PCRによる日30ブタ胚の正確かつフェノールフリーDNA雌雄鑑別

Abstract

豚における出生前のプログラミングの研究は、胚または胎児の性別が発達アウトカムに影響を与えることができることを示しています。したがって、胚の性別を決定する能力は、特に初期の開発に関する多くの実験に必要です。本プロトコルは、PCRで使用するための豚ゲノムDNAの、安価で迅速かつ非毒性の製造を示します。 30日目の胚は、人道的に存在するプロトコルのために施設内動物政策と福祉委員会によって確立されたガイドラインに従って収集されなければなりません。このPCRベースの雌雄鑑別技術のための全胚の作成は、単純にあらかじめ冷却し、乳鉢と乳棒を用いて微細な粉末に凍結した胚を粉砕することを含みます。 PCR品質のDNAをアルカリ溶解試薬ホットインキュベーションを適用することによって、胚の粉末の少量から放出されます。次に、DNA溶液を中和緩衝液と混合し、PCRに直接使用しました。二つのプライマー対はdetecに生成されます高精度と特異性を有するX-染色体のY-染色体（SRY）とZFX領域の領域を決定トン特定セックス。同じプロトコルをまた、30日目より前の他の細長い胚（14日目まで10日目）に適用することができ、胚の多数をスクリーニングする自動化が可能作り、高場合、このプロトコルは、96 welledプレートで実施することができますスループットセックスタイピング。

Introduction

家畜ブタはヒトおよび家畜の分野での開発、遺伝学や栄養学の基本的な研究テーマとなっています。人間の研究のための生物医学モデルとして豚の電位は、それらの生理学的類似性に起因することができます。家畜では、性比の操作は、選択と遺伝的改良プログラム¹の有効性を高めることができます。個々の胚を雌雄鑑別することは、遺伝子型、エピジェネティクスと初期胚の発育²時の性的二型のX不活性化を含むがこれらに限定されない多くの実験的調査に使用される基本的なツールです。

マウスでの研究は、母体の食事やその他の要因は男女の不均衡³をもたらし得ることを示唆しています。豚では、男女比の不均衡の原因は父方の品種^4、子宮容量⁵と、母豚の代謝条件^{6が含まれます} 。胚および同腹仔で観察された差異は、それ自体によって影響され得るのでxual二形は、研究者が自分の研究に関する結論を描画する前に胚のセックスと性比に注意する必要があります。開発の30日目にブタの胚を雌雄鑑別するための効率的なツールやプロトコルの開発は、ここで議論されます。

セックスタイピングの様々な方法がモデル生物と家畜の遺伝的研究のために開発されてきました。特に家畜で、男性と女性の初期胚を識別することは繁殖プログラムのための遺伝子選択性を高めるために非常に一般的です。ギムザ⁷または^8,9の技術はセックスタイピングのために使用されている強い蛍光を使用して、ブタにおける初期胚の染色体分析。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、迅速かつ正確に胚の多数をスクリーニングするには適していません。

最も効果的な性別のタイピング方法は、熱安定性DNAポリメラーゼおよびプライマーの対を用いてDNAの増幅です。 PCR法によるDNAの雌雄鑑別は、o-、より、具体的な迅速かつ高感度でありますNLY細胞物質の微量を必要とします。最初のPCRベースの胚性判別は、ヒト^10、およびそれ以降のマウスでは^11、牛^12、水牛¹³と羊¹⁴着床前胚で実施しました。豚では、最古のDNAのセックスタイピング法は、Y染色体特異的なDNAプライマー¹⁵の単一の対を介して着床前胚のために設立されました。しかし、性別決意のための最も一般的なPCRプライマーは、雄特異的なSRY遺伝子¹⁶とXとY染色体¹⁷の両方に位置するジンクフィンガー遺伝子の非性別判別領域のY染色体から選択しました。その後、これらのプライマーは、ジンクフィンガー遺伝子の唯一のX-染色体を検出するためのプライマーの改善された特異性を持つこの研究で30日目の胚の性別を決定するために適用されてきました。

ブタ着床前胚からのゲノムDNAをproteinasでバッファする無傷の胚盤胞を露出することによって抽出することができますE K ¹⁶または¹⁵個々の初期卵割胚から少数の細胞の生検を取り、直接PCRのためにそれらを使用します。しかし、大きさが数センチメートル以上ブタ血液、毛髪、組織または大受胎からのDNAの放出を効果的にプロテイナーゼK法を使用して行われていません。これらの材料のためのDNAの抽出方法は、時間がかかり、フェノール/クロロホルムプロトコル⁶または高価な列ベースのキット¹⁸のいずれかを使用して確立されています。潜在的に有害な化学物質の使用を回避するために、安価で、簡単で、フェノールを含まないDNA抽出方法を開発する傾向があります。マウス¹⁹およびゼブラフィッシュ²⁰組織からのPCR品質のゲノムDNAを単離するためのプロトコルのこのタイプのホット水酸化ナトリウム及びトリス（ホットショット）を使用して確立されています。本研究では、変更された名手でDNAを得るためのプロトコルを提供し、日の細胞溶解物から直接で30ブタ胚を入力してPCRのセックス二重のプライマー対を再設計しました高精度。

Protocol

動物実験のガイドラインにカナダの評議会によると、および学部アニマル政策と福祉委員会の承認を得て - ア​​ルバータ大学の家畜、妊娠中の雌豚は、妊娠と胚の30を回収した約デーで訓練を受けたスタッフにより安楽死させました。手順の間にすべての回で検査用手袋を使用してください。

1.サンプル収集およびサンプル保管

1. 放血に続いてキャプティブボルトを使用して雌豚を安楽死させます。各安楽死させた雌ブタから生殖器および胚を収集するために、検査用手袋を着用してください。
   注：氷や液体窒素を乾燥させるサンプルと移植胚の急速なコレクションは、マイクロアレイや定量PCRなどの他の分子作品のための高品質の組織になります。
2. 子宮を解剖し、静かに、基礎となる子宮壁²¹から自分の胚体外胎盤膜内のすべての胚を分離します。何の母体組織の汚染がないことを確認してください。
3. リ凍結前に、すべての実行可能な胚のコードの長さと重さ。
4. 各個々の胚を収集し、すぐにスナップを液体窒素で凍結する前に、アルミホイルでそれを包みます。
5. 直接-80℃の冷凍庫に液体窒素から凍結した胚を移します。

2.研削胚

1. 分析されるサンプルの数に必要な検体IDと全てのサンプル試験管（15ml）にラベル。
2. 半分にドライアイスと熱的にコンテナを記入し、ドライアイスで予め標識試料管を挿入します。
3. ドライアイスの容器に℃の冷凍庫-80からあらかじめ冷却モルタルおよび乳棒を転送するために上に検査用手袋の別のペアで冬の手袋を着用してください。
4. ドライアイス上のモルタルの内側に凍結した胚を置きます。
5. 胚をカバーし、微粉末に乳棒でそれを粉砕するのに十分な液体窒素を注ぎます。
6. MICRで予め標識したサンプル管に胚の粉末を移しますospatula（ 図1）し、-80℃の冷凍庫にチューブを配置します。
7. 各胚のためのクリーンあらかじめ冷却し、乳鉢と乳棒を使用して、サンプル間の交差汚染を避けるために、各胚を研削した後、検査用手袋を変更します。

変更された水酸化ナトリウム法を用い3.ゲノムDNAの準備

1. サンプルの数のために必要なラベル全て微小遠心管（1.5ml）を分析します。
2. 前の出発にドライアイスの入った容器にから胚粉末を含むサンプルチューブ-80℃の冷凍庫を転送します。
3. 各前標識されたマイクロ遠心チューブに50mMのNaOHで（水酸化ナトリウム）の180μLをピペット。
4. 95℃までインキュベーターと予熱をオンにします。
5. 50mMのNaOH溶液を含む前標識されたマイクロチューブにサンプル管から胚粉末の正確な量（約5〜10 mg）を（ 図2）を転送するためにつまようじを使用してください。
6. Uを引いゆっくりと粘着性、ねばねば、白い透明状物質（ 図3）のようにDNA溶解液を可視化するPと同じつまようじ。
7. 5分間95℃で予備加熱したインキュベーターにDNA溶解液でマイクロ遠心チューブを転送します。直ちに氷で満たされた発泡スチロールの箱にチューブを移します。
8. 直接マイクロ遠心チューブに1 Mトリス塩酸の20μLを加え、穏やかにチューブをタップして、それを混ぜます。 pHは遠心分離前に約8.0（ 図4）であることを確認するためにpH試験紙を使用してください。
   注：サンプル調製の多数を扱う場合には、ランダムにpH値を確認するために、いくつかのサンプルを選択するために許容可能です。
9. 未溶解組織片を除去するために、室温で2分間微量で2000×gでDNA溶解液でチューブを遠心。
10. 新しいチューブまたは96ウェルプレートにトップ透明な上澄み150μlのを転送します。
    注意：明確なDNA溶解液は、PC内のテンプレートとして使用する準備ができていますRの反応、それは2週間、4℃で安定である、またはそれは年間-20℃で保存することができます。

4.デザインセックス特異的PCRプライマー

1. NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.govからブタ性別決定領域Y（SRY）のためのアクセッション番号（NM_214452.3）と、亜鉛フィンガータンパク質のX連鎖（ZFX）遺伝子（XM_005673501.1）を取得/。
2. コピーし、オンラインプライマー設計ツールにこれらのNCBIアクセッション番号を貼り付けます。
   注：長さを含む最高のプライマー情報、TmとGC％だけでなく、PCR産物のサイズ（bp）が、コンピュータの画面（ 図5）で生成されます。
3. これらの配列のみをそれぞれSRYとZFX（ 図6）のために、XとY染色体上に位置していることを確認するために、現在のブタゲノムデータベース104に対してヌクレオチドBLASTプログラム（BLASTN）を使用して、これらのプライマーの特異性を検証します。

直接DNA溶解物から5.ゲノムDNAをPCR

1. 使用15μlのPCR反応の鋳型としてDNAの溶解物のみ1μlの。
   注：96ウェルプレートPCRのためのハイスループットスクリーニング方法は、マルチチャンネルピペットを用いて同様に行うことができます。
2. ちょうど最初のPCRのために次の操作を行います。商業的に入手知らセックスブタのゲノムDNAの1μL（0.5 ngの）を追加することにより、鋳型なしの陰性対照および陽性対照用の2つの追加のチューブのための1つのPCRチューブを準備します。その後、ポジティブコントロールとして最後に成功した雌雄鑑別分析からサンプルを含み、セックス決意のための新たなPCR反応と一緒に実行されます。
3. 任意のHotStartの準備ができてミックスPCR酵素を使用して、PCR反応の合計数に応じてプライマーおよびヌクレアーゼフリー水を添加することにより、マスターミックスを準備します。 PCRマスターミックスの14μlの既存のPCRチューブにDNA溶解液を1μlを追加します。 2性別特異的遺伝子からプライマーの最終濃度は15μlのPCR Rの合計で0.3μMであるようにプライマーを追加します。eaction。
4. サーマルサイクラーで、以下のPCRプログラムをセットアップします：3分、95℃35サイクル15秒の伸長工程に続いて65℃で15秒のアニーリングステップに続いて20秒の溶融工程98°C、各72℃。最後のステップにおいて、72℃で1分間、反応をインキュベートし、性別を決定するために、ゲル電気泳動の検証のためのPCRチューブを除去するまで4℃でインキュベートし続けます。
   注：PCR条件および最適化は、 材料表に記載されたPCRキットのマニュアルに従ってあります。
5. 2％TBEアガロースゲルを調製する場合、非毒性緑蛍光SYBR DNAゲル染色の適切な量を追加します。
   注：それは利用できない場合エチジウムブロマイドは、緑色蛍光染色のために置換することができます。
6. PCRチューブにローディング色素（10倍）の1.5μlを添加して、PCR反応緩衝液アップダウンをピペッティングしてよく混ぜます。
7. ウェルおよびRへの試料の負荷を10μl（染料バンドがゲルを通って途中で実行されるまで、小さなゲル装置100 V、150 Vで96ウェルのゲル装置で）適切な電圧設定で未アガロースゲル。
8. 観察し、レーザースキャナを用いて蛍光灯の設定の下でバンド強度を調整し、ゲルの画像を取り込みます。注意：一般的なゲルイメージャは、エチジウムブロマイドゲルの代わりに用いることができます。
9. 女性としての一つのバンドと男性のような2つのバンド（ 図7）で胚を識別することにより、ブタ胚の性別を決定します。

Representative Results

PCRによって345 DNA溶解物スクリーニングから性別決意の代表的結果を図7 に示し、表1に要約します。

図7に見られるように、65℃でのプライマーアニーリング温度が異なるサンプル間で同様の強度及び述語アンプリコンサイズ（ 図5）を生成する 。このPCRプロトコルにおける最適条件です。

SRY（400塩基対）とZFX（506塩基対）の二つの増幅産物をゲル画像（ 図7）に示されています。男性の胚は、上（400塩基対）の正しいサイズと下部（506 bp）のバンドと2つのDNA断片を示しました。これら二つのバンドの強度はほとんどの男性個体において同じであることが示されました。すべての女性の胚のみに位置ZFX遺伝子に対応する単一のDNA断片を示しました。X染色体。

修正された50mMのNaOHをから得られたDNA溶解物は、高い成功率と精度とのPCRのために直接使用することができます。 DNA溶解物は、345胚をスクリーニングした後、任意のPCR反応阻害を示しませんでした。唯一の3人は、有性なかったと雌胚の割合は、男性（ 表1）よりわずかに高かったです。

図1： 胚パウダー転送 15mlチューブに胚の粉を転送します。

図2：つまようじを持つ胚パウダーを収集し、転送 （A）胚粉末付着の過剰な量を爪楊枝に。 （B）の正確な量爪楊枝に付着した胚粉末をアルカリ溶解試薬溶液に転送されます。 （C）つまようじに付着した胚粉末の量が不十分。

図3：DNAの可視化技術は、ゆっくりと胚のDNAは粘着性のねばねばした白い透明状物質として溶解しているかどうかを判断するために、胚の粉末を添加した後、爪楊枝を引き上げ。

図4：pH を確認水酸化ナトリウム（アルカリ溶解試薬 ​​）溶液（A）のpHは12.0です。 （B）の溶解緩衝液に加えて中和バッファーた後、pH紙の色表示が緑色であり、pHは約8.0であるべきです。

図5：。。 セックス特異的プライマーの情報シーケンス名、配列およびプライマー設計ツールから得られたアンプリコンの長さは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図6：ZFX遺伝子に指定された前方のX染色体とY（A）ロケーション上ブタセックス特異的プライマーのマッピングおよび逆プライマー。 （B）前方の場所とSRY遺伝子に指定されたプライマーを逆転させた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図7：30 日目胚からブタセックス特異的遺伝子のPCR増幅既知の陽性コントロールとSYBRのDNAゲル染色で染色した2％TBEアガロースゲルは、男性と女性のシンボルで示されています。 2つのバンドが、男性と女性のような単一のバンドとして示されています。レッドスターは、SRY Y特異的プライマーによる上部バンド（506 bp）のPCR産物に比べて非常に弱い下のバンド（400 bp）の外観とうまく可能な試料汚染を示しました。赤い矢印は、テンプレートなしのPCR陰性対照を示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

PCRを雌雄鑑別	胚の数
♀	185	53.60パーセント
♂	157	45.50パーセント
不明	3	0.90パーセント
合計	345	100％

表1：345 日30胚のうち、PCR雌雄鑑別後の男性と不明女性の割合。

Discussion

ブタ胚のDNAセックスタイピングに関連する既存のプロトコルのほとんどは早期着床前段階^15,16に適しています。我々が正常に妊娠後期の間、ブタ胚のスクリーニングに適したプロトコルを開発しました。以前の研究^6,18からの胚の同様の発達段階での研究に基づき、本プロトコルは、安全で低コストであると考えられています。

このプロトコルは、96ウェルプレートにDNA溶解物を転送することによって、PCRを用いて性別タイピングのための多数のサンプルに適しています。プレートフォーマットは、マルチチャンネルピペットを使用して、PCR反応のためのDNA溶解物転写1μlのを可能にすることにより、ハイスループットスクリーニングを可能にします。

しかし、手続きに関与するいくつかのステップが慎重に行われるべきです。より効率的に修正された50mMのNaOHの溶解方法を実行するために、個別に凍結胚を微粉末に接地されなければなりません予備冷却（-80°C）を乳鉢と乳棒を使用して。 図1に示すように、静かに、ゆっくりと15ミリリットルチューブに粉を掻き取って、ドライアイス上胚の粉をこぼさないようにしてください。各サンプルの後に検査用手袋を変更する非常に別の胚サンプルに移す手袋に粉末を避けることをお勧めします。

胚粉末の適切な量を修正50mMのNaOHを溶解溶液に添加することは 、図2Bに示されている。胚粉末の過剰量は、 図2Aに示され、回避されるべきです。同様に、 図2Cに 、胚粉末の量は、下流の手続きのためには不十分である可能性があります。各試料について胚の粉末を計量することは可能ではあるが百以上の胚を含む大規模な研究で胚の性別をスクリーニングする場合、それは現実的ではありません。

DNAの量は目に見えてスティッキーGを確認するために爪楊枝を使用して検証することができます粉末の適切な量は、前のステップで追加されたかどうかは疑問である場合、 図3に示すようにooey状物質。

中和溶液の適切な量を添加して、胚の粉末を溶解後に重要である。 図4は、後に、中和溶液を添加する前にpH変化を示す図 。このステップは、pHが弱アルカリ性（8.0付近）、したがって、ほとんどのPCR反応緩衝液に似ていることを確認することが重要です。

オリゴプライマーの特異性は、PCR中のDNAの雌雄鑑別の精度のために最も重要な要素です。オリゴプライマーの特異性は、NCBI BLASTNプログラムを介して確認することができます。単一の位置は、女性の各プライマー配列（ 図6A）のためのZFX遺伝子の3 '非コード領域におけるX染色体上に検出されます。同様の状況は、図6B（のみSRY遺伝子のコード領域におけるY染色体上に検出され

すべてのステップが注意深く、正しく続行するとき、 表1に示すように、無雌雄の判別に起因するエラーレートが非常に低い（<1％）である可能性があります。しかし、いくつかのまれなケースでは、2つの異なるサンプルのDNA溶解物間の相互汚染が可能であり、ゲル中のレッドスター（ 図7）で示されるように、PCRによって検出することができます。女性におけるバンドパターンのこのタイプの男性試料との交差汚染のように解釈することができます。

非常にかすかな低いバンドの出現がPCR試薬用プライマー競争によるものであることはほとんどありません。この場合、SRY遺伝子に関連するより小さなアンプリコン（400 bp）がZFX遺伝子に対応する、より高い帯域よりも速く、よりPCR産物を生成します。このプロトコルでは、一つの欠点は、女性と男性のサンプルの交差汚染の決意です。私たちの主な目標は、小さな、各標的遺伝子のコピー数の定量化ではありませんので女性のサンプルからの粉末の量は、ゲル上で可視化することは容易ではないであろう。

ここで紹介するDNAの雌雄鑑別プロトコルは、妊娠後期の間、胚の性別を識別するための最もコスト効果的な方法であり、そのような牛、ヤギやヒツジなど他の大型家畜動物にも適用することができます。また、類似のDNAの雌雄鑑別方法は、雌ブタの代謝状態¹⁸に関連するブタに適用されています。 DNAの雌雄鑑別を使用して、別の研究調査は、豚²²で生後発達の出生前のプログラミング中にゲノムインプリンティングのメカニズムを研究するために適用することができます。 DNAのPCR雌雄鑑別を使用して、家畜における幅広いアプリケーションには、このような前性別選択育種プログラム、および栄養のエピジェネティックな影響や感染症などの可能性です。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
KAPA HiFi HotStart Ready Mix PCR kit	KAPABiosystems	KR0370	other Hot Start Taq polymerase can be used after optimization
SYBR Safe DNA Gel Stain	Life Technologies	S33102	Ethidium bromide can be substituted for SYBR Safe
Pig female and male genomic DNA	Zyagen	GP-160-F1 & GP-160-M5	Postive controls from the tissues of known sex DNA can be used.
Typhoon FLA 9500 laser scanner	GE Healthcare Life Sciences	28-9969-43	other imaging system can be used
Free Soft Nitrile Examination Gloves	WWR	89038-270	any other examination glove can be used
Sodium hydroxide, solid	Fisher	BP 359 -212	Molecular Biology Grade
Eppendorff DNA LoBind Tubes, 1.5 ml, PCR clean	Eppendorff	0030 108.051	heat resistant
ThermoStat plus	Eppendorff	22670204	Use as a incubator for 95 °C , don't need to use the heater
Toothpick	Bunzl Plc	75200815	Any round wooden toothpicks can be used - quality wood
Microcentrifuge 5417R/5417C	Eppendorff	22621807	This model was discontinued. But another newer model can be used
Microspatula	Fisher	SDI28540115	Autoclaved before use each time.