Summary
Dans cette étude, nous décrivons le processus d’isolement des lymphocytes T à partir d’échantillons frais de valves aortiques calcifiées et les étapes analytiques du clonage des lymphocytes T pour la caractérisation des sous-ensembles de leucocytes adaptatifs à l’aide de l’analyse par cytométrie en flux.
Abstract
La maladie valvulaire aortique calcifiante (MCDA), un processus pathologique actif allant d’un léger épaississement de la valve à une calcification sévère, est associée à une mortalité élevée, malgré de nouvelles options thérapeutiques telles que le remplacement valvulaire aortique transcathéter (RVAC).
Les voies complètes qui commencent par la calcification valvulaire et conduisent à une sténose aortique sévère ne restent que partiellement comprises. En fournissant une représentation proche des cellules valvulaires aortiques in vivo, le dosage des lymphocytes T à partir du tissu valvulaire sténotique pourrait être un moyen efficace de clarifier leur rôle dans le développement de la calcification. Après l’excision chirurgicale, l’échantillon de valve aortique fraîche est disséqué en petits morceaux et les lymphocytes T sont cultivés, clonés puis analysés à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
La procédure de coloration est simple et les tubes colorés peuvent également être fixés à l’aide de 0,5% de paraformaldéhyde et analysés jusqu’à 15 jours plus tard. Les résultats générés par le panneau de coloration peuvent être utilisés pour suivre les changements dans les concentrations de lymphocytes T au fil du temps par rapport à l’intervention et pourraient facilement être développés pour évaluer les états d’activation de sous-types de lymphocytes T spécifiques d’intérêt. Dans cette étude, nous montrons l’isolement des lymphocytes T, effectué sur des échantillons frais de valve aortique calcifiée et les étapes d’analyse des clones de lymphocytes T à l’aide de la cytométrie en flux pour mieux comprendre le rôle de l’immunité adaptative dans la physiopathologie de la MCDA.
Introduction
La maladie valvulaire aortique calcifique (MCDA) est l’un des troubles valvulaires cardiaques les plus courants, avec un impact important sur les soins de santé. La fréquence du remplacement valvulaire aortique au cours des dernières années a considérablement augmenté et devrait encore augmenter, en raison de la croissance de la population âgée1.
La physiopathologie sous-jacente de la MCDA n’est que partiellement connue et les stratégies thérapeutiques actuelles se limitent à des mesures conservatrices ou à un remplacement valvulaire aortique, que ce soit par des procédures chirurgicales ou percutanées. À ce jour, aucun traitement médical efficace ne peut entraver ou inverser la progression de la MCDA et une mortalité élevée est associée à l’apparition précoce des symptômes, à moins qu’un remplacement valvulaire aortique (AVR) ne soit effectué2. Chez les patients présentant une sténose aortique symptomatique sévère, la survie sans symptôme à 3 ans a été rapportée aussi faible que 20%3. Le remplacement valvulaire aortique transcathéter (RVAC) représente une nouvelle option, révolutionnant le traitement des patients à haut risque, en particulier chez les personnes âgées, et a considérablement réduit la mortalité, qui était intrinsèquement élevée dans cette population4,5,6. Malgré les résultats prometteurs du RVAC, d’autres recherches sont nécessaires pour comprendre la physiopathologie de la MCDA afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques précoces7,8,9.
Auparavant considéré comme un processus passif et dégénératif, le CAVD est maintenant reconnu comme une maladie progressive active, caractérisée par un changement de phénotype ostéoblastique des cellules interstitielles de la valve aortique10. Cette maladie implique une minéralisation progressive, des changements fibrocalciques et une motilité réduite des folioles valvulaires aortiques (sclérose), ce qui obstrue finalement le flux sanguin conduisant à un rétrécissement (sténose) de l’ouverture de la valve aortique11.
L’inflammation est considérée comme un processus clé dans la physiopathologie de la MCDA, similaire au processus d’athérosclérose vasculaire. Les lésions endothéliales permettent le dépôt et l’accumulation d’espèces lipidiques, en particulier de lipoprotéines oxydées dans la valve aortique12. Ces lipoprotéines oxydées provoquent une réponse inflammatoire, car elles sont cytotoxiques, l’activité inflammatoire conduisant à la minéralisation. Le rôle de l’immunité innée et adaptative dans le développement de la MCDA et la progression de la maladie a récemment été souligné13. L’activation et l’expansion clonale de sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T mémoire ont été documentées chez des patients atteints de MCDA et de feuillets valvulaires aortiques minéralisés, de sorte que les processus inflammatoires sont supposés être impliqués au moins dans le développement de la MCDA et probablement aussi dans la progression de la maladie14. En fait, bien que les cellules présentatrices d’antigènes et les macrophages soient présents à la fois dans la valve saine et malade, la présence de lymphocytes T indique une valve aortique âgée et malade. Cet infiltrat lymphocytaire ainsi qu’une augmentation de la néovascularisation et de la métaplasie sont des signes histologiques caractéristiques de CAVD15.
Nous émettons l’hypothèse de l’existence d’une interaction entre les cellules interstitielles de la valve aortique et l’activation du système immunitaire, ce qui déclenche potentiellement l’initiation d’un processus inflammatoire chronique dans la valve aortique. Le dosage des lymphocytes T à partir du tissu valvulaire aortique sténotique pourrait être un moyen efficace de clarifier leur rôle dans le développement de la calcification, car il peut fournir une représentation proche des cellules valvulaires aortiques in vivo. Dans les travaux actuels, en utilisant du tissu valvulaire aortique, nous isolons les lymphocytes T, les cultivons et les clonons, puis les caractérisons à l’aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Des échantillons frais de valve aortique ont été excisés chez des patients atteints de MCDA qui ont reçu un remplacement valvulaire chirurgical pour une sténose aortique sévère. Après l’excision chirurgicale, l’échantillon de valve fraîche a été disséqué en petits morceaux et les cellules T ont été cultivées, clonées puis analysées à l’aide de la cytométrie en flux. La procédure de coloration est simple et les tubes colorés peuvent être fixés à l’aide de 0,5% de paraformaldéhyde et analysés jusqu’à 15 jours plus tard. Les données générées par le panneau de coloration peuvent être utilisées pour suivre les changements dans la distribution des lymphocytes T au fil du temps par rapport à l’intervention et pourraient facilement être développées pour évaluer les états d’activation de sous-ensembles spécifiques de lymphocytes T d’intérêt.
L’extraction de tissus calcifiés, l’isolement des leucocytes à partir de tissus calcifiés et en particulier l’utilisation de la cytométrie en flux sur ce type de tissu peuvent être difficiles, en raison de problèmes tels que l’autofluorescence. Il existe peu de publications contenant des protocoles à cette fin spécifique16,17,18. Nous présentons ici un protocole conçu spécifiquement pour l’isolement direct et la culture de lymphocytes T à partir d’échantillons de valves aortiques humaines. L’expansion clonale des lymphocytes est une caractéristique de l’immunité adaptative. L’étude de ce processus in vitro fournit des informations perspicaces sur le niveau d’hétérogénéité des lymphocytes19. Après une période d’incubation de trois semaines, les clones de lymphocytes T sont prêts à être explantés, car une quantité suffisante de lymphocytes T de chaque clone a été obtenue, afin de permettre l’étude phénotypique et fonctionnelle. Par la suite, le phénotype des clones T est étudié par cytofluorométrie.
Ce protocole immunologique est une adaptation d’une méthode précédemment développée par Amedei et al. pour l’isolement et la caractérisation des lymphocytes T à partir de tissus humains, spécialement conçue pour les tissus humains calcifiés, comme dans CAVD20,21,22. Le protocole ici pour l’isolement des PBMC (cellules mononucléaires du sang périphérique) à l’aide d’une couche bouffante irradiée décrit un moyen efficace d’obtenir des cellules nourricières (FC), spécifiquement ajustées pour la phase de clonage des lymphocytes T isolés des cellules interstitielles valvulaires. La couche nourricière est constituée de cellules arrêtées par la croissance, qui sont encore viables et bioactives. Le rôle des cellules nourricières est important pour soutenir la survie in vitro et la croissance des lymphocytes T isolés des cellules interstitielles valvulaires23. Afin d’éviter la prolifération des cellules nourricières en culture, ces cellules doivent subir un arrêt de croissance. Cela peut être réalisé de deux manières: par des méthodes physiques telles que l’irradiation, ou par un traitement avec des produits chimiques cytotoxiques, tels que la mitomycine C (MMC), un antibiotique antitumoral qui peut être appliqué directement à la surface de la culture24. Ici, nous montrons l’arrêt de la croissance des cellules nourricières réalisé par irradiation cellulaire.
Cette méthode présente un moyen efficace et rentable d’isoler et de caractériser les lymphocytes T du tissu valvulaire aortique, contribuant ainsi à élargir le spectre des méthodes immunologiques pour explorer la physiopathologie de la MCDA.
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Protocol
L’étude a été menée conformément au Statut de la Charité pour assurer les bonnes pratiques scientifiques et les directives légales et les dispositions sur la vie privée et l’éthique ont été respectées. Le comité d’éthique a approuvé toutes les expériences humaines et la vie privée et l’anonymat des patients ont été maintenus conformément aux règles énoncées sur le formulaire d’éthique.
REMARQUE: Pour le protocole décrit ci-dessous, des échantillons de valve sténotique humaine fraîche ont été utilisés.
1. Préparation du réactif
- Préparer le milieu complet RPMI enrichi en ajoutant RPMI 1640 Medium: Acides aminés non essentiels; Pyruvate de sodium, L-Glutamine, ß-Mercaptoéthanol et Pénicilline-Streptomycine (Pen/Strep). Filtrez-le avant utilisation. Conserver à +4 °C et utiliser dans les deux mois.
- Préparer le milieu de culture cellulaire (CCM) pour la phase de clonage à l’aide du milieu complet enrichi RPMI 1640 ajouté sérum fœtal bovin (FBS) inactivé par la chaleur, milieu basal HB, 50 U d’interleukine 2 (IL-2) et sérum humain (HS). Filtrez et utilisez-le dans la journée. Ne pas stocker.
- Préparer le milieu de culture cellulaire pour la phase de réalimentation à l’aide du milieu complet RPMI 1640 enrichi avec FBS, milieu basal HB, 30 U d’IL-2 et HS ajoutés. Filtrez et utilisez-le dans la journée. Ne pas stocker.
- Préparer le tampon de lavage contenant 250 mL de RPMI et 5 mL de stylo/streptocoque. Conserver à +4 °C, utiliser dans les deux mois.
2. Isolement et culture des lymphocytes T humains dans des flacons de T-25
- Placez l’échantillon de valve sténotique dans une boîte de Petri stérile remplie de tampon de lavage, en vous assurant que tout l’échantillon de valve en est recouvert. Laisser reposer pendant 15 minutes.
- Coupez la valve sténotique en petits morceaux à l’aide d’un scalpel et laissez-la reposer pendant 10 minutes.
- Préparez le milieu de culture cellulaire avec 50 U d’IL-2, comme décrit précédemment, et filtrez-le.
- Ajouter le CCM à l’intérieur des flacons T25 et, à l’aide d’une pince en plastique stérile, placer les pièces de vanne à l’intérieur des flacons.
- Conservez les flacons en position verticale à l’intérieur d’un incubateur à CO2 pendant une semaine, en prenant soin d’observer l’état de la fiole au microscope. Les clones de lymphocytes T doivent être visibles environ trois jours après l’étape de culture; pour une meilleure observation, il est conseillé de placer les flacons en position horizontale pendant 20 minutes avant l’analyse microscopique.
REMARQUE : La quantité de milieu de culture cellulaire dépend de la quantité d’échantillon présente et du nombre de flacons de T25 qui seront utilisés. Étant donné que chaque pièce de vanne nécessite 10 mL de CCM à l’intérieur d’une fiole, 25 mL de CCM dans une fiole T25 sont appropriées pour 3 pièces de vanne.
3. Phase de clonage
REMARQUE: Pour la phase de clonage des lymphocytes T, il est nécessaire de commencer par l’isolement des cellules nourricières d’une couche bouffante irradiée (BC), en suivant le protocole PBMC.
- Ouvrez le sac BC sous la hotte à écoulement laminaire à l’aide de la pointe du sac avec valve sans aiguille et transférez 50 mL de sang dans une fiole T150. Ajouter 70 mL de PBS pour diluer le sang à l’intérieur de la fiole.
- Prenez quatre tubes coniques de 50 mL et placez 20 mL de milieu de gradient de densité dans chacun d’eux et superposez soigneusement 30 mL de sang dessus.
- Centrifuger pendant 25 min à 800 x g et 20 °C avec le frein éteint.
- Aspirez soigneusement le surnageant et jetez-le comme déchet. Recueillir l’anneau PBMC dans un nouveau tube conique de 50 ml en ajoutant à l’intérieur de la solution PBS jusqu’à un volume de 50 ml.
- Centrifuger pendant 10 min à 400 x g et 20 °C.
- Jeter le surnageant et suspendre la pastille en ajoutant à l’intérieur de la solution PBS jusqu’à un volume de 50 mL. Répéter la phase de centrifugation pendant 10 min à 400 x g et 20 °C.
- Jeter le surnageant et suspendre les FC dans 10 mL de milieu de culture cellulaire.
- Prenez un nouveau tube de collecte et diluez les FC avec PBS 1:10 en ajoutant à l’intérieur 9,9 mL de PBS et 100 μL du tube avec des FC et un milieu de culture cellulaire. Rincez bien avec une pipette et prenez 7 μL de cette dilution et comptez les cellules au microscope.
- Préparer le milieu de culture cellulaire pour la phase de clonage: 70 mL avec 50 U d’IL-2, puis le diviser en deux tubes coniques de 50 mL, chaque tube contiendra 25 mL de milieu de culture cellulaire, comme décrit ci-dessous:
- Tube 1 : 25 mL de CCM + FC + 0,6 % de phytohémagglutinine (PHA)
- Tube 2 : 25 mL de lymphocytes CCM + T
REMARQUE: Le but de la méthode PMBCs est d’obtenir 2 x 106 cellules pour chaque mL, de sorte que les 25 mL de CCM préparés (tube 1) doivent être calculés en conséquence. La formule générale utilisée est la suivante : Nombre de cellules comptées x 106 : 1 mL = CCM x 106 : X
4. Culture de lymphocytes T dans des plaques multipuits
- À l’aide de la pipette électronique, recueillir tout le milieu de culture cellulaire à l’intérieur des flacons et le transférer dans un tube conique de 50 mL. Les flacons vides peuvent être jetés.
- Granulés les cellules par centrifugation pendant 10 min à 400 x g et 20 °C.
- Jeter le surnageant, suspendre la pastille dans 50 mL de PBS et prélever les cellules par centrifugation pendant 10 min à 400 x g et 20 °C. Répétez cette étape deux fois.
- Jeter le surnageant et suspendre la pastille dans 1 mL de CCM. Prélever 7 μL de cette dilution et compter les cellules au microscope.
REMARQUE: Le nombre de cellules comptées doit être multiplié pour le volume de la chambre et pour la dilution appliquée. - Procéder à la dilution des cellules comptées de 105 à 103 dans un milieu de culture cellulaire, puis prendre 500 μL de 103 et les mettre à l’intérieur du tube 2.
- Versez le milieu de culture cellulaire de 25 mL du tube 1 à l’intérieur d’une boîte de Petri en plastique de 100 mm x 15 mm.
- Prenez quatre plaques multipuits de fond de 96 U et utilisez une pipette multicanal réglée sur des FC de graines de 100 μL dans chaque puits.
- Prenez le Tube 2 et versez le milieu de culture cellulaire à l’intérieur d’une boîte de Pétri. À l’aide d’une pipette multicanal réglée sur 100 μL, ensemencez des lymphocytes T dans chaque puits.
- Conservez les plaques multipuits à l’intérieur d’un incubateur à CO2 pendant une semaine.
5. Première phase de réalimentation
- À l’aide d’un sac à manteau bouffant irradié, suivez la méthode pbMC pour obtenir des FC comme décrit dans la méthode précédente.
- Préparez la quantité appropriée de CCM sans PHA et filtrez-la.
- À l’aide d’une pipette multicanal, retirer 100 μL de chaque puits, en veillant à ne pas toucher le fond du puits.
- Ajouter 100 μL de FC dans tous les puits comme couche d’alimentation pour fournir des nutriments de culture cellulaire et changer le milieu.
REMARQUE: Pour chaque puits multiple, il est conseillé de considérer 6 mL de CCM, de sorte que la quantité recommandée pour 4 puits multiples est d’environ 30 mL. L’ASP (0,4 % de la quantité totale d’ICN) doit être ajoutée à l’ICN une fois toutes les deux semaines.
6. Deuxième phase de réalimentation
- Répétez la phase de réalimentation après le passage décrit ci-dessus. 0,4 % de PHA doit être ajouté au milieu de culture cellulaire.
7. Première phase de fractionnement de 1 puits/échantillon à 2 puits/échantillon
- Vérifiez les quatre puits multiples au microscope et divisez ces puits avec des clones de lymphocytes T (TCC).
- Suivez le protocole PBMC pour isoler les cellules nourricières d’un sac à manteau bouffi irradié.
- Préparer le milieu de culture cellulaire avec 30 U d’IL-2. Ajoutez les FC et prenez une nouvelle plaque multipuits de 96 puits avec fond en U.
- À l’aide d’une pipette réglée sur 100 μL, rincez bien à l’intérieur des puits des échantillons sélectionnés et divisez les 200 μL de volume contenus dans chaque puits en 2 nouveaux puits de la nouvelle plaque multipuits, afin d’avoir 100 μL de volume pour chacun des 2 nouveaux puits.
- Ajoutez 100 μL de FC à l’intérieur de tous les nouveaux puits. Chaque puits doit contenir un volume total de 200 μL.
- Réglez la pipette à 100 μL et ajoutez 100 μL dans deux puits supplémentaires, ne contenant que des FC pour servir de contrôle.
REMARQUE: Utilisez la microscopie optique pour observer toutes les plaques multipuits afin de déterminer quels puits ont réussi à développer TCC. Pour faciliter la sélection des clones, une comparaison peut être faite avec le contrôle (les deux puits ne contenant que des FC), le clone apparaissant plus sombre et plus grand par rapport au contrôle. Les puits à sélectionner sont ceux avec un grand clone clair et rond, avec des lymphocytes densément emballés ensemble. Si aucun TCC n’est présent après deux semaines de réalimentation, il est recommandé d’attendre une semaine de plus et d’effectuer une phase de réalimentation supplémentaire.
8. Deuxième phase de fractionnement de 2 puits/échantillon à 4 puits/échantillon
- Réglez la pipette à 100 μL, rincez bien à l’intérieur des deux puits de chaque échantillon et ensemencez deux nouveaux puits de 100 μL pour chacun.
- Préparez le milieu de culture cellulaire avec 30 U d’IL-2 et suivez la technique des PBMC pour extraire les FC du sac de buffy et placer les FC à l’intérieur du CCM.
- Réglez la pipette à 100 μL et ensemencez les FC dans tous les puits. Stockez les puits multiples dans un incubateur à CO2 pendant une semaine.
9. Troisième phase de fractionnement de 4 puits/échantillon à 8 puits/échantillon :
- À l’aide d’une pipette multicanal réglée sur 100 μL, rincez bien à l’intérieur des quatre puits de chaque échantillon et ensemencez 100 μL dans chacun des quatre nouveaux puits dans une nouvelle plaque de 96 puits.
- Préparez le milieu de culture cellulaire et suivez la technique des PBMC pour extraire les FC d’un sac à manteau bouffant irradié.
- Placez les FC à l’intérieur du CCM. Réglez la pipette à 100 μL et ensemencez les FC dans tous les puits. Stocker les puits multiples dans un incubateur à CO2 pendant une semaine
10. Analyse cytofluorimétrique
- Prenez la plaque multipuit avec la date la plus ancienne de l’incubateur à CO2 et identifiez les tubes de prélèvement avec les numéros d’échantillon à analyser.
- À l’aide d’une pipette multicanal réglée sur 200 μL avec 2 embouts, rincez soigneusement à l’intérieur de deux puits du même échantillon et mettez les deux dans le même tube de collecte. Répétez cette étape pour tous les exemples.
REMARQUE: Les échantillons de FC ne seront pas analysés, car ils ne servent que de contrôles.
11. Préparation du panneau de coloration des anticorps pour l’analyse cytofluorimétrique
- Ajouter 1 mL de solution pbS pour chaque tube et centrifuger pendant 10 min à 400 x g et 20 °C.
- Après la phase de centrifugation, jetez le surnageant.
REMARQUE: Le panneau de coloration des anticorps se trouve dans le tableau 1. Chaque concentration d’anticorps calculée est d’environ 2 μL/échantillon. Il est recommandé de faire tourner brièvement les tubes d’anticorps avant utilisation. Pour protéger les anticorps conjugués au fluorophore de la lumière, toutes les étapes doivent être effectuées dans l’obscurité. - Préparez le mélange d’anticorps à l’intérieur d’un tube de 1,5 mL et vortexez-le.
- Ajouter les anticorps à l’intérieur des échantillons et laisser les échantillons incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter 1 mL de PBS dans chaque échantillon et centrifuger pendant 10 min à 400 x g et 20 °C.
- Jeter le surnageant et suspendre la pastille avec 500 μL de solution de PBS.
- Procéder à l’analyse cytofluorimétrique (analyse FACS, tableau 1).
REMARQUE: Les échantillons colorés peuvent être fixés à l’aide de paraformaldéhyde (PFA) à 0,5% dilué dans une solution de PBS et analysés jusqu’à 15 jours plus tard.
ATTENTION : Le PFA est toxique et doit être manipulé avec précaution.
| Marqueur | Fluorophore |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Violet brillant 510 |
| CD14 | Violet brillant 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Violet brillant 711 |
Tableau 1. Panneau de coloration des anticorps pour détecter la population de lymphocytes T dans la maladie de la valve aortique de calcification.
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Representative Results
Nous avons utilisé une méthode simple et rentable pour caractériser la population leucocytaire d’échantillons valvulaires aortiques frais provenant de patients humains atteints de sténose valvulaire aortique sévère (voir protocole). La méthode d’isolement des PBMC est une étape essentielle dans l’obtention de cellules nourricières, qui sont utilisées à chaque étape de l’expérience (phases de clonage, de réalimentation et de fractionnement) et permettent la détection et la caractérisation des leucocytes infiltrants dans des échantillons de valve aortique. Les principales étapes de cette méthode sont illustrées à la figure 1.
Graphique 1. Les FC sont isolés du pelage bouffant. (A) Sang stratifié sur un milieu de gradient de densité (B) Anneau de globules blancs obtenu après centrifugation (C) Globules blancs prélevés et remis en suspension dans une solution de PBS (D) Globules blancs observés par microscopie optique Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Après deux semaines d’incubation, nous avons réussi à cloner et à développer une population de lymphocytes T, comme le montre la figure 2.
Graphique 2. Clone de lymphocytes T après deux semaines d’incubation observé en microscopie optique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La figure 3 illustre le schéma de contrôle utilisé pour l’analyse des sous-populations de lymphocytes T chez les patients atteints de MCDA. Comme le montre le résultat de l’analyse FACS, il y a plus de lymphocytes T CD4+ (43,032 %) que de lymphocytes T CD8+ (1,079 %).
Graphique 3. Schéma de contrôle utilisé pour l’analyse de la sous-population de lymphocytes T. (A) Une grille a été appliquée pour identifier la population spécifique de lymphocytes T dans une valve sténotique. (B) lymphocytes CD14 négatifs et lymphocytes CD3 positifs. (C) Les lymphocytes CD3 sont fermés pour distinguer les lymphocytes T CD4+ des lymphocytes T CD8+. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Pour montrer que les mêmes marqueurs de lymphocytes T sont présents à la fois dans les échantillons de valves natives et dans les échantillons clonés, nous avons effectué une analyse FACS sans la phase de clonage, comme illustré à la figure 4.
Graphique 4. Résultats d’analyse FACS de deux échantillons de valves. Nous avons comparé les lymphocytes T obtenus à partir d’un échantillon de valve native et d’un échantillon cloné, validant que les lymphocytes T trouvés dans la valve native partagent des marqueurs spécifiques des lymphocytes T dans le produit cloné final. (A) Résultats FACS d’un échantillon de valve natif, sans la phase de clonage. B) Résultats FACS de l’échantillon de valve analysé après la phase de clonage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
L’ensemble du flux de travail est résumé à la figure 5, en commençant par la dissection de la valve aortique humaine et en menant à l’analyse FACS. Toutes les étapes sont nécessaires pour l’analyse d’un échantillon de valve aortique. La phase 1 montre l’isolement lymphocytaire du tissu valvulaire aortique sténotique. Les échantillons de valve doivent être coupés et placés dans une boîte de Petri remplie de tampon de lavage. Les pièces de vanne peuvent être placées à l’intérieur d’une fiole T25 remplie de CCM et stockées dans un incubateur à CO2 pendant une semaine. La phase 2 montre la phase de clonage, qui se compose de deux parties: 1) l’isolement des FC du sac de pelage bouffant irradié et 2) la phase de clonage des lymphocytes T et culmine avec la culture cellulaire dans une plaque multipuits de 96 puits, qui est stockée dans un incubateur à CO2 pendant une semaine. Les phases 3 et 4 consistent en la phase de réalimentation à l’aide de FC à partir d’une couche bouffante irradiée; cette phase doit être répétée pendant deux semaines consécutives. Les phases 4, 5 et 6 montrent la phase de division des clones de lymphocytes T; la première phase de fractionnement est de 1 puits/échantillon à deux puits pour chaque échantillon dans une nouvelle plaque multipuits; la deuxième division est de 2 puits / échantillon à 4 puits pour chacun dans la même plaque multipuit; la troisième et dernière phase de fractionnement est de 4 puits/échantillon à 8 dans une nouvelle plaque multipuits. La phase 7 est la phase finale, où les échantillons sont analysés à l’aide de l’analyse FACS.
Graphique 5. CaVD Flux de travail expérimental. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
À partir des résultats préliminaires (Figure 2), nous pouvons conclure que les lymphocytes, ainsi que les leucocytes CD45+ sont présents dans les valves aortiques calcifiées, indiquant ainsi que la maladie de la valve aortique calcifiante est liée à l’activation du système immunitaire et à l’activité inflammatoire.
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Discussion
Nous présentons ici une méthode pour caractériser des sous-populations de lymphocytes T isolées à partir d’échantillons de valves aortiques sténotiques, en utilisant la cytométrie en flux. Cette méthode nécessite l’utilisation d’une couche bouffante irradiée pour isoler les PBMC. La fréquence de rayonnement à laquelle les sacs à manteau bouffant doivent être soumis est de 9000 Rad/90 Gray (Gy) et représente une étape cruciale pour arrêter la prolifération des cellules nourricières. Le rôle des cellules isolées des sacs de buffy est d’agir uniquement comme cellules nourricières et de fournir des nutriments aux cellules T isolées des valves. L’utilisation d’un sac à manteau bouffant non iradiqué favoriserait la prolifération des PBMC dans la culture, comme cela a été noté dans le passé25. Une fréquence de rayonnement inférieure à 90 Gy a montré la prolifération des PBMC en culture, nous recommandons donc d’utiliser exactement 90 Gy de rayonnement. Il est à noter qu’il est conseillé d’utiliser le buffy coat irradié le même jour ou au plus le lendemain, en le gardant sur un appareil qui le maintient dans une agitation constante. Une autre étape cruciale de cette méthode pourrait être représentée par la phase de clonage des lymphocytes, qui pourrait être affectée par des artefacts; pour éviter cet événement, nous effectuons le FACS sur des échantillons de valve aortique fraîche. La phase de clonage des lymphocytes T présente l’avantage d’obtenir un plus grand nombre de clones T (en moyenne 15 clones de lymphocytes T pour chaque valve) à analyser phénotypiquement et fonctionnellement, que le nombre obtenu à partir de l’analyse d’un échantillon frais. La technique de clonage est utilisée par ce groupe de recherche depuis de nombreuses années et selon le type de tissu analysé, le profil lymphocytaire était différent21,26,27. Le premier passage de la méthode concerne l’isolement des lymphocytes T d’une valve aortique sténotique. Toutes les étapes décrites doivent être effectuées sous une hotte à écoulement laminaire dans des conditions stériles et il est fortement recommandé de désinfecter tous les matériaux avant utilisation. Le temps nécessaire pour obtenir des résultats était de 6 semaines et la moyenne des lymphocytes T obtenus à partir de la phase de clonage était de 20 x 106 cellules. La phase de surveillance des plaques multipuits est très importante et ne doit pas être négligée. Un changement de couleur du milieu en jaune pourrait représenter une contamination bactérienne, auquel cas tous les instruments utilisés doivent être stérilisés et les plaques multipuits jetées.
Avant l’analyse FACS, il est important d’établir une porte appropriée, pour vérifier qu’il n’y a pas de chevauchement spécifique entre les canaux d’anticorps. Cela permet une séparation optimale entre les portes positives et négatives. L’utilisation des mêmes lots d’anticorps pour tous les échantillons impliqués dans l’étude est recommandée pour obtenir un résultat homogène. Il est également nécessaire de protéger les anticorps conjugués au fluorophore de la lumière, en effectuant toutes les étapes avec la lumière éteinte.
Cette méthode est efficace pour donner des résultats avec une reproductibilité élevée et n’est pas coûteuse. Une limitation de cette méthode est la petite taille de l’échantillon, en raison de la disponibilité limitée des échantillons de valve humaine, ainsi que de l’absence d’un groupe témoin.
Les résultats préliminaires soutiennent le rôle de l’immunité adaptative en tant qu’élément crucial dans le développement et la progression de la maladie de la valve aortique calcifiante. Tous les patients inclus dans cette étude avaient un diagnostic de sténose aortique calcifiante symptomatique sévère, avec un âge moyen de 70 ans, principalement des hommes. L’existence de populations de lymphocytes T dans les valves aortiques analysées fournit des preuves de l’activité inflammatoire de la valve aortique malade en tant que point de contrôle de l’activation des cellules immunitaires. Un point d’intérêt futur pourrait être d’analyser la fonctionnalité des lymphocytes T infiltrant les MCDA et de caractériser la spécificité des lymphocytes T telle qu’elle a été signalée précédemment dans des maladies similaires, comme dans l’athérosclérose28,29,30.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Tous les sacs à manteaux bouffants utilisés pour ce protocole ont été irradiés grâce à la disponibilité du Dr Peter Rosenthal, du Dr Dirk Böhmer et de toute l’équipe du département de radiologie de la Charité Benjamin Franklin. Boursière /Mary Roxana Christopher, ce travail est soutenu par une bourse de la Société allemande de cardiologie (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
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