кальцием и напряжение чувствительных красителей в нейронах 3-6. Как правило, красители применяются в качестве твердых кристаллов или местных давление впрыска с использованием стеклянных пипеток. Тем не менее, это может привести к разбавления краски и снижения интенсивности маркировки, особенно, когда несколько часов, необходимых для красителей диффузии. Здесь мы показываем, простой и недорогой метод введения флуоресцентной и ионно-чувствительных красителей в нейроны с помощью пипетки полиэтилена всасывания заполнены раствором красителя. Этот метод предлагает надежный способ для поддержания высокой концентрации красителя в контакт с аксонами всей процедуры нагрузки.

Protocol

Флуоресцентные декстраны были использованы в качестве анатомических инструментов для работы с изображениями и активности нейронов 1-4. Поля и соавт. (2009) 4 опубликовал протокол для применения ионно-и напряжения чувствительных красителей аксонального путей с акцентом н…

Discussion

<p class="jove_content"> Мы описываем здесь простой и экономически эффективный протокол для введения красителей в нейроны, нервы и спинной путей. Этот метод включает в себя разоблачение определены анатомические пути к высококонцентрированным раствором красителя на время процесса загрузки. Это приводит к р…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

<p class="jove_content"> Эта работа была поддержана очной программы Национальных институтов неврологических расстройств и инсульта Национального института здоровья. Мы также хотели бы поблагодарить д-ра Джорджа Mentis за его вклад в ранее метод и данные на рисунке 3.</p

Materials

Material Name Company Catalogue number Comments
Tubing PE90 (IDxOD:0.034″x0.050″; Wall Thikness:0.008″) Clay Adams Brand Intermedic 427421 For Type I & Type II pipettes
NSF-51(IDxOD:1/16×1/8; Wall Thikness:1/32) PharMed BPT, Cole-Parmer AY242002 For Flexible tubing
Syringe 1ml insulin Syringe U-100 Becton Dickenson 329650  
Needle 19G x1-1/2″ Metal Hub Needle MONOJECT 200136 Connecting Type II pipette to syringe
  Alcohol Lamp      
Stopcock Three-way Stopcock with Male Luer Slip Adapter Baxter Healthcare Corp. 2C6241 Use with syringe
Holder H-1 electrode holder Narishige H-1/12  
Magnet stand Narishige GJ-8  
Micromanipulator Narishige M-3333  
Tweezers S&T DUMONT Swiss 00632-11 DUMONT JF-5 TC  

*Those are suggested materials. Can be replaced with any compatible products

References

  1. Nance, D. M., Burns, J. Fluorescent dextrans as sensitive anterograde neuroanatomical tracers: applications and pitfalls. Brain Res. Bull. 25, 139-145 (1990).
  2. Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
  3. McPherson, D. R., McClellan, A. D., O’Donovan, M. J. Optical imaging of neuronal activity in tissue labeled by retrograde transport of Calcium Green Dextran. Brain Research Protocols. 1, 157-164 (1997).
  4. Fields, D. R., Shneider, N., Mentis, G. Z., O’Donovan, M. J. Imaging nervous system activity. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 2, Unit 2.3 (2009).
  5. O’Donovan, M. J., Ho, S., Sholomenko, G., Yee, W. Real-time imaging of neurons retrogradely and anterogradely labelled with calcium-sensitive dyes. J. Neurosci. Methods. 46, 91-106 (1993).
  6. Wenner, P., Tsau, Y., Cohen, L. B., O’Donovan, M. J., Dan, Y. Voltage-sensitive dye recording using retrogradely transported dye in the chicken spinal cord: staining and signal characteristics. J. Neurosci. Methods. 70, 111-120 (1996).
  7. Garudadri, S., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology II: Extracellular Suction Electrode Fabrication. J. Vis. Exp. (48), e2580 (2011).
  8. Smith, J. C., Feldman, J. L. In vitro brainstem-spinal cord preparations for study of motor systems for mammalian respiration and locomotion. J. Neurosci. Methods. 21, 321-333 (1987).
  9. Meyer, A., Gallarda, B., Pfaff, S., Alaynick, W. Spinal Cord Electrophysiology. J. Vis. Exp. (35), e1660 (2010).
  10. Shneider, N. A., Mentis, G. Z., Schustak, J., O’Donovan, M. J. Functionally reduced sensorimotor connections form with normal specificity despite abnormal muscle spindle development: the role of spindle-derived neurotrophin 3. J. Neurosci. 29, 4719-4735 (2009).
  11. Mentis, G. Z. Early functional impairment of sensory-motor connectivity in a mouse model of spinal muscular atrophy. Neuron. 69, 453-467 (2011).
  12. Blivis, D., Mentis, Z., O’Donovan, J. M. G., Lev-Tov, A. Studies of sacral neurons involved in activation of the lumbar central pattern generator for locomotion in the neonatal rodent spinal cord. Soc. Neurosci. Abstr. 564.8, (2009).
  13. O’Donovan, M. J. Imaging the spatiotemporal organization of neural activity in the developing spinal cord. Dev. Neurobiol. 68, 788-803 (2008).
  14. Kasumacic, N., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Segmental patterns of vestibular-mediated synaptic inputs to axial and limb motoneurons in the neonatal mouse assessed by optical recording. J. Physiol. (Lond). 588, 4905-4925 (2010).
  15. Szokol, K., Glover, J. C., Perreault, M. -. C. Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse. J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).

Play Video

Cite This Article
Blivis, D., O’Donovan, M. J. Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (62), e4008, doi:10.3791/4008 (2012).

View Video