Summary
Neste estudo, descrevemos o processo de isolamento de linfócitos T a partir de amostras frescas de válvulas aórticas calcificadas e as etapas analíticas da clonagem de células T para a caracterização dos subconjuntos leucócitos adaptativos usando a análise de citometria de fluxo.
Abstract
A doença da válvula aórtica calcificada (CAVD), um processo ativo da doença que vai desde o espessamento leve da válvula até a calcificação grave, está associada à alta mortalidade, apesar de novas opções terapêuticas como a substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR).
As vias completas que começam com a calcificação da válvula e levam a estenose aórtica grave permanecem apenas parcialmente compreendidas. Ao fornecer uma representação atenta das células válvulas aórticas in vivo, o ensaio de linfócitos T a partir do tecido da válvula estenótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação. Após a excisão cirúrgica, a amostra fresca da válvula aórtica é dissecada em pequenos pedaços e os linfócitos T são cultivados, clonados e analisados por meio de triagem celular ativada de fluorescência (FACS).
O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados também podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os resultados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações nas concentrações de células T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subtipos específicos de células T de interesse. Neste estudo, mostramos o isolamento das células T, realizado em amostras de válvula aórtica calcificada fresca e as etapas de análise de clones de células T usando citometria de fluxo para entender melhor o papel da imunidade adaptativa na fisiopatologia cavd.
Introduction
A doença da válvula aórtica calcífica (CAVD) é uma das doenças mais comuns da válvula cardíaca, com forte impacto na assistência à saúde. A frequência de substituição da válvula aórtica nos últimos anos aumentou drasticamente e espera-se que aumente ainda mais, devido à crescente população idosa1.
A fisiopatologia subjacente do CAVD é apenas parcialmente conhecida e as estratégias terapêuticas atuais estão limitadas a medidas conservadoras ou substituição da válvula aórtica, seja através de procedimentos cirúrgicos ou percutâneos. Até o momento, nenhum tratamento médico eficaz pode dificultar ou reverter a progressão do CAVD e a alta mortalidade está associada ao início precoce dos sintomas, a menos que seja realizada a substituição da válvula aórtica (AVR). Em pacientes com estenose aórtica aórtica sintomática grave, a sobrevida sem sintomas de 3 anos foi relatada como baixa de 20%3. A substituição da válvula aórtica transcateter (TAVR) representa uma nova opção, revolucionando o tratamento para pacientes de alto risco, especialmente entre os idosos e reduziu drasticamente a mortalidade, que era intrinsecamente alta nessa população4,5,6. Apesar dos resultados promissores do TAVR, novas pesquisas são necessárias para entender a fisiopatologia CAVD para identificar novos alvos terapêuticos precoces7,8,9.
Antes considerado um processo passivo e degenerativo, o CAVD é agora reconhecido como uma doença progressiva ativa, caracterizada por um interruptor de fenótipo osteoblástico das células intersticiais da válvula aórtica10. Esta doença envolve mineralização progressiva, alterações fibrocalcísicas e redução da motilidade dos folhetos da válvula aórtica (esclerose), que acabam por obstruir o fluxo sanguíneo levando ao estreitamento (estenose) da abertura da válvula aórtica11.
A inflamação é considerada um processo-chave na fisiopatologia CAVD, semelhante ao processo de aterosclerose vascular. A lesão endotelial permite a deposição e o acúmulo de espécies lipídicas, especialmente lipoproteínas oxidadas na válvula aórtica12. Essas lipoproteínas oxidadas provocam uma resposta inflamatória, por serem citotóxica, com a atividade inflamatória levando à mineralização. O papel da imunidade inata e adaptativa no desenvolvimento da CAVD e na progressão da doença foi recentemente destacado13. A ativação e a expansão clonal de subconjuntos específicos de células T de memória foram documentados em pacientes com CAVD e folhetos de válvulas aórticas mineralizados, de modo que os processos inflamatórios são assumidos como envolvidos pelo menos no desenvolvimento do CAVD e, presumivelmente, na progressão da doença também14. De fato, embora as células e macrófagos que apresentem antígenos estejam presentes tanto na válvula saudável quanto na doença, a presença de linfócitos T é indicativa de uma válvula aórtica envelhecida e doente. Este infiltrado linfocítico junto com um aumento na neovascularização e metaplasia são sinais histológicos característicos do CAVD15.
Nós hipótesemos a existência de uma interação entre as células interstices da válvula aórtica e a ativação do sistema imunológico, o que potencialmente desencadeia o início de um processo inflamatório crônico na válvula aórtica. O ensaio das células T a partir do tecido da válvula aórtica estótica pode ser uma maneira eficiente de esclarecer seu papel no desenvolvimento da calcificação, pois pode fornecer uma representação próxima das células válvulas aórticas in vivo. No presente trabalho, utilizando tecido da válvula aórtica, isolamos linfócitos T, cultura e cloná-los, e posteriormente os caracterizamos usando a triagem celular ativada pela fluorescência (FACS). Amostras frescas de válvulas aórticas foram excisadas de pacientes cavd que receberam substituição da válvula cirúrgica para estenose aórtica grave. Após a excisão cirúrgica, a amostra de válvula fresca foi dissecada em pequenos pedaços e as células T foram cultivadas, clonadas e então analisadas por citometria de fluxo. O procedimento de coloração é simples e os tubos manchados podem ser fixados usando 0,5% de paraformaldeído e analisados até 15 dias depois. Os dados gerados a partir do painel de coloração podem ser usados para rastrear alterações na distribuição de linfócitos T ao longo do tempo em relação à intervenção e poderiam ser facilmente desenvolvidos para avaliar estados de ativação de subconjuntos específicos de células T de interesse.
A extração de tecido calcificado, o isolamento de leucócitos do tecido calcificado e, particularmente, o uso de citometria de fluxo neste tipo de tecido podem ser desafiadores, devido a questões como a autofluorescência. Poucas publicações existem com protocolos para este propósito específico16,17,18. Aqui apresentamos um protocolo projetado especificamente para o isolamento direto e cultura do linfócito T a partir de amostras de válvulas aórticas humanas. A expansão clonal de linfócitos é uma marca registrada da imunidade adaptativa. Estudar esse processo in vitro fornece informações perspicazes sobre o nível de heterogeneidade linfócito19. Após um período de incubação de três semanas, os clones de células T estão prontos para serem explantados, pois uma quantidade adequada de células T de cada clone foi obtida, de modo a permitir o estudo fenotípico e funcional. Posteriormente, o fenótipo dos clones T é estudado por citofluorometria.
Este protocolo imunológico é uma adaptação de um método anteriormente desenvolvido pela Amedei et al. para isolamento celular T e caracterização do tecido humano, especialmente projetado para tecido humano calcificado, como em CAVD20,21,22. O protocolo aqui para o isolamento de PBMCs (células mononucleares de sangue periféricos) usando casaco de buffy irradiado descreve uma maneira eficaz de obter células alimentadoras (FC), especificamente ajustadas para a fase de clonagem de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula. A camada alimentador consiste em células presas em crescimento, que ainda são viáveis e bioativas. O papel das células alimentadoras é importante para apoiar a sobrevivência in vitro e o crescimento de linfócitos T isolados das células intersticiais da válvula23. Para evitar a proliferação de células alimentados na cultura, essas células devem sofrer uma parada de crescimento. Isso pode ser alcançado de duas maneiras: através de métodos físicos como a irradiação, ou através do tratamento com produtos químicos citotóxicos, como a mitomicina C (MMC), um antibiótico antitumoral que pode ser aplicado diretamente à superfície da cultura24. Aqui mostramos a prisão de crescimento celular alimentador alcançada através da irradiação celular.
Este método apresenta uma maneira eficiente e econômica de isolar e caracterizar células T a partir do tecido da válvula aórtica, contribuindo para a ampliação do espectro de métodos imunológicos para a exploração da fisiopatologia CAVD.
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Protocol
O estudo foi realizado de acordo com o Estatuto do Charité para Assegurar boas Práticas Científicas e respeitadas as diretrizes legais e disposições sobre privacidade e ética. O Comitê de Ética aprovou todos os experimentos humanos e a privacidade e o anonimato dos pacientes foram mantidos de acordo com as regras relatadas no Formulário de Ética.
NOTA: Para o protocolo descrito abaixo foram utilizadas amostras frescas de válvulas estenóticas humanas.
1. Preparação do reagente
- Prepare o meio completo RPMI enriquecido adicionando em RPMI 1640 Médio: aminoácidos não essenciais; Piruvato de Sódio, L-Glutamina, ß-Mercaptoethanol e Penicilina-Streptomicina (Pen/Strep). Filtre-o antes de usá-lo. Armazene a +4 °C e use dentro de dois meses.
- Prepare o meio de cultura celular (CCM) para a fase de clonagem utilizando o meio completo RPMI 1640 completo adicionado por calor (FBS), hb basal médio, 50 U de Interleucina 2 (IL-2) e Soro Humano (HS). Filtre e use-o dentro de um dia. Não guarde.
- Prepare o meio de cultura celular para a fase de realimentação utilizando o meio completo RPMI 1640 enriquecido com Aturado FBS, meio basal HB, 30 U de IL-2 e HS. Filtre e use-o dentro de um dia. Não guarde.
- Prepare o tampão de lavagem contendo 250 mL de RPMI e 5 mL Pen/Strep. Armazene a +4 °C, use dentro de dois meses.
2. Isolamento e cultura de linfócitos T humanos em frascos T-25
- Coloque a amostra da válvula estenótica em uma placa de Petri estéril cheia de tampão de lavagem, garantindo que toda a amostra da válvula esteja coberta com ela. Deixe ficar por 15 minutos.
- Corte a válvula estética em pequenos pedaços usando um bisturi e deixe-a de pé novamente por 10 minutos.
- Prepare o meio de cultura celular com 50 U de IL-2, como descrito anteriormente, e filtre-o.
- Adicione o CCM dentro dos frascos T25 e usando um plier de plástico estéril, coloque as peças da válvula dentro dos frascos.
- Armazene os frascos em uma posição vertical dentro de uma incubadora de CO2 por uma semana, tomando o cuidado de observar o status do frasco sob o microscópio. Os clones de células T devem ser visíveis aproximadamente três dias após a etapa cultural; para melhor observação é aconselhável colocar os frascos na posição horizontal por 20 minutos antes da análise microscópica.
NOTA: A quantidade de meio de cultura celular depende da quantidade de amostra presente e de quantos frascos T25 serão utilizados. Considerando que cada pedaço de válvula requer 10 mL de CCM dentro de um frasco, 25 mL de CCM em um frasco T25 é apropriado para 3 pedaços de válvula.
3. Fase de clonagem
NOTA: Para a fase de clonagem das células T, é necessário começar com o isolamento das células alimentador a partir de uma camada de buffy irradiada (BC), seguindo o protocolo pbmcs.
- Abra o saco BC sob a coifa de fluxo laminar usando o espigão do saco com válvula livre de agulha e transfira 50 mL de sangue em um frasco T150. Adicione 70 mL de PBS para diluir o sangue dentro do frasco.
- Pegue quatro tubos cônicos de 50 mL e coloque 20 mL de gradiente de densidade em cada um e cuidadosamente camada 30 mL de sangue sobre ele.
- Centrifugar por 25 min a 800 x g e 20 °C com o freio desligado.
- Aspire cuidadosamente o supernaste e descarte-o como lixo. Colete o anel pbmcs em um novo tubo cônico de 50ml adicionando dentro da solução PBS até um volume de 50ml.
- Centrifugar por 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Descarte o supernatante e suspenda a pelota adicionando dentro da solução PBS até um volume de 50 mL. Repita a fase de centrifugação por 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Descarte o supernatante e suspenda os FCs em 10 mL de meio de cultura celular.
- Pegue um novo tubo de coleta e dilua os FCs com PBS 1:10 adicionando dentro de 9,9 mL de PBS e 100 μL do tubo com FCs e meio de cultura celular. Enxágüe bem com uma pipeta e tire 7 μL desta diluição e conte as células sob o microscópio.
- Prepare o meio de cultura celular para a fase de clonagem: 70 mL com 50 U de IL-2 e, em seguida, divida-o em dois tubos cônicos de 50 mL, cada tubo conterá 25 mL de meio de cultura celular, como descrito abaixo:
- Tubo 1: 25 mL de CCM + FCs + 0,6% de fitohemagglutinina (PHA)
- Tubo 2: 25 mL de linfócitos CCM + T
NOTA: O objetivo do método PMBCs é obter 2 x 106 células para cada mL, de modo que os 25 mL de CCM preparados (Tubo 1) precisam ser calculados em conformidade. A fórmula geral utilizada é: Número de células contadas x 106: 1 mL = CCM x 106: X
4. T Cultura de linfócitos em placas multiwell
- Usando a pipeta eletrônica, colete todo o meio de cultura celular dentro dos frascos e transfira-o para um tubo cônico de 50 mL. Os frascos vazios podem ser jogados fora.
- Pelota as células por centrifugação por 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Descarte o supernasce, suspenda a pelota em 50 mL de PBS e colete as células por centrifugação por 10 minutos a 400 x g e 20 °C. Repita este passo duas vezes.
- Descarte o supernatante e suspenda a pelota em 1 mL de CCM. Pegue 7 μL desta diluição e conte as células sob o microscópio.
NOTA: O número de células contadas precisa ser multiplicado para o volume da câmara e para a diluição aplicada. - Proceda para diluir as células contadas de 105 a 103 em meio de cultura celular e, em seguida, tomar 500 μL de 103 e colocá-lo dentro do tubo 2.
- Despeje o meio de cultura celular de 25 mL do tubo 1 dentro de uma placa de Petri de plástico de 100 mm x 15 mm.
- Pegue quatro placas multiwell inferiores de 96-U e usando uma pipeta multicanal definida para 100 FCs de sementes de μL em cada poço.
- Pegue o tubo 2 e despeje o meio de cultura celular dentro de uma placa de Petri. Usando uma pipeta multicanal definida para 100 μL, células T de sementes em cada poço.
- Armazene as placas multiwell dentro de uma incubadora de CO2 por uma semana.
5. Primeira fase de refeeding
- Usando um saco de casaco de buffy irradiado, siga o método PBMCs para obter FCs como descrito no método anterior.
- Prepare a quantidade adequada de CCM sem PHA e filtre-a.
- Usando uma pipeta multicanal, remova 100 μL de cada poço, garantindo não tocar na parte inferior do poço.
- Adicione 100 μL de FCs em todos os poços como uma camada de alimentação para fornecer nutrientes à cultura celular e alterar o meio.
NOTA: Para cada multiwell é aconselhável considerar 6 mL de CCM, de modo que a quantidade recomendada para 4 multiwells é de cerca de 30 mL. A PHA (0,4% da quantidade total de CCM) precisa ser adicionada ao CCM uma vez a cada duas semanas.
6. Segunda fase de refeeding
- Repita a fase de refeeding após a passagem descrita acima. 0,4% PHA precisa ser adicionado ao meio de cultura celular.
7. Primeira fase de divisão de 1 poço/amostra para 2 poços/amostra
- Verifique todos os quatro multi-poços sob o microscópio e vá em frente dividindo esses poços com clones de células T (TCCs).
- Siga o protocolo PBMCs para isolar células alimentadoras de um saco de casacos de buffy irradiados.
- Prepare o meio de cultura celular com 30 U de IL-2. Adicione os FCs e pegue uma nova placa multiwell de 96 poços com fundo U.
- Utilizando uma pipeta definida a 100 μL, enxágue bem dentro dos poços das amostras selecionadas e divida os 200 μL de volume contidos em cada poço em 2 novos poços da nova placa multiwell, a fim de ter 100 μL de volume para cada um dos novos 2 poços.
- Adicione 100 μL de FCs dentro de todos os novos poços. Cada poço deve conter um volume total de 200 μL.
- Coloque a pipeta em 100 μL e adicione 100 μL em dois poços adicionais, contendo apenas FCs para servir como controle.
NOTA: Use microscopia leve para observar todas as placas multi-poços, a fim de determinar quais poços cresceram com sucesso O TCC. Para facilitar a seleção de clones, uma comparação pode ser feita ao controle (os dois poços contendo apenas FCs), com o clone parecendo mais escuro e maior em comparação com o controle. Os poços a serem selecionados são aqueles com um clone grande, claro e redondo, com linfócitos densamente embalados juntos. Se não houver TCCs após duas semanas de refeeding, é recomendável esperar mais uma semana e realizar uma fase adicional de refeeding.
8. Segunda fase de divisão de 2 poços/amostra para 4 poços/amostra
- Coloque a pipeta em 100 μL, enxágue bem dentro dos dois poços de cada amostra e semente dois novos poços de 100 μL para cada um.
- Prepare o meio de cultura celular com 30 U de IL-2 e siga a técnica de PBMCs para extrair os FCs do saco de casaco e colocar os FCs dentro do CCM.
- Coloque a pipeta em 100 μL e semente os FCs em todos os poços. Armazene os multiwells em uma incubadora de CO2 por uma semana.
9. Terceira fase de divisão de 4 poços/amostra para 8 poços/amostra:
- Usando uma pipeta multicanal definida para 100 μL, enxágue bem dentro de todos os quatro poços de cada amostra e sementes de 100 μL em cada um dos quatro novos poços em uma nova placa de 96 poços.
- Prepare o meio de cultura celular e siga a técnica de PBMCs para extrair os FCs de um saco de casacos de buffy irradiado.
- Coloque os FCs dentro do CCM. Coloque a pipeta em 100 μL e semente os FCs em todos os poços. Armazene os multiwells em uma incubadora de CO2 por uma semana
10. Análise citofluoremétrica
- Pegue a placa multiwell com a data mais antiga da incubadora de CO2 e identifique os tubos de coleta com os números da amostra para analisar.
- Utilizando uma pipeta multicanal definida para 200 μL com 2 pontas, enxágue completamente dentro de dois poços da mesma amostra e coloque ambos dentro do mesmo tubo de coleta. Repita este passo para todas as amostras.
NOTA: As amostras de FCs não serão analisadas, pois servem apenas como controles.
11. Preparação do painel de coloração de anticorpos para análise citofluormétrica
- Adicione 1 mL de solução PBS para cada tubo e centrífuga por 10 minutos a 400 x g e 20 °C.
- Após a fase de centrifugação, descarte o supernatante.
NOTA: O painel de coloração de anticorpos pode ser encontrado na Tabela 1. Cada concentração de anticorpos calculada é de cerca de 2 μL/amostra. Recomenda-se girar brevemente os tubos de anticorpos antes de usar. Para proteger os anticorpos conjugados fluoróforos da luz, todos os passos devem ser realizados no escuro. - Prepare a mistura de anticorpos dentro de um tubo de 1,5 mL e vórtice.
- Adicione os anticorpos dentro das amostras e deixe amostras para incubar no escuro à temperatura ambiente por 15 minutos.
- Adicione 1 mL de PBS em cada amostra e centrífuga por 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Descarte o supernatante e suspenda a pelota com 500 μL de solução PBS.
- Proceder com a análise citofluormétrica (análise FACS, Tabela 1).
NOTA: As amostras manchadas podem ser fixadas utilizando 0,5% de paraformaldeído (PFA) diluído em solução PBS e analisado até 15 dias depois.
ATENÇÃO: O PFA é tóxico e deve ser manuseado com cuidado.
| Marcador | Fluoróforo |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Violeta brilhante 510 |
| CD14 | Violeta brilhante 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Violeta brilhante 711 |
Mesa 1. Painel de coloração de anticorpos para detectar a população de linfócitos T em doença da válvula aórtica de calcificação.
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Representative Results
Utilizamos um método simples e econômico para caracterizar a população leucócito de amostras frescas de válvulas aórticas derivadas de pacientes humanos com estenose de válvula aórtica grave (consulte o protocolo). O método de isolar os PBMCs é um passo vital na obtenção de células alimentadoras, que são usadas em todas as etapas do experimento (clonagem, realimentação e divisão de fases) e permitem a detecção e caracterização de leucócitos infiltrados em amostras de válvulas aórticas. Os passos-chave deste método são mostrados na Figura 1.
Figura 1. FCs isolamento de casaco buffy. (A) Sangue em camadas sobre o gradiente de densidade médio (B) O anel de glóbulos brancos obtido após a centrifugação (C) Os glóbulos brancos coletados e resuspentados em células brancas da solução PBS (D) observadas sob microscopia leve Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Após duas semanas de incubação, clonamos com sucesso e crescemos uma população de células T, como mostra a Figura 2.
Figura 2. Clone de células T após duas semanas de incubação observada usando microscopia leve. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A Figura 3 ilustra o esquema de gating utilizado para a análise de subpopulações de células T em pacientes com CAVD. Como mostrado no resultado da análise FACS, há mais células T CD4+ (43,032%) do que células T CD8+ (1,079%).
Figura 3. Esquema de gating utilizado para análise de subpopulação de células T. (A) Um portão foi aplicado para identificar a população específica de células T em uma válvula estenótica. (B) Linfócitos negativos CD14 e linfócitos CD3 positivos. (C) Os linfócitos CD3 são fechados para distinguir células CD4+ T das células CD8+T. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Para mostrar que os mesmos marcadores de células T estão presentes em amostras de válvulas nativas e amostras clonadas, realizamos análises FACS sem a fase de clonagem, conforme ilustrado na Figura 4.
Figura 4. Resultados da análise FACS de duas amostras de válvulas. Comparamos as células T obtidas a partir de uma amostra de válvula nativa e uma amostra clonada, validando que as células T encontradas na válvula nativa compartilham marcadores específicos das células T no produto clonado final. (A) Resultados FACS de uma amostra de válvula nativa, sem a fase de clonagem. (B) Resultados FACS da amostra da válvula analisada após a fase de clonagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Todo o fluxo de trabalho é resumido na Figura 5, a partir da dissecção da válvula aórtica humana e que leva à análise FACS. Todas as etapas são necessárias para a análise de uma amostra de válvula aórtica. A fase 1 mostra o isolamento do linfócito do tecido da válvula aórtica estética. As amostras da válvula precisam ser cortadas e colocadas em uma placa de Petri cheia de tampão de lavagem. As peças da válvula podem ser colocadas dentro de um frasco T25 cheio de CCM e armazenado em uma incubadora de CO2 por uma semana. A fase 2 mostra a fase de clonagem, que consiste em duas partes: 1) Isolamento de FCs de saco de casaco polido irradiado e 2) Fase de clonagem de células T e culmina com a cultura celular em uma placa multiwell de 96 poços, que é armazenada em uma incubadora de CO2 por uma semana. As fases 3 e 4 consistem na fase de realimentação utilizando FCs de casaco de buffy irradiado; esta fase deve ser repetida por duas semanas consecutivas. As fases 4, 5 e 6 mostram a fase de divisão dos clones de células T; a primeira fase de divisão é de 1 bem/amostra para dois poços para cada amostra em uma nova placa multiwell; a segunda divisão é de 2 poços /amostra para 4 poços para cada um na mesma placa multiwell; a terceira e última fase de divisão é de 4 poços/amostra para 8 em uma nova placa multiwell. A fase 7 é a fase final, onde as amostras são analisadas por meio da análise FACS.
Figura 5. Fluxo de trabalho experimental cavd. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
A partir dos resultados preliminares (Figura 2) podemos concluir que os linfócitos, juntamente com os leucócitos CD45+ estão presentes em válvulas aórticas calcificadas, indicando assim que a doença da válvula aórtica calcifica está ligada à ativação do sistema imunológico e à atividade inflamatória.
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Discussion
Aqui apresentamos um método para caracterizar subpopulações de linfócitos T isoladas de amostras de válvulas aórticas esténticas, utilizando citometria de fluxo. Este método requer o uso de casaco de buffy irradiado para isolar os PBMCs. A frequência de radiação à qual os sacos de casacos buffy devem ser submetidos é 9000 Rad/90 Gray (Gy) e representa um passo crucial para parar a proliferação das células alimentadoras. O papel das células isoladas dos sacos de casacos buffy é agir apenas como células alimentadoras e fornecer nutrientes para as células T isoladas das válvulas. O uso de um saco de casaco buffy unirradiaded promoveria a proliferação de PBMCs na cultura, como foi observado nos últimos 25 anos. Uma frequência de radiação abaixo de 90 Gy mostrou a proliferação de PBMCs na cultura, por isso recomendamos usar exatamente 90 Gy de radiação. Note-se que é aconselhável usar o casaco de buffy irradiado no mesmo dia ou no máximo no dia seguinte, mantendo-o em um dispositivo que o mantém em constante agitação. Outro passo crucial desse método poderia ser representado pela fase de clonagem de linfócitos, que poderia ser afetada por artefatos; para evitar este evento realizamos o FACS em amostras frescas de válvula aórtica. A fase de clonagem de linfócitos T tem a vantagem de obter um número maior de clones T (uma média de 15 clones de células T para cada válvula) a serem analisados fenotipicamente e funcionalmente, do que o número obtido a partir da análise de uma amostra fresca. A técnica de clonagem tem sido utilizada por esse grupo de pesquisa há muitos anos e, dependendo do tipo de tecido analisado, o perfil do linfócito foi diferente21,26,27. A primeira passagem do método diz respeito ao isolamento da célula T a partir de uma válvula aórtica estenótica. Todas as etapas descritas devem ser realizadas sob uma coifa de fluxo laminar em condições estéreis e é fortemente recomendado para desinfetar todos os materiais antes do uso. O tempo necessário para obter resultados foi de 6 semanas e a média das células linfócitos T obtidas da fase de clonagem foi de 20 x 106 células. A fase de monitoramento das placas multiwell é muito importante e não deve ser negligenciada. Uma mudança na cor do meio para o amarelo poderia representar contaminação bacteriana, nesse caso todos os instrumentos utilizados precisam ser esterilizados e as placas multiwell jogadas fora.
Antes da análise facs é importante estabelecer um portão adequado, para verificar se não há sobreposição específica entre os canais de anticorpos. Isso permite a separação ideal entre portões positivos e negativos. Recomenda-se o uso dos mesmos lotes de anticorpos para todas as amostras envolvidas no estudo para obter resultado homogêneo. Também é necessário proteger os anticorpos conjugados fluoróforos da luz, realizando todas as etapas com a luz desligada.
Este método é eficaz em produzir resultados com alta reprodutibilidade e não é caro. Uma limitação deste método é o pequeno tamanho amostral, devido à limitada disponibilidade das amostras de válvulas humanas, bem como à falta de um grupo controle.
Os resultados preliminares apoiam o papel da imunidade adaptativa como elemento crucial no desenvolvimento e progressão da doença da válvula aórtica calcifica. Todos os pacientes inscritos neste estudo apresentaram diagnóstico de estenose aórtica aórtica calcificática sintomática grave, com idade média de 70 anos, a maioria do sexo masculino. A existência de populações de células T nas válvulas aórticas analisadas fornece evidências para a atividade inflamatória da válvula aórtica doente como um ponto de verificação da ativação de células imunes. Um ponto de interesse futuro poderia ser analisar a funcionalidade das células T infiltradas em CAVD e caracterizar a especificidade das células T como relatado anteriormente em doenças semelhantes, como na aterosclerose28,29,30.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Todos os sacos de casacos polidos usados para este protocolo foram irradiados graças à disponibilidade do Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer e toda a equipe do Departamento de Radiologia de Charité Benjamin Franklin. Bolsista/Mary Roxana Christopher, este trabalho é apoiado por uma bolsa de estudos da Sociedade Cardíaca Alemã (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
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