Summary
在本研究中，我们描述了从钙化主动脉瓣新鲜样品中分离T淋巴细胞的过程，以及使用流式细胞术分析表征适应性白细胞亚群的T细胞克隆的分析步骤。
Abstract
钙化主动脉瓣疾病 （CAVD） 是一种活动性疾病过程，从瓣膜轻度增厚到严重钙化，尽管存在新的治疗选择，如经导管主动脉瓣置换术 （TAVR），但死亡率较高。
从瓣膜钙化开始并导致严重主动脉瓣狭窄的完整途径仍然部分了解。通过提供体内主动脉瓣细胞的密切表示，从狭窄瓣膜组织中测定T淋巴细胞可能是阐明它们在钙化发展中的作用的有效方法。手术切除后，将新鲜的主动脉瓣样品小块解剖，培养T淋巴细胞，克隆，然后使用荧光活化细胞分选（FACS）进行分析。
染色过程简单，染色管也可以使用0.5%的多聚甲醛固定，并在15天后进行分析。从染色面板产生的结果可用于跟踪与干预相关的T细胞浓度随时间的变化，并且可以很容易地进一步开发以评估感兴趣的特定T细胞亚型的活化状态。在这项研究中，我们展示了在新鲜钙化主动脉瓣样品上进行的T细胞分离，以及使用流式细胞术分析T细胞克隆的步骤，以进一步了解适应性免疫在CAVD病理生理学中的作用。
Introduction
钙化主动脉瓣疾病（CAVD）是最常见的心脏瓣膜疾病之一，对医疗保健有很大影响。在过去几年中，主动脉瓣置换术的频率急剧增加，并且由于老年人口不断增长，预计还会进一步增加1。
CAVD 的潜在病理生理学仅部分了解，目前的治疗策略仅限于保守措施或通过手术或经皮手术进行主动脉瓣置换术。迄今为止，除非进行主动脉瓣置换术 （AVR），否则没有有效的药物治疗可以阻碍或逆转 CAVD 的进展，并且高死亡率与早期症状发作相关2。在重度症状性主动脉瓣狭窄患者中，据报道，3 年无症状生存率低至 20%3。经导管主动脉瓣置换术（TAVR）代表了一种新的选择，彻底改变了高危患者的治疗，特别是在老年人中，并大大降低了死亡率，死亡率在该人群中本质上是很高的4，5，6。尽管TAVR取得了有希望的结果，但还需要进一步的研究来了解CAVD病理生理学，以确定新的早期治疗靶点7，8，9。
CAVD以前被认为是一种被动的退行性过程，现在被认为是一种主动进行性疾病，其特征在于主动脉瓣间质细胞的成骨细胞表型切换10。这种疾病涉及进行性矿化，纤维钙化变化和主动脉瓣运动减弱（硬化症），最终阻碍血流导致主动脉瓣开口变窄（狭窄）11。
炎症被认为是CAVD病理生理学的关键过程，类似于血管动脉粥样硬化的过程。内皮损伤可导致脂质种类的沉积和积累，尤其是主动脉瓣中的氧化脂蛋白12。这些氧化的脂蛋白引起炎症反应，因为它们具有细胞毒性，炎症活性导致矿化。最近强调了先天免疫和适应性免疫在CAVD发展和疾病进展中的作用13。在 CAVD 和矿化主动脉瓣小叶患者中，已经记录了记忆 T 细胞特定亚群的激活和克隆扩增，因此炎症过程被认为至少参与 CAVD 的发展，并且可能也参与疾病进展14。事实上，尽管健康瓣膜和患病瓣膜中都存在抗原呈递细胞和巨噬细胞，但 T 淋巴细胞的存在表明主动脉瓣老化和患病。这种淋巴细胞浸润以及新生血管形成和化生的增加是CAVD15的特征性组织学体征。
我们假设主动脉瓣间质细胞与免疫系统激活之间存在相互作用，这可能触发主动脉瓣中慢性炎症过程的开始。从狭窄的主动脉瓣组织中测定T细胞可能是阐明它们在钙化发展中的作用的有效方法，因为它可以提供体内主动脉瓣细胞的密切表示。在目前的工作中，使用主动脉瓣组织，我们分离T淋巴细胞，培养和克隆它们，然后使用荧光激活细胞分选（FACS）表征它们。从因严重主动脉瓣狭窄而接受手术瓣膜置换术的CAVD患者中切除新鲜主动脉瓣样本。手术切除后，将新鲜瓣膜样品小块解剖，培养T细胞，克隆，然后使用流式细胞术进行分析。染色过程简单，染色管可以使用0.5%的多聚甲醛固定，并在15天后进行分析。从染色面板生成的数据可用于跟踪与干预相关的T淋巴细胞分布随时间的变化，并且可以很容易地进一步开发以评估感兴趣的特定T细胞亚群的活化状态。
由于自发荧光等问题，钙化组织的提取，从钙化组织中分离白细胞，特别是在这种类型的组织上使用流式细胞术可能具有挑战性。很少有出版物具有用于此特定目的的协议16，17，18。本文介绍了一种专门设计用于从人主动脉瓣样本中直接分离和培养T淋巴细胞的方案。淋巴细胞克隆扩增是适应性免疫的标志。在体外研究这一过程提供了有关淋巴细胞异质性水平的有见地的信息19。经过三周的潜伏期后，T细胞克隆准备被种植，因为从每个克隆中获得了足够量的T细胞，以便进行表型和功能研究。随后通过细胞荧光测定法研究T克隆的表型。
该免疫方案是对Amedei等人先前开发的用于从人体组织中分离和表征T细胞的方法的改编，专门设计用于钙化人体组织，例如在CAVD20，21，22中。这里使用辐照的矮黄色外套分离PBMC（外周血单核细胞）的方案描述了获得饲养层细胞（FC）的有效方法，该方法专门针对从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞的克隆阶段进行调整。饲养层由生长停滞的细胞组成，这些细胞仍然具有活力和生物活性。饲养细胞的作用对于支持从瓣膜间质细胞中分离的T淋巴细胞的体外存活和生长非常重要23。为了避免饲养层细胞在培养物中增殖，这些细胞必须经历生长停滞。这可以通过两种方式实现：通过物理方法（如辐照）或通过细胞毒性化学物质（如丝裂霉素C（MMC））进行处理，丝裂霉素C是一种可以直接应用于培养表面的抗肿瘤抗生素24。在这里，我们展示了通过细胞照射实现的饲养层细胞生长停滞。
该方法提供了一种从主动脉瓣组织中分离和表征T细胞的有效，经济有效的方法，有助于扩大用于探索CAVD病理生理学的免疫学方法的范围。
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Protocol
这项研究是根据《确保良好科学做法慈善法》进行的，并遵守了关于隐私和道德的法律准则和规定。伦理委员会批准了所有人体实验，并根据道德表上报告的规则维护了患者的隐私和匿名性。
注：对于下面描述的方案，使用新鲜的人狭窄瓣膜样品。
1. 试剂制备
- 通过加入RPMI 1640培养基制备富集的RPMI完全培养基：非必需氨基酸;丙酮酸钠，L-谷氨酰胺，β-巯基乙醇和青霉素 - 链霉素（Pen/链球菌）。使用前过滤。储存在+4°C，并在两个月内使用。
- 使用富集的RPMI 1640完整培养基加入热灭活胎牛血清（FBS），HB基础培养基，50U白细胞介素2（IL-2）和人血清（HS）准备用于克隆阶段的细胞培养基（CCM）。过滤并在一天内使用。请勿储存。
- 使用富含的RPMI 1640完整培养基，加入FBS，HB基础培养基，30U的IL-2和HS，为再喂养阶段准备细胞培养基。过滤并在一天内使用。请勿储存。
- 准备含有250 mL RPMI和5 mL笔/链球菌的洗涤缓冲液。储存在+4°C，在两个月内使用。
2. 人T淋巴细胞分离培养到T-25烧瓶中
- 将电磁阀样品放入充满洗涤缓冲液的无菌培养皿中，确保整个阀门样品被其覆盖。静置 15 分钟。
- 使用手术刀将狭窄瓣膜切成小块，然后再次静置10分钟。
- 如前所述，用50 U的IL-2制备细胞培养基并过滤。
- 将CCM加入T25烧瓶内，并使用无菌塑料钳将阀片放入烧瓶内。
- 将烧瓶垂直存放在CO2 培养箱内一周，注意在显微镜下观察烧瓶的状态。T细胞克隆应在培养步骤后约三天可见;为了更好地观察，建议在显微镜分析之前将烧瓶置于水平位置20分钟。
注意：细胞培养基的数量取决于存在的样品量和将使用多少个T25烧瓶。考虑到每个瓣膜在烧瓶内需要10 mL CCM，T25烧瓶中的25 mL CCM适合3个瓣膜。
3. 克隆阶段
注意：对于T细胞的克隆阶段，有必要从照射的白云母皮（BC）中分离饲养层细胞开始，遵循PBMCs方案。
- 使用带有无针阀的袋钉打开层流罩下的BC袋，并在T150烧瓶中转移50 mL血液。加入70毫升PBS以稀释烧瓶内的血液。
- 取四个50 mL锥形管，将20 mL密度梯度培养基放入每个管中，并小心地在其上铺上30 mL血液。
- 在800 x g和20°C下离心25分钟，关闭制动器。
- 小心地吸出上清液并将其作为废物丢弃。将PBMC环收集在新的50ml锥形管中，添加到PBS溶液中，体积可达50ml。
- 在400×g和20°C下离心10分钟。
- 弃去上清液并通过在PBS溶液内加入至50mL的体积来悬浮沉淀。在400×g和20°C下重复离心阶段10分钟。
- 弃去上清液并将FC悬浮在10mL细胞培养基中。
- 取一个新的收集管，并通过从管中加入9.9mL PBS和100μL与FC和细胞培养基，用PBS 1：10稀释FC。用移液管冲洗干净，从该稀释液中取7μL，并在显微镜下计数细胞。
- 准备用于克隆阶段的细胞培养基：70 mL和50 U的IL-2，然后将其分成两个50 mL锥形管，每个管将包含25 mL细胞培养基，如下所述：
- 试管 1：25 mL CCM + FC + 0.6% 植物血凝素 （PHA）
- 试管 2：25 mL CCM + T 淋巴细胞
注意：PMBCs方法的目的是为每mL获得2 x 10 6 个细胞，因此需要相应地计算制备的25 mLCCM（管1）。使用的一般公式是：计数的细胞数x 106：1 mL = CCM x 106：X
4. T淋巴细胞在多孔板中培养
- 使用电动移液器，收集烧瓶内的所有细胞培养基，并将其转移到50 mL锥形管中。空烧瓶可以扔掉。
- 通过在400×g和20°C下离心10分钟沉淀细胞。
- 弃去上清液，将沉淀悬浮在50mL PBS中，并通过在400×g和20°C下离心10分钟收集细胞。 重复此步骤两次。
- 弃去上清液并将沉淀悬浮在1mLCCM中。从该稀释液中取7μL，并在显微镜下计数细胞。
注意：计数的细胞数量需要乘以腔室的体积和应用的稀释。 - 继续在细胞培养基中稀释从105 到103 计数的细胞，然后从103 中取500μL并将其放入管2中。
- 将管1的25mL细胞培养基倒入100 mm x 15 mm塑料培养皿中。
- 取四个96-U底部多孔板，并使用每个孔中设置为100μL种子FC的多通道移液器。
- 取管2并将细胞培养基倒入培养皿中。使用设置为100μL的多通道移液器，在每个孔中接种T细胞。
- 将多孔板储存在CO2 培养箱内一周。
5. 第一次再喂养阶段
- 使用辐照的黄褐色外套袋，按照PBMC方法获得FC，如上一种方法所述。
- 准备适量的CCM，不含PHA并过滤。
- 使用多通道移液器，从每个孔中取出100μL，确保不接触孔的底部。
- 在所有孔中加入100μLFC作为进料层，以提供细胞培养养分并改变培养基。
注意：对于每个多孔，建议考虑6 mL的CCM，因此4个多孔的推荐量约为30 mL。PHA（占CCM总量的0.4%）需要每两周添加到CCM中一次。
6. 第二次再喂养阶段
- 在上述段落之后重复重新喂养阶段。需要将0.4%的PHA加入到细胞培养基中。
7. 从1孔/样品到2孔/样品的第一次分裂阶段
- 在显微镜下检查所有四个多孔，然后继续用T细胞克隆（TCC）分裂这些孔。
- 遵循PBMCs方案从辐照的buffy外套袋中分离饲养细胞。
- 用30 U的IL-2制备细胞培养基。添加FC并取一个新的96孔多孔板，底部为U。
- 使用设置为100μL的移液器，在所选样品的孔内冲洗，并将每个孔中包含的200μL体积分成新多孔板的2个新孔，以便每个新2孔具有100μL体积。
- 在所有新孔中加入100μLFC。每个孔必须包含200μL的总体积。
- 将移液器设置为100μL，并将100μL加入另外两个孔中，仅包含FC作为对照。
注意：使用光学显微镜观察所有多孔板，以确定哪些孔已成功生长TCC。为了使克隆的选择更容易，可以与对照组进行比较（两个孔仅包含FC），与对照组相比，克隆看起来更暗，更大。要选择的孔是那些具有大，透明，圆形克隆的孔，淋巴细胞密集地聚集在一起。如果重新喂养两周后没有TCC，建议再等待一周并执行额外的补充阶段。
8. 第二次分裂阶段从2孔/样品到4孔/样品
- 将移液器设置为100μL，在每个样品的两个孔内冲洗干净，并为每个孔接种两个100μL的新孔。
- 用30 U的IL-2制备细胞培养基，并遵循PBMC技术从buffy外套袋中提取FC并将FCC放入CCM内。
- 将移液器设置为100μL，并将FC接种到所有孔中。将多孔储存在CO2 培养箱中一周。
9. 第三次分裂阶段从4孔/样品到8孔/样品：
- 使用设置为100μL的多通道移液器，在每个样品的所有四个孔内冲洗，并在新的96孔板中将100μL接种到四个新孔中的每一个中。
- 准备细胞培养基并遵循PBMCs技术从辐照的浅黄色外套袋中提取FC。
- 将 FC 放在 CCM 内。将移液器设置为100μL，并将FC接种到所有孔中。将多孔储存在 CO2 培养箱中一周
10. 细胞荧光分析
- 从CO2 培养箱中取出具有最旧日期的多孔板，并识别带有样品编号的收集管以进行分析。
- 使用设置为200μL的多通道移液器，带2个吸头，在同一样品的两个孔内彻底冲洗，并将两个移液器放入同一收集管中。对所有示例重复此步骤。
注：不会分析FC样品，因为它们仅用作对照。
11. 用于细胞荧光分析的抗体染色检测试剂盒的制备
- 为每个管加入1mL PBS溶液，并在400×g和20°C下离心10分钟。
- 离心阶段后丢弃上清液。
注：抗体染色检查表见 表1。计算出的每个抗体浓度约为2μL/样品。建议在使用前短暂旋转抗体管。为了保护荧光团偶联抗体免受光照，所有步骤都应在黑暗中进行。 - 在1.5 mL管内准备抗体混合物并涡旋。
- 将抗体加入样品中，让样品在室温下在黑暗中孵育15分钟。
- 在每个样品中加入1mL PBS，并在400×g和20°C下离心10分钟。
- 弃去上清液并用500μLPBS溶液悬浮沉淀。
- 继续进行细胞荧光分析（FACS分析， 表1）。
注意：染色的样品可以使用0.5%多聚甲醛（PFA）在PBS溶液中稀释并分析长达15天后进行固定。
注意：PFA是有毒的，必须小心处理。
| 标记 | 荧光基团 |
| 光盘3 | 聚乙烯/氰基7 |
| 光盘4 | 亚历克莎福陆 488 |
| 断续器 | 亮紫 510 |
| 光盘14 | 亮紫 421 |
| 二氧化硫 | 体育 |
| CD45 | 亮紫 711 |
表 1.抗体染色检查用于检测钙化主动脉瓣疾病中的 T 淋巴细胞群。
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Representative Results
我们使用一种简单且具有成本效益的方法表征来自人类严重主动脉瓣狭窄患者的新鲜主动脉瓣样本的白细胞群（参见方案）。分离PBMC的方法是获得饲养层细胞的重要步骤，饲养层细胞用于实验的每个步骤（克隆，再喂养和分裂阶段），并能够检测和表征主动脉瓣样品中浸润的白细胞。此方法的关键步骤如图 1 所示。
图 1.FC与巴菲外套隔离。 （A）血液在密度梯度培养基上分层 （B）离心后获得的白细胞环（C）收集并重悬在PBS溶液中的白细胞（D）在光学显微镜下观察的白细胞 请点击这里查看此图的放大版本。
经过两周的孵育，我们成功克隆并培养了T细胞群，如图 2所示。
图 2.孵育两周后使用光学显微镜观察T细胞克隆。请点击此处查看此图的放大版本。
图3说明了用于分析CAVD患者T细胞亚群的门控方案。从FACS分析结果可以看出，CD4 + T细胞（43.032%）比CD8 + T细胞（1.079%）更多。
图 3.用于T细胞亚群分析的门控方案。 （A） 已应用闸门来鉴定狭窄瓣膜中的特定T细胞群。（B） CD14阴性淋巴细胞和CD3阳性淋巴细胞。（C） CD3淋巴细胞被门控以区分CD4 + T细胞和CD8 + T细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。
为了表明天然瓣膜样品和克隆样品中都存在相同的T细胞标记，我们在没有克隆阶段的情况下进行了FACS分析，如图 4所示。
图 4.两个瓣膜样品的FACS分析结果。 我们比较了从天然瓣膜样品和克隆样品中获得的T细胞，验证了天然瓣膜中发现的T细胞在最终克隆产品中共享T细胞的特定标记。（A）没有克隆阶段的天然瓣膜样品的FACS结果。（B）克隆阶段后分析的阀门样品的流相测量结果。 请点击此处查看此图的放大版本。
整个工作流程总结在 图5中，从人主动脉瓣的解剖开始，一直到FACS分析。分析一个主动脉瓣样本需要所有步骤。第1阶段显示淋巴细胞从狭窄的主动脉瓣组织中分离出来。需要切割阀门样品并将其放置在装满洗涤缓冲液的培养皿中。阀片可以放置在装满CCM的T25烧瓶中，并在CO2 培养箱中储存一周。第2阶段显示了克隆阶段，该阶段由两部分组成：1）从辐照的buffy外套袋中分离FC和2）T细胞克隆阶段，并在96孔多孔板中进行细胞培养，该板在CO2 培养箱中储存一周。阶段3和4包括使用来自辐照的黄褐色涂层的FC的再喂养阶段;此阶段必须连续重复两周。第4、5和6阶段显示了T细胞克隆的分裂阶段;第一个分裂阶段是从1个孔/样品到新多孔板中每个样品的两个孔;第二次分裂是从2孔/样品到同一多孔板中每个孔的4孔;第三个也是最后一个分裂阶段是从4孔/样品到8个新的多孔板。阶段7是最后阶段，其中使用FACS分析样品。
图 5.CAVD 实验工作流程。请点击此处查看此图的放大版本。
从初步结果（图2）中，我们可以得出结论，淋巴细胞以及CD45 +白细胞存在于钙化的主动脉瓣中，因此表明钙化主动脉瓣疾病与免疫系统的激活和炎症活动有关。
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Discussion
在这里，我们提出了一种使用流式细胞术从狭窄主动脉瓣样品中分离的T淋巴细胞亚群的方法。这种方法需要使用辐照的黄褐色涂层来隔离PBMC。黄褐色外套袋必须承受的辐射频率为9000 Rad / 90 Gray（Gy），这是阻止饲养细胞增殖的关键步骤。从黄褐色外套袋中分离的细胞的作用是仅充当饲养细胞并为从瓣膜中分离的T细胞提供营养。正如过去25所指出的那样，使用单卷曲的巴菲外套袋将促进PBMC在培养物中的扩散。低于90 Gy的辐射频率表明PBMC在培养物中增殖，因此我们建议使用恰好90 Gy的辐射。值得注意的是，建议在同一天或最多在第二天使用经过辐照的黄褐色外套，将其保持在使其保持持续搅拌的设备上。该方法的另一个关键步骤可以表现为淋巴细胞克隆阶段，这可能受到伪影的影响;为了避免这种情况，我们对新鲜的主动脉瓣样本进行FACS。与从一个新鲜样品的分析中获得的数量相比，T淋巴细胞的克隆阶段具有获得更多数量的T克隆（每个瓣膜平均15个T细胞克隆）的优势，这些T克隆在表型和功能上进行分析。该研究小组已经使用克隆技术多年，根据所分析的组织类型，淋巴细胞谱不同21，26，27。该方法的第一个段落涉及从狭窄的主动脉瓣中分离T细胞。所描述的所有步骤必须在无菌条件下在层流罩下进行，强烈建议在使用前对所有材料进行消毒。获得结果所需的时间为6周，从克隆阶段获得的T淋巴细胞的平均时间为20×106 个细胞。多孔板的监测阶段非常重要，不容忽视。介质颜色变为黄色可能代表细菌污染，在这种情况下，所有使用的器械都需要消毒并扔掉多孔板。
在FACS分析之前，重要的是要建立一个合适的门，以验证抗体通道之间没有特异性重叠。这样可以实现正极门和负极门之间的最佳分离。建议对研究中涉及的所有样品使用相同数量的抗体，以获得均一的结果。还需要保护荧光团偶联抗体免受光照，在熄灯的情况下执行所有步骤。
该方法可有效产生具有高再现性的结果，并且价格不昂贵。这种方法的局限性是样本量小，因为人瓣膜样本的可用性有限，以及缺乏对照组。
初步结果支持适应性免疫作为钙化主动脉瓣疾病发展和进展的关键因素的作用。所有参加这项研究的患者都被诊断为严重症状性钙化主动脉瓣狭窄，平均年龄为70岁，大多数是男性。所分析的主动脉瓣中存在T细胞群，这为患病主动脉瓣的炎症活性作为免疫细胞激活的检查点提供了证据。未来的兴趣点可能是分析CAVD浸润T细胞的功能，并表征先前在类似疾病中报道的T细胞特异性，例如动脉粥样硬化28，29，30。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
由于Peter Rosenthal博士，Dirk Böhmer博士和Charité Benjamin Franklin放射科的整个团队的可用性，用于该协议的所有buffy外套袋都经过了辐照。奖学金获得者/Mary Roxana Christopher，这项工作得到了德国心脏学会（DGK）的奖学金支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
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