Summary
Bu çalışmada, akış sitometrisi analizi kullanılarak adaptif lökosit alt kümelerinin karakterizasyonu için taze kireçlenmiş aort kapakçıkları örneklerinden T lenfosit izolasyonu sürecini ve T hücre klonlama analitik adımlarını açıklarız.
Abstract
Kapakçığın hafif kalınlaşmasından şiddetli kireçlenmeye kadar uzanan aktif bir hastalık süreci olan kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), transktheter aort kapak replasmanı (TAVR) gibi yeni terapötik seçeneklere rağmen yüksek mortalite ile ilişkilidir.
Kapak kireçlenmesi ile başlayan ve şiddetli aort darlığı ile yol açan tüm yollar sadece kısmen anlaşılmaktadır. Aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayarak, T lenfositlerinin stenotik kapak dokusundan test edilmesi, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Cerrahi eksizyondan sonra, taze aort kapak örneği küçük parçalar halinde parçalara ayrılır ve T lenfositleri kültürlenir, klonlanır ve floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanılarak analiz edilir.
Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden elde edilen sonuçlar, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T hücre konsantrasyonlarındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt türlerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir. Bu çalışmada, CAVD patofizyolojisinde adaptif bağışıklığın rolünü daha iyi anlamak için taze kireçlenmiş aort kapak örnekleri üzerinde gerçekleştirilen T hücrelerinin izolasyonunu ve akış sitometrisi kullanarak T hücre klonlarının analiz edilmesinin adımlarını gösteriyoruz.
Introduction
Kalsfik aort kapak hastalığı (CAVD), sağlık hizmetleri üzerinde ağır bir etkisi olan en yaygın kalp kapak hastalıklarından biridir. Son yıllarda aort kapak değişimi sıklığı önemli ölçüde artmıştır ve artan yaşlı nüfus nedeniyle daha da artması beklanmaktadır1.
CAVD'nin alttaki patofizyolojisi sadece kısmen bilinmektedir ve mevcut terapötik stratejiler cerrahi veya perkütan prosedürler yoluyla konservatif önlemler veya aort kapak değişimi ile sınırlıdır. Bugüne kadar, aort kapak değişimi (AVR) yapılmadıkça, etkili hiçbir tıbbi tedavi CAVD ilerlemesini engelleyemez veya tersine çeviremez ve yüksek mortalite erken semptom başlangıcı ile ilişkilidir2. Şiddetli semptomatik aort darlığı olan hastalarda 3 yıllık semptomsuz sağkalım %20 3 gibi düşük bir oranın olduğu bildirilmiştir. Transktheter aort kapak replasmanı (TAVR), özellikle yaşlılar arasında yüksek riskli hastalar için tedavide devrim yapan ve bu popülasyonda özünde yüksek olan mortaliteyi önemli ölçüde azaltan yeni bir seçeneği temsil eder4,5,6. TAVR'ın umut verici sonuçlarına rağmen, yeni erken terapötik hedefleri belirlemek için CAVD patofizyolojisini anlamak için daha fazla araştırma yapılması gerekmektedir7,8,9.
Daha önce pasif, dejeneratif bir süreç olduğu düşünülen CAVD, şimdi aort kapak interstisyel hücrelerinin osteoblastik fenotip anahtarı ile karakterize aktif bir ilerleyici hastalık olarak kabul edilmektedir10. Bu hastalık progresif mineralizasyon, fibrokalsifik değişiklikler ve aort kapaklarının (skleroz) azlığı içerir, bu da sonuçta aort kapak açıklığının daralmasına (darlığına) yol açan kan akışını engeller11.
İnflamasyon, vasküler ateroskleroz sürecine benzer şekilde CAVD patofizyolojisinde önemli bir süreç olarak kabul edilir. Endotel yaralanması lipid türlerinin, özellikle de aort kapakçığında oksitlenmiş lipoproteinlerin birikmesini ve birikmesini sağlar12. Bu oksitlenmiş lipoproteinler, mineralizasyona yol açan enflamatuar aktivite ile sitotoksik oldukları için enflamatuar bir tepkiye neden olan bir inflamatuar yanıta nedendir. CAVD gelişiminde ve hastalığın ilerlemesinde doğuştan gelen ve adaptif bağışıklığın rolü son zamanlarda vurgulanmıştır13. Bellek T hücrelerinin belirli alt kümelerinin aktivasyonu ve klonal genişlemesi CAVD ve mineralize aort kapak broşürleri olan hastalarda belgelenmiştir, böylece enflamatuar süreçlerin en azından CAVD gelişiminde ve muhtemelen hastalığın ilerlemesinde rol aldığı varsayılmıştır14. Aslında, hem sağlıklı hem de hastalıklı kapakta antijen sunan hücreler ve makrofajlar mevcut olmasına rağmen, T lenfositlerinin varlığı yaşlı ve hastalıklı bir aort kapakçığının göstergesidir. Bu lenfositik infiltrat, neovaskülarizasyon ve metaplazideki artışla birlikte CAVD15'in karakteristik histolojik belirtileridir.
Aort kapak kesişim hücreleri ile bağışıklık sisteminin aktivasyonu arasında bir etkileşimin varlığını hipotez ediyoruz, bu da aort kapakta kronik bir enflamatuar sürecin başlatılmasını potansiyel olarak tetikliyor. T hücrelerinin stenotik aort kapak dokusundan test edilmesi, aort kapak hücrelerinin in vivo olarak yakından temsil edilmesini sağlayabildiğinden, kireçlenme gelişimindeki rollerini netleştirmenin etkili bir yolu olabilir. Mevcut çalışmada, aort kapak dokusunu kullanarak, T-lenfositleri izole ediyoruz, kültürlüyoruz ve klonlıyoruz ve daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sıralamasını (FACS) kullanarak karakterize ediyoruz. Şiddetli aort darlığı için cerrahi kapak değişimi alan CAVD hastalarından taze aort kapak örnekleri çıkarıldı. Cerrahi eksizyondan sonra, taze kapak örneği küçük parçalar halinde parçalandı ve T hücreleri kültürlendi, klonlandı ve akış sitometrisi kullanılarak analiz edildi. Boyama işlemi basittir ve lekeli tüpler paraformaldehitin% 0.5'i kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir. Boyama panelinden oluşturulan veriler, müdahale ile ilgili olarak zaman içinde T lenfosit dağılımındaki değişiklikleri izlemek için kullanılabilir ve belirli T hücresi alt kümelerinin aktivasyon durumlarını değerlendirmek için kolayca geliştirilebilir.
Kireçlenmiş dokunun çıkarılması, lökositlerin kireçlenmiş dokudan izolasyonu ve özellikle bu tür dokularda akış sitometrisinin kullanılması, otoflüoresans gibi sorunlar nedeniyle zor olabilir. Bu özel amaç için protokollerle çok az yayın var16,17,18. Burada, insan aort kapak örneklerinden T lenfositin doğrudan izolasyonu ve kültürü için özel olarak tasarlanmış bir protokol sunuyoruz. Lenfositlerin klonal genişlemesi adaptif bağışıklığın ayırt edici bir özelliğidir. Bu sürecin in vitro olarak incelenmesi lenfosit heterojenliği seviyesi hakkında içgörülü bilgiler sağlar19. Üç haftalık bir kuluçka süresinden sonra, fenotipik ve fonksiyonel çalışmaya izin vermek için her klondan yeterli miktarda T hücresi elde edildiği için T hücre klonları ekilmeye hazırdır. Daha sonra T klonlarının fenotipi sitoflorometri ile incelenir.
Bu immünolojik protokol, amedei ve arkadaşları tarafından daha önce T hücre izolasyonu ve insan dokusundan karakterizasyon için geliştirilen, özellikle CAVD20,21,22 gibi kireçlenmiş insan dokusu için tasarlanmış bir yöntemin adaptasyonudur. Işınlanmış buffy coat kullanılarak PBMC'lerin (periferik kan mononükleer hücreleri) izolasyonu için buradaki protokol, kapak geçiş hücrelerinden izole edilen T lenfositlerinin klonlama aşaması için özel olarak ayarlanmış besleyici hücreler (FC) elde etmenin etkili bir yolunu açıklar. Besleyici tabaka, hala canlı ve biyoaktif olan büyüme tutuklanığı hücrelerinden oluşur. Besleyici hücrelerin rolü, kapak geçiş hücrelerinden izole edilmiş T lenfositlerinin in vitro sağkalımını ve büyümesini desteklemek için önemlidir23. Kültürde besleyici hücre çoğalmasını önlemek için, bu hücrelerin büyüme hapsine tabi tutulması gerekir. Bu iki şekilde elde edilebilir: ışınlama gibi fiziksel yöntemlerle veya doğrudan kültür yüzeyine uygulanabilen bir antitümöral antibiyotik olan mitomisin C (MMC) gibi sitotoksik kimyasallarla tedavi yoluyla24. Burada hücre ışınlama yoluyla elde edilen besleyici hücre büyümesi tutuklaması gösteriyoruz.
Bu yöntem, T hücrelerini aort kapak dokusundan izole etmek ve karakterize etmek için etkili, uygun maliyetli bir yol sunarak CAVD patofizyolojisini keşfetmek için immünolojik yöntemlerin spektrumunun genişletilmesine katkıda bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Çalışma, İyi Bilimsel Uygulamanın Sağlanması için Charité Tüzüğü'ne göre yürütüldü ve gizlilik ve etikle ilgili yasal kılavuz ve hükümlere uyulur. Etik Kurul tüm insan deneylerini onaylamıştır ve hastaların mahremiyeti ve anonimliği Etik Form'da bildirilen kurallara uygun olarak sürdürülmektedir.
NOT: Aşağıda açıklanan protokol için taze insan stenotik kapak örnekleri kullanılmıştır.
1. Reaktif hazırlama
- RPMI 1640 Medium: Non-esansiyel amino asitler ekleyerek zenginleştirilmiş RPMI komple ortamını hazırlayın; Sodyum Piruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol ve Penisilin-Streptomisin (Pen/Strep). Kullanmadan önce filtreleyin. +4 °C'de saklayın ve iki ay içinde kullanın.
- Zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple orta ilave fetal sığır serumu (FBS), HB bazal orta, 50 U Interlökin 2 (IL-2) ve İnsan Serumu (HS) kullanarak klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını (CCM) hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.
- Eklenen FBS, HB bazal ortam, 30 U IL-2 ve HS ile zenginleştirilmiş RPMI 1640 komple ortamını kullanarak hücre kültürü ortamını yeniden besleme aşamasına hazırlayın. Gün içinde filtreleyin ve kullanın. Saklamayın.
- 250 mL RPMI ve 5 mL Pen/Strep içeren yıkama tamponu hazırlayın. +4 °C'de saklayın, iki ay içinde kullanın.
2. T-25 şişelerine insan T lenfosit izolasyonu ve kültürü
- Stenotik valf örneğini Yıkama Tamponu ile dolu steril bir Petri kabına yerleştirin ve tüm valf örneğinin bununla kaplı olmasını sağlayın. 15 dakika bekletin.
- Stenotik vanayı neşter kullanarak küçük parçalar halinde kesin ve 10 dakika boyunca tekrar bekletin.
- Hücre kültürü ortamını daha önce açıklandığı gibi 50 U il-2 ile hazırlayın ve filtreleyin.
- CCM'yi T25 şişelerinin içine ekleyin ve steril bir plastik plier kullanarak valf parçalarını şişelerin içine yerleştirin.
- Şişeleri bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörü içinde dikey bir konumda saklayın ve mikroskop altında şişenin durumunu gözlemlemeye dikkat edin. T hücre klonları kültür adımından yaklaşık üç gün sonra görünmelidir; daha iyi gözlem için şişelerin mikroskobik analizden önce 20 dakika boyunca yatay konuma yerleştirilmesi tavsiye edilir.
NOT: Hücre kültürü ortamının miktarı, mevcut numune miktarına ve kaç adet T25 şişesi kullanılacağına bağlıdır. Her bir valf parçasının bir şişenin içinde 10 mL CCM gerektirdiği göz önüne alındığında, bir T25 şişesinde 25 mL CCM, 3 adet valf için uygundur.
3. Klonlama aşaması
NOT: T hücrelerinin klonlama aşaması için, PBMCs protokolünü izleyerek besleyici hücrelerin ışınlanmış bir buffy coat'dan (BC) izolasyonu ile başlamak gerekir.
- İğnesiz valfli torba çivisini kullanarak laminar akış başlığının altındaki BC torbasını açın ve bir T150 şişesinde 50 mL kan aktarın. Şişenin içindeki kanı seyreltmek için 70 mL PBS ekleyin.
- Dört 50 mL konik tüp alın ve her birine 20 mL yoğunluk gradyanı ortamı yerleştirin ve üzerine 30 mL kanı dikkatlice katlayın.
- Freni kapalıyken 800 x g ve 20 °C'de 25 dakika santrifüj.
- Süpernatantı dikkatlice emiş ve atık olarak atın. PBMC'leri PBS çözeltisinin içine 50ml hacme kadar ekleyerek yeni bir 50ml konik tüpte halkalayın.
- 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj.
- Üstnatantı atın ve PBS çözeltisinin içine 50 mL hacme kadar ekleyerek peleti askıya alın. Santrifüjleme aşamasını 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika boyunca tekrarlayın.
- Üstnatant atın ve 10 mL hücre kültürü ortamında FC'leri askıya alın.
- Yeni bir toplama tüpü alın ve FC'ler ve hücre kültürü ortamı ile tüpten 9,9 mL PBS ve 100 μL'nin içine ekleyerek FC'leri PBS 1:10 ile seyreltin. Bir pipetle iyi durulayın ve bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın.
- Klonlama aşaması için hücre kültürü ortamını hazırlayın: 50 U IL-2 ile 70 mL ve ardından iki 50 mL konik tüpe bölün, her tüp aşağıda açıklanacağı gibi 25 mL hücre kültürü ortamı içerecektir:
- Tüp 1: 25 mL CCM + FCs + fitohemagglutinin %0,6'sı (PHA)
- Tüp 2: 25 mL CCM + T lenfositler
NOT: PMBC'ler yönteminin amacı her mL için 2 x 106 hücre elde etmektir, bu nedenle hazırlanan 25 mL CCM'nin (Tüp 1) buna göre hesaplanması gerekir. Kullanılan genel formül: Sayılan hücre sayısı x 106: 1 mL = CCM x 106: X
4. Çok katlı plakalarda T Lenfosit kültürü
- Elektronik pipeti kullanarak, şişelerin içindeki tüm hücre kültürü ortamını toplayın ve 50 mL konik bir tüpe aktarın. Boş şişeler atılabilir.
- Hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile peletle.
- Süpernatantı atın, peleti 50 mL PBS'de askıya alın ve hücreleri 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüjleme ile toplayın. Bu adımı iki kez yineleyin.
- Süpernatantı atın ve peletin 1 mL CCM'de askıya alın. Bu seyreltmeden 7 μL alın ve hücreleri mikroskop altında sayın.
NOT: Odanın hacmi ve seyreltme uygulanması için sayılan hücre sayısının çoğaltılması gerekir. - Hücre kültürü ortamında 105'ten 103'e kadar sayılan hücreleri seyreltmeye devam edin ve ardından 103'ten 500 μL alın ve Tüp 2'nin içine koyun.
- Tüp 1'in 25 mL hücre kültürü ortamını 100 mm x 15 mm plastik Petri kabının içine dökün.
- Dört 96-U alt multiwell plaka alın ve her kuyuda 100 μL tohum FC'lerine ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanın.
- Tüp 2'yi alın ve hücre kültürü ortamını bir Petri kabının içine dökün. 100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyuda T hücrelerini tohumlamak.
- Multiwell plakalarını bir hafta boyunca bir CO2 inkübatöründe saklayın.
5. İlk yeniden besleme aşaması
- Işınlanmış buffy ceket çantası kullanarak, önceki yöntemde açıklandığı gibi FC'leri elde etmek için PBMC yöntemini izleyin.
- PHA olmadan uygun miktarda CCM hazırlayın ve filtreleyin.
- Çok kanallı bir pipet kullanarak, her kuyudan 100 μL çıkarın ve kuyunun dibine dokunmamaya dikkat edin.
- Hücre kültürü besinlerini sağlamak ve ortamı değiştirmek için tüm kuyulara bir besleme katmanı olarak 100 μL FC ekleyin.
NOT: Her multiwell için 6 mL CCM'yi göz önünde bulundurmanız önerilir, bu nedenle 4 çokluwell için önerilen miktar yaklaşık 30 mL'dir. PHA'nın (toplam CCM miktarının %0,4'ü) ccm'ye iki haftada bir eklenmesi gerekir.
6. İkinci yeniden besleme aşaması
- Yukarıda açıklanan pasajı takiben yeniden besleme aşamasını tekrarlayın. Hücre kültürü ortamına %0,4 PHA eklenmesi gerekir.
7. İlk bölme aşaması 1 kuyu / numuneden 2 kuyuya / numuneye
- Mikroskop altındaki dört çoklu boşluğun tümünde kontrol edin ve bu kuyuları T hücre klonları (TCC' ler) ile bölmeye devam edin.
- Besleyici hücrelerini ışınlanmış buffy ceket torbasından izole etmek için PBMCs protokolünü izleyin.
- Hücre kültürü ortamını 30 U il-2 ile hazırlayın. IC'leri ekleyin ve U altlı yeni bir 96 kuyulu çoklu plaka alın.
- 100 μL'ye ayarlanmış bir pipet kullanarak, seçilen numunelerin kuyularının içinde iyice durulayın ve her kuyuda bulunan 200 μL hacmi, yeni 2 kuyunun her biri için 100 μL hacme sahip olmak için yeni çok kuyulu plakanın 2 yeni kuyusuna bölün.
- Tüm yeni kuyuların içine 100 μL IC ekleyin. Her kuyu toplam 200 μL hacim içermelidir.
- Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve kontrol görevi görmek için yalnızca FC'ler içeren ek iki kuyuya 100 μL ekleyin.
NOT: TTK'yı hangi kuyuların başarıyla büyüttüğini belirlemek için tüm çok katlı plakaları gözlemlemek için hafif mikroskopi kullanın. Klonların seçimini kolaylaştırmak için, denetime (yalnızca DC'ler içeren iki kuyu) bir karşılaştırma yapılabilir ve klon denetime kıyasla daha koyu ve daha büyük görünür. Seçilecek kuyular, lenfositlerin yoğun bir şekilde bir araya toplanmış olduğu büyük, net, yuvarlak bir klona sahip olanlardır. İki haftalık yeniden beslemeden sonra TCC yoksa, bir hafta daha beklemeniz ve ek bir yeniden besleme aşaması gerçekleştirmeniz önerilir.
8. 2 kuyudan/ numuneden 4 kuyuya / numuneye ikinci bölme aşaması
- Pipet 100 μL'ye ayarlayın, her numunenin iki kuyusunun içinde iyice durulayın ve her biri için 100 μL'lik iki yeni kuyuyu tohumlayın.
- Hücre kültürü ortamını 30 U IL-2 ile hazırlayın ve IC'leri buffy ceket torbasından çıkarmak ve IC'leri CCM'nin içine yerleştirmek için PBMC tekniğini izleyin.
- Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörde saklayın.
9. 4 kuyudan/ numuneden 8 kuyuya / örneğe üçüncü bölme aşaması:
- 100 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, her numunenin dört kuyusunun içinde iyice durulayın ve 100 μL'lik tohumu yeni bir 96 kuyu plakasında dört yeni kuyunun her birine durulayın.
- Hücre kültürü ortamını hazırlayın ve FC'leri ışınlanmış bir buffy ceket çantasından çıkarmak için PBMC'ler tekniğini izleyin.
- IC'leri CCM'nin içine yerleştirin. Pipet 100 μL'ye ayarlayın ve FC'leri tüm kuyulara tohumlayın. Multiwells'i bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörde saklayın
10. Sitofluorimetrik analiz
- CO2 inkübatöründen en eski tarihe sahip multiwell plakasını alın ve analiz etmek için numune numaralarıyla toplama tüplerini tanımlayın.
- 2 uçlu 200 μL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, aynı numunenin iki kuyusunun içini iyice durulayın ve her ikisini de aynı toplama tüpünün içine koyun. Tüm örnekler için bu adımı yineleyin.
NOT: PCC örnekleri yalnızca kontrol görevi gördükleri için analiz edilmeyecektir.
11. Sitofluorimetrik analiz için Antikor Boyama Paneli Hazırlama
- Her tüp için 1 mL PBS çözeltisi ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.
- Santrifüjleme aşamasından sonra süpernatantı atın.
NOT: Antikor boyama paneli Tablo 1'de bulunabilir. Hesaplanan her bir antikor konsantrasyonu yaklaşık 2 μL/numunedir. Kullanmadan önce antikor tüplerinin kısa bir süre dönmesi önerilir. Floroforla konjuge edilen antikorları ışıktan korumak için tüm adımlar karanlıkta yapılmalıdır. - Antikor karışımını 1,5 mL'lik bir tüpün içine hazırlayın ve girdaplayın.
- Antikorları numunelerin içine ekleyin ve numuneleri 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya bırakın.
- Her numuneye 1 mL PBS ekleyin ve 400 x g ve 20 °C'de 10 dakika santrifüj ekleyin.
- Süpernatant atın ve peleti 500 μL PBS çözeltisi ile askıya alın.
- Sitofluorimetrik analize devam edin (FACS analizi, Tablo 1).
NOT: Lekeli numuneler PBS çözeltisinde seyreltilmiş %0,5 paraformaldehit (PFA) kullanılarak sabitlenebilir ve 15 gün sonrasına kadar analiz edilebilir.
DİkKAT: PFA toksiktir ve dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır.
| Işaretleyici | Florofor |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Flor 488 |
| CD8 | Parlak menekşe 510 |
| CD14 | Parlak menekşe 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Parlak menekşe 711 |
Tablo 1. Kireçlenme aort kapak hastalığında T lenfosit popülasyonunun saptaması için antikor boyama paneli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şiddetli aort kapak darlığı olan insan hastalardan elde edilen taze aort kapak örneklerinin lökosit popülasyonu karakterize etmek için basit ve uygun maliyetli bir yöntem kullandık (protokole bakın). PBMC'leri izole etme yöntemi, deneyin her adımında (klonlama, yeniden besleme ve bölme aşamaları) kullanılan besleyici hücrelerin elde edilmesinde hayati bir adımdır ve aort valf örneklerinde lökositlerin algılanmasını ve karakterizasyonunu sağlar. Bu yöntemin temel adımları Şekil 1'de gösterilmiştir.
Şekil 1. Buffy coat'dan WC izolasyonu. (A) Yoğunluk gradyan ortamı üzerine katlanmış kan (B) Santrifüjlemeden sonra elde edilen beyaz kan hücreleri halkası (C) PBS çözeltisinde toplanan ve yeniden dürtilen beyaz kan hücreleri (D) Işık mikroskopisi altında gözlenen beyaz hücreler Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen tıklayınız.
İki haftalık kuluçkadan sonra, Şekil 2'de gösterildiği gibi bir T hücre popülasyonunu başarıyla klonladık ve büyüttük.
Şekil 2. Işık mikroskopisi kullanılarak iki haftalık inkübasyondan sonra T hücre klonu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3' te CAVD'li hastalarda T hücre alt nüfuslarının analizi için kullanılan gating şeması gösterilmektedir. FACS analizi sonucunda gösterildiği gibi, CD8+ T hücrelerinden (%1.079) daha fazla CD4+ T hücresi (%43.032) vardır.
Şekil 3. T hücre-alt nüfus analizi için kullanılan gating şeması. (A) Stenotik kapaktaki spesifik T hücre popülasyonunun tanımlanması için bir kapı uygulanmıştır. (B) CD14 negatif lenfositler ve CD3 pozitif lenfositler. (C) CD3 lenfositler CD4+ T hücrelerini CD8+ T hücrelerinden ayırmak için kapılıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Aynı T hücre işaretleyicilerinin hem yerel valf örneklerinde hem de klonlanmış örneklerde mevcut olduğunu göstermek için Şekil 4'te gösterildiği gibi klonlama aşaması olmadan FACS analizi yaptık.
Şekil 4. İki valf örneğinin FACS analiz sonuçları. Yerel bir valf örneğinden elde edilen T hücrelerini ve klonlanmış bir örneği karşılaştırdık, doğal vanada bulunan T hücrelerinin son klonlanmış üründeki T hücrelerinin belirli işaretlerini paylaştığını doğruladık. (A) Klonlama aşaması olmadan yerel bir valf örneğinin FACS sonuçları. (B) Klonlama aşamasından sonra analiz edilen valf numunesinin FACS sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tüm iş akışı, insan aort kapağının diseksiyonundan başlayarak FACS analizine kadar Şekil 5'te özetlenmiştir. Bir aort valfi örneğinin analizi için tüm adımlar gereklidir. Faz 1 lenfosit izolasyonu stenotik aort kapak dokusu gösterir. Valf örneklerinin kesilmesi ve yıkama tamponu ile dolu bir Petri kabına yerleştirilmesi gerekir. Valf parçaları CCM ile doldurulmuş bir T25 şişesinin içine yerleştirilecek ve bir hafta boyunca bir CO2 inkübatörde saklanabilir. Faz 2, iki bölümden oluşan Klonlama aşamasını gösterir: 1) FCS ışınlanmış buffy ceket torbasından izolasyon ve 2) T hücreleri klonlama aşaması ve bir hafta boyunca bir CO2 inkübatöründe depolanan 96 kuyulu çok kuyulu bir plakada hücre kültürü ile doruğa ulaşır. Aşama 3 ve 4, ışınlanmış buffy coat'dan FC'ler kullanılarak yeniden besleme aşamasından oluşur; bu aşama art arda iki hafta boyunca tekrarlanmalıdır. Aşama 4, 5 ve 6, T hücre klonlarının bölünme aşamasını gösterir; ilk bölme aşaması, yeni bir çoklu kuyu plakasındaki her örnek için 1 kuyudan/ numuneden iki kuyuya kadardır; ikinci bölme, aynı çoklu plakadaki her biri için 2 kuyudan / numuneden 4 kuyuya kadardır; üçüncü ve son bölme aşaması, yeni bir multiwell plakada 4 kuyu / numuneden 8'e kadardır. Faz 7, numunelerin FACS analizi kullanılarak analiz edildiği son aşamadır.
Şekil 5. CAVD Deneysel iş akışı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
İlk sonuçlardan (Şekil 2) lenfositlerin, CD45+ lökositlerle birlikte kireçlenmiş aort kapaklarında mevcut olduğu sonucuna varabiliriz, böylece kalsfiik aort kapak hastalığının bağışıklık sisteminin aktivasyonu ve enflamatuar aktivite ile bağlantılı olduğunu gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada akış sitometrisi kullanarak stenotik aort kapak örneklerinden izole edilmiş T lenfosit subpopulasyonlarını karakterize etmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, PBMC'leri izole etmek için ışınlanmış buffy coat kullanılmasını gerektirir. Buffy ceket torbalarının tabi tutulması gereken radyasyon frekansı 9000 Rad/90 Gridir (Gy) ve besleyici hücrelerin çoğalmasını durdurmak için çok önemli bir adımı temsil eder. Buffy ceket torbalarından izole edilen hücrelerin rolü, sadece besleyici hücreler olarak hareket etmek ve valflerden izole edilen T hücreleri için besin sağlamaktır. Tek ışınlı buffy palto çantasının kullanılması, son 25'te belirtildiği gibi PBMC'lerin kültürde çoğalmasını teşvik edecektir. 90 Gy'nin altındaki bir radyasyon frekansı PBMC'lerin kültürde çoğalmasını gösterdi, bu yüzden tam olarak 90 Gy radyasyon kullanmanızı öneririz. Not olarak, buffy ceketinin aynı gün veya en fazla ertesi gün ışınlanması ve sürekli ajitasyonda kalmasını sağlayan bir cihazda tutulması tavsiye edilir. Bu yöntemin bir diğer önemli adımı, eserlerden etkilenebilecek lenfosit klonlama aşaması ile temsil edilebilir; Bu olayı önlemek için FACS'i taze aort valfi numunelerinde gerçekleştiriyoruz. T lenfositlerin klonlama aşaması, bir taze numunenin analizinden elde edilen sayıdan daha fazla sayıda T klonu (her kapak için ortalama 15 T hücre klonu) fenotipik ve işlevsel olarak analiz edilmesi avantajına sahiptir. Klonlama tekniği bu araştırma grubu tarafından uzun yıllardır kullanılmaktadır ve analiz edilen dokunun türüne bağlı olarak lenfosit profili farklıydı21,26,27. Yöntemin ilk geçişi, stenotik aort kapakçığı T hücre izolasyonu ile ilgilidir. Açıklanan tüm adımlar steril koşullarda laminer akış başlığı altında yapılmalıdır ve kullanımdan önce tüm malzemelerin dezenfekte edilmesi şiddetle tavsiye edilir. Sonuç almak için gereken süre 6 hafta, klonlama aşamasından elde edilen T lenfosit hücrelerinin ortalaması ise 20 x 106 hücre idi. Çok katlı plakaların izleme aşaması çok önemlidir ve göz ardı edilmemelidir. Ortamın renginden sarıya bir değişiklik bakteriyel kontaminasyonu temsil edebilir, bu durumda kullanılan tüm aletlerin sterilize edilmesi ve çok katlı plakaların atılması gerekir.
FACS analizinden önce, antikor kanalları arasında belirli bir çakışma olmadığını doğrulamak için uygun bir kapı oluşturmak önemlidir. Bu, pozitif ve negatif kapılar arasında en uygun ayrımı sağlar. Çalışmada yer alan tüm örnekler için aynı sayıda antikorun kullanılması homojen sonuç elde etmek için önerilir. Florofor konjuge antikorları ışıktan korumak ve tüm adımları ışık kapalıyken gerçekleştirmek de gereklidir.
Bu yöntem, yüksek tekrarlanabilirlik ile sonuç elde etmede etkilidir ve pahalı değildir. Bu yöntemin bir sınırlaması, insan valf örneklerinin sınırlı kullanılabilirliği ve bir kontrol grubunun olmaması nedeniyle küçük numune boyutudur.
İlk sonuçlar, adaptif bağışıklığın kalsfik aort kapak hastalığının gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir unsur olarak rolünü desteklememektedir. Bu çalışmaya kayıtlı tüm hastalarda, çoğu erkek olmak üzere yaş ortalaması 70 olan şiddetli semptomatik kalsifik aort darlığı tanısı konuldu. Analiz edilen aort kapakçıklarında T hücre popülasyonlarının varlığı, hastalıklı aort kapakçığının immün hücre aktivasyonunun kontrol noktası olarak enflamatuar aktivitesi için kanıt sağlar. Cavd'a sızan T hücrelerinin işlevselliğini analiz etmek ve ateroskleroz28,29,30 gibi benzer hastalıklarda daha önce bildirildiği gibi T hücre özgüllüğünü karakterize etmek gelecekteki bir ilgi noktası olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu protokol için kullanılan tüm buffy palto çantaları, Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer ve Charité Benjamin Franklin Radyoloji Bölümü'nün tüm ekibinin mevcudiyeti sayesinde ışınlandı. Burs sahibi/Mary Roxana Christopher, bu çalışma Alman Kardiyak Derneği'nin (DGK) bursu ile desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
