Summary
В этом исследовании мы описываем процесс выделения Т-лимфоцитов из свежих образцов кальцинированных аортальных клапанов и аналитические этапы клонирования Т-клеток для характеристики адаптивных подмножеств лейкоцитов с использованием анализа проточной цитометрии.
Abstract
Кальцифицирующее заболевание аортального клапана (CAVD), активный процесс заболевания, начиная от легкого утолщения клапана до тяжелой кальцификации, связано с высокой смертностью, несмотря на новые терапевтические возможности, такие как транскатетерная замена аортального клапана (TAVR).
Полные пути, которые начинаются с кальцификации клапанов и приводят к тяжелому стенозу аорты, остаются лишь частично понятыми. Обеспечивая близкое представление клеток аортального клапана in vivo, анализ Т-лимфоцитов из стенотической ткани клапана может быть эффективным способом уточнения их роли в развитии кальцификации. После хирургического иссечения свежий образец аортального клапана рассекается на небольшие кусочки, а Т-лимфоциты культивируются, клонируются, а затем анализируются с использованием флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS).
Процедура окрашивания проста, и окрашенные трубки также могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида и проанализированы до 15 дней спустя. Результаты, полученные с панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений концентраций Т-клеток с течением времени в отношении вмешательства и могут быть легко дополнительно разработаны для оценки состояний активации конкретных подтипов Т-клеток, представляющих интерес. В этом исследовании мы показываем изоляцию Т-клеток, выполненную на свежих кальцинированных образцах аортального клапана, и этапы анализа клонов Т-клеток с использованием проточной цитометрии для дальнейшего понимания роли адаптивного иммунитета в патофизиологии CAVD.
Introduction
Заболевание кальцификального аортального клапана (CAVD) является одним из наиболее распространенных нарушений сердечного клапана, оказывающих сильное влияние на здравоохранение. Частота замены аортального клапана в последние годы резко возросла и, как ожидается, будет увеличиваться и дальше, в связи с ростом пожилого населения1.
Основная патофизиология CAVD известна лишь частично, и современные терапевтические стратегии ограничены консервативными мерами или заменой аортального клапана, либо хирургическими, либо чрескожными процедурами. На сегодняшний день никакое эффективное медицинское лечение не может препятствовать или обращать вспять прогрессирование CAVD, а высокая смертность связана с ранним появлением симптомов, если не выполнена замена аортального клапана (AVR)2. У пациентов с тяжелым симптоматическим стенозом аорты 3-летняя безсимптомная выживаемость составляла всего 20%3. Транскатетерная замена аортального клапана (TAVR) представляет собой новый вариант, революционизирующий лечение пациентов с высоким риском, особенно среди пожилых людей, и резко снизил смертность, которая была по своей сути высокой в этой популяции4,5,6. Несмотря на многообещающие результаты TAVR, необходимы дальнейшие исследования для понимания патофизиологии CAVD для выявления новых ранних терапевтических целей7,8,9.
Ранее считавшийся пассивным, дегенеративным процессом, CAVD теперь признан активным прогрессирующим заболеванием, характеризующимся остеобластным фенотипом интерстициальных клеток аортального клапана10. Это заболевание включает прогрессирующую минерализацию, фиброкальцификальные изменения и снижение подвижности листков аортального клапана (склероз), которые в конечном итоге препятствуют кровотоку, приводя к сужению (стенозу) отверстия аортального клапана11.
Воспаление считается ключевым процессом в патофизиологии CAVD, похожим на процесс атеросклероза сосудов. Повреждение эндотелия позволяет откладывать и накапливать липидные виды, особенно окисленные липопротеины в аортальном клапане12. Эти окисленные липопротеины провоцируют воспалительную реакцию, так как они цитотоксичны, а воспалительная активность приводит к минерализации. Недавно была подчеркнута роль врожденного и адаптивного иммунитета в развитии CAVD и прогрессировании заболевания13. Активация и клональное расширение специфических подмножеств Т-клеток памяти были задокументированы у пациентов с CAVD и минерализованными листочками аортального клапана, так что предполагается, что воспалительные процессы участвуют, по крайней мере, в развитии CAVD и, по-видимому, в прогрессировании заболевания14. Фактически, хотя антигенпрезентирующие клетки и макрофаги присутствуют как в здоровом, так и в больном клапане, присутствие Т-лимфоцитов свидетельствует о стареющем и больном аортальном клапане. Этот лимфоцитарный инфильтрат наряду с увеличением неоваскуляризации и метаплазии являются характерными гистологическими признаками CAVD15.
Выдвигается гипотеза о существовании взаимодействия между интерстициальными клетками аортального клапана и активацией иммунной системы, что потенциально провоцирует инициацию хронического воспалительного процесса в аортальном клапане. Анализ Т-клеток из стенотической ткани аортального клапана может быть эффективным способом уточнения их роли в развитии кальцификации, поскольку он может обеспечить близкое представление клеток аортального клапана in vivo. В настоящей работе, используя ткань аортального клапана, мы изолируем Т-лимфоциты, культивируем и клонируем их, а затем характеризуем их с помощью флуоресцентно-активированной клеточной сортировки (FACS). Свежие образцы аортального клапана были вырезаны у пациентов с CAVD, которые получили хирургическую замену клапана при тяжелом аортальном стенозе. После хирургического иссечения свежий образец клапана рассекали на небольшие кусочки, а Т-клетки культивировали, клонировали, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Процедура окрашивания проста, и окрашенные трубки могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида и проанализированы до 15 дней спустя. Данные, полученные с панели окрашивания, могут быть использованы для отслеживания изменений в распределении Т-лимфоцитов с течением времени в отношении вмешательства и могут быть легко дополнительно разработаны для оценки состояний активации конкретных подмножеств Т-клеток, представляющих интерес.
Извлечение кальцинированной ткани, выделение лейкоцитов из кальцинированной ткани и, в частности, использование проточной цитометрии на этом типе ткани могут быть сложными из-за таких проблем, как автофлуоресценция. Существует несколько публикаций с протоколами для этой конкретной цели16,17,18. Здесь мы представляем протокол, разработанный специально для прямого выделения и культивирования Т-лимфоцитов из образцов аортального клапана человека. Клональное расширение лимфоцитов является отличительной чертой адаптивного иммунитета. Изучение этого процесса in vitro дает проницательную информацию об уровне гетерогенности лимфоцитов19. После трехнедельного инкубационного периода клоны Т-клеток готовы к эксплантации, так как из каждого клона было получено достаточное количество Т-клеток, чтобы позволить фенотипическое и функциональное исследование. Впоследствии фенотип Т-клонов изучается методом цитофторометрии.
Этот иммунологический протокол является адаптацией метода, ранее разработанного Amedei et al. для выделения и характеристики Т-клеток из тканей человека, специально разработанных для кальцинированных тканей человека, таких как в CAVD20,21,22. Протокол здесь для выделения PBMCs (мононуклеарных клеток периферической крови) с использованием облученной пухлой оболочки описывает эффективный способ получения фидерных клеток (FC), специально скорректированных для фазы клонирования Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток клапана. Питательный слой состоит из клеток с остановкой роста, которые все еще жизнеспособны и биологически активны. Роль фидерных клеток важна для поддержания выживания in vitro и роста Т-лимфоцитов, выделенных из интерстициальных клеток клапана23. Чтобы избежать пролиферации фидерных клеток в культуре, эти клетки должны пройти остановку роста. Это может быть достигнуто двумя способами: с помощью физических методов, таких как облучение, или путем лечения цитотоксическими химическими веществами, такими как митомицин С (MMC), противоопухолевый антибиотик, который может быть нанесен непосредственно на поверхность культуры24. Здесь мы показываем остановку роста клеток фидера, достигаемую путем облучения клеток.
Этот метод представляет собой эффективный, экономически эффективный способ выделения и характеристики Т-клеток из ткани аортального клапана, способствуя расширению спектра иммунологических методов изучения патофизиологии CAVD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследование проводилось в соответствии со Статутом Шарите по обеспечению надлежащей научной практики и соблюдались правовые руководящие принципы и положения о неприкосновенности частной жизни и этике. Комитет по этике одобрил все эксперименты на людях, а конфиденциальность и анонимность пациентов были сохранены в соответствии с правилами, указанными в Этической форме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для протокола, описанного ниже, использовались свежие образцы стенотического клапана человека.
1. Подготовка реагентов
- Приготовьте обогащенную rpmI полную среду, добавив RPMI 1640 Medium: Заменимые аминокислоты; Пируват натрия, L-глютамин, ß-меркаптоэтанол и пенициллин-стрептомицин (Pen/Strep). Отфильтруйте его перед использованием. Хранить при температуре +4 °C и использовать в течение двух месяцев.
- Подготовьте клеточную культуральную среду (CCM) для фазы клонирования, используя обогащенную RPMI 1640 полную среду, добавленную термоинактивированной фетальной бычьей сывороткой (FBS), базальной средой HB, 50 U интерлейкина 2 (IL-2) и сывороткой человека (HS). Фильтруйте и используйте его в течение дня. Не храните.
- Подготовьте клеточную культуральную среду для фазы повторного кормления с использованием обогащенной rpmI 1640 полной среды с добавлением FBS, базальной среды HB, 30 U IL-2 и HS. Фильтруйте и используйте его в течение дня. Не храните.
- Подготовьте буфер для стирки, содержащий 250 мл RPMI и 5 мл Pen/Strep. Хранить при температуре +4 °C, использовать в течение двух месяцев.
2. Выделение и культивирование Т-лимфоцитов человека в колбы Т-25
- Поместите образец стенотического клапана в стерильную чашку Петри, заполненную wash Buffer, гарантируя, что весь образец клапана покрыт им. Дайте постоять 15 минут.
- Разрежьте стенозирующий клапан небольшими кусочками с помощью скальпеля и дайте ему снова постоять в течение 10 минут.
- Подготовьте среду для культивирования клеток с 50 U IL-2, как описано ранее, и процедите ее.
- Добавьте CCM внутрь колбы T25 и, используя стерильную пластиковую плоскогубцу, поместите части клапана внутрь колб.
- Храните колбы в вертикальном положении внутри CO2-инкубатора в течение одной недели, следя за состоянием колбы под микроскопом. Клоны Т-клеток должны быть видны примерно через три дня после стадии культивирования; для лучшего наблюдения желательно поместить колбы в горизонтальное положение за 20 мин до микроскопического анализа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество клеточной культуральной среды зависит от количества присутствующего образца и от того, сколько колб T25 будет использоваться. Учитывая, что каждый кусок клапана требует 10 мл CCM внутри колбы, 25 мл CCM в колбе T25 подходит для 3 частей клапана.
3. Фаза клонирования
ПРИМЕЧАНИЕ: Для фазы клонирования Т-клеток необходимо начать с выделения фидерных клеток из облученного пухлого слоя (BC) в соответствии с протоколом PBMCs.
- Откройте мешок BC под ламинарной проточной вытяжкой с помощью шипа мешка с безыгольчатым клапаном и передайте 50 мл крови в колбу T150. Добавьте 70 мл PBS, чтобы разбавить кровь внутри колбы.
- Возьмите четыре конические пробирки по 50 мл и поместите в каждую по 20 мл градиентной среды плотности и аккуратно наложите на нее 30 мл крови.
- Центрифуга в течение 25 мин при 800 х г и 20 °C с выключенным тормозом.
- Осторожно аспирируйте супернатант и выбросьте его как отходы. Соберите кольцо PBMCs в новую коническую трубку объемом 50 мл, добавив внутрь раствора PBS объемом до 50 мл.
- Центрифуга в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C.
- Откажитесь от супернатанта и приостановите гранулу, добавив внутрь раствор PBS объемом до 50 мл. Повторяйте фазу центрифугирования в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C.
- Выбросьте супернатант и суспендируйте ФК в 10 мл клеточной питательной среды.
- Возьмите новую пробирку для сбора и разбавьте ФК с PBS 1:10, добавив внутрь 9,9 мл PBS и 100 мкл из пробирки с FC и клеточной питательной средой. Хорошо промойте пипеткой и возьмите 7 мкл из этого разведения и подсчитайте клетки под микроскопом.
- Подготовьте питательную среду для фазы клонирования: 70 мл с 50 U IL-2, а затем разделите ее на две конические трубки по 50 мл, каждая трубка будет содержать 25 мл клеточной культуральной среды, как описано ниже:
- Пробирка 1: 25 мл CCM + FC + 0,6% фитогемагглютинина (PHA)
- Трубка 2: 25 мл CCM + Т-лимфоцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Целью метода PMBC является получение 2 x 106 клеток на каждый мл, поэтому 25 мл подготовленного CCM (трубка 1) должны быть рассчитаны соответствующим образом. Общая используемая формула: Количество подсчитанных ячеек x 106: 1 мл = CCM x 106: X
4. Культура Т-лимфоцитов в многоязычных пластинах
- С помощью электронной пипетки соберите всю питательную среду внутри колб и переложите ее в коническую трубку объемом 50 мл. Пустые колбы можно выбросить.
- Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C.
- Откажитесь от супернатанта, суспендируйте гранулу в 50 мл PBS и соберите ячейки путем центрифугирования в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C. Повторите этот шаг дважды.
- Откажитесь от супернатанта и суспендируйте гранулы в 1 мл СКК. Возьмите 7 мкл из этого разведения и подсчитайте клетки под микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество подсчитанных ячеек необходимо умножить на объем камеры и на применяемое разбавление. - Приступают к разбавлению клеток, насчитываемых от 105 до 103 в клеточной культуральной среде, а затем берут 500 мкл из 103 и помещают его внутрь трубки 2.
- Заполните 25 мл питательной среды tube 1 в пластиковую чашку Петри размером 100 мм x 15 мм.
- Возьмите четыре нижние многоскважинные пластины 96-U и используйте многоканальную пипетку, установленную на 100 мкл семенных FC в каждой скважине.
- Возьмите трубку 2 и вылейте питательную среду для клеток внутрь чашки Петри. Используя многоканальную пипетку, установленную на 100 мкл, засевают Т-клетки в каждую лунку.
- Храните многоствольные пластины внутри CO2-инкубатора в течение одной недели.
5. Первая фаза повторного кормления
- Используя облученный пухлый мешок для пальто, следуйте методу PBMCs для получения FC, как описано в предыдущем способе.
- Подготовьте подходящее количество CCM без PHA и отфильтруйте его.
- Используя многоканальную пипетку, извлеките 100 мкл из каждой скважины, следя за тем, чтобы не коснуться дна скважины.
- Добавьте 100 мкл ФК во все колодцы в качестве питательного слоя, чтобы обеспечить клеточную культуру питательными веществами и изменить среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мультилунки рекомендуется учитывать 6 мл СКК, поэтому рекомендуемое количество для 4 мультилунок составляет около 30 мл. PHA (0,4% от общего количества CCM) необходимо добавлять в CCM один раз в две недели.
6. Второй этап повторного кормления
- Повторите фазу повторного кормления после отрывка, описанного выше. 0,4% PHA необходимо добавить в среду клеточной культуры.
7. Первая фаза расщепления от 1 скважины/пробы до 2 скважин/проб
- Проверьте все четыре мультивеллы под микроскопом и продолжайте раскалывать эти скважины клонами Т-клеток (TTC).
- Следуйте протоколу PBMCs, чтобы изолировать питательные клетки из облученного пухлого пальто.
- Подготавливают клеточную культуральную среду с 30 ЕД ИЛ-2. Добавьте FC и возьмите новую 96-луночную многоязычную пластину с U-образным дном.
- Используя пипетку, установленную на 100 мкл, хорошо промыть внутри скважин отобранных образцов и разделить 200 мкл объема, содержащегося в каждой скважине, на 2 новые скважины новой многоскважинной пластины, чтобы иметь 100 мкл объема для каждой из новых 2 скважин.
- Добавьте 100 мкл FC во все новые скважины. Каждая скважина должна содержать общий объем 200 мкл.
- Установите пипетку на 100 мкл и добавьте 100 мкл в дополнительные две скважины, содержащие только FC для использования в качестве контроля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте световую микроскопию для наблюдения за всеми многолуночными пластинами, чтобы определить, в каких скважинах успешно вырос TCC. Чтобы упростить выбор клонов, можно провести сравнение с контролем (две скважины, содержащие только FC), причем клон выглядит темнее и больше по сравнению с контролем. Следует выбрать колодцы с большим, прозрачным, круглым клоном, с лимфоцитами, плотно упакованными вместе. Если после двух недель повторного кормления стран, предоставляющих войска, отсутствуют, рекомендуется подождать еще одну неделю и выполнить дополнительный этап повторного кормления.
8. Вторая фаза расщепления от 2 скважин/пробы до 4 скважин/пробы
- Установите пипетку на 100 мкл, хорошо промойте внутри двух скважин каждого образца и засейте две новые скважины по 100 мкл для каждой.
- Подготовьте среду клеточного культивирования с 30 U IL-2 и следуйте технике PBMCs, чтобы извлечь FC из мешка для пышного пальто и поместить FC внутрь CCM.
- Установите пипетку на 100 мкл и засейте FC во всех колодцах. Храните мультивеллеры в CO2-инкубаторе в течение одной недели.
9. Третья фаза расщепления от 4 скважин/пробы до 8 скважин/пробы:
- Используя многоканальную пипетку, установленную на 100 мкл, промыть скважину внутри всех четырех скважин каждого образца и посеять 100 мкл в каждую из четырех новых скважин в новой 96-луночной пластине.
- Подготовьте питательную среду для клеток и следуйте технике PBMCs, чтобы извлечь FC из облученного мешка для пальто.
- Поместите ФК внутрь СКК. Установите пипетку на 100 мкл и засейте FC во всех колодцах. Храните мультивеллы в CO2-инкубаторе в течение одной недели
10. Цитофториметрический анализ
- Возьмите многолуночную пластину с самой старой датой из ИНКУБАТОРА CO2 и определите сборные пробирки с номерами образцов для анализа.
- Используя многоканальную пипетку, установленную на 200 мкл с 2 наконечниками, тщательно промыть внутри двух лунок одного и того же образца и поместить обе в одну и ту же сборную трубку. Повторите этот шаг для всех примеров.
ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы ФК не будут анализироваться, так как они служат только в качестве средств контроля.
11. Подготовка панели окрашивания антител к цитофториметрическому анализу
- Добавляют 1 мл раствора PBS для каждой трубки и центрифуги в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C.
- После фазы центрифугирования отбросьте супернатант.
ПРИМЕЧАНИЕ: Панель окрашивания антителами приведена в таблице 1. Каждая расчетная концентрация антител составляет около 2 мкл/образец. Рекомендуется ненадолго раскрутить пробирки с антителами перед использованием. Чтобы защитить флуорофор-конъюгированные антитела от света, все этапы следует выполнять в темноте. - Приготовьте смесь антител внутри пробирки объемом 1,5 мл и вращайте ее.
- Добавьте антитела внутрь образцов и оставьте образцы для инкубации в темноте при комнатной температуре в течение 15 мин.
- Добавляйте 1 мл PBS в каждый образец и центрифугу в течение 10 мин при 400 х г и 20 °C.
- Откажитесь от супернатанта и суспендируйте гранулу с 500 мкл раствора PBS.
- Приступают к цитофториметрическому анализу (анализ FACS, таблица 1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашенные образцы могут быть зафиксированы с использованием 0,5% параформальдегида (PFA), разведенного в растворе PBS и проанализированного до 15 дней спустя.
ВНИМАНИЕ: PFA токсичен и должен обрабатываться осторожно.
| Маркер | Флуорофор |
| СД3 | PE/Cy7 |
| СД4 | Алекса Флюор 488 |
| СД8 | Бриллиантовая фиалка 510 |
| СД14 | Бриллиантовая фиалка 421 |
| СД25 | ЧП |
| СД45 | Бриллиантовая фиалка 711 |
Таблица 1. Панель окрашивания антител для обнаружения популяции Т-лимфоцитов при кальцификации заболевания аортального клапана.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали простой и экономически эффективный метод для характеристики популяции лейкоцитов свежих образцов аортального клапана, полученных от пациентов с тяжелым стенозом аортального клапана (см. протокол). Метод выделения НБМК является жизненно важным шагом в получении питающих клеток, которые используются на каждом этапе эксперимента (фазы клонирования, повторного кормления и расщепления) и позволяют обнаруживать и характеризовать инфильтрирующие лейкоциты в образцах аортального клапана. Ключевые шаги этого метода показаны на рисунке 1.
Рисунок 1. Изоляция ФК от пышной шерсти. (A) Кровь, слоистая над средой градиента плотности (B) Кольцо белых кровяных клеток, полученное после центрифугирования (C) Белые кровяные клетки, собранные и повторно суспендированные в растворе PBS (D) Белые клетки, наблюдаемые при световой микроскопии Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
После двух недель инкубации мы успешно клонировали и вырастили популяцию Т-клеток, как показано на рисунке 2.
Рисунок 2. Клон Т-клеток после двух недель инкубации наблюдается с помощью световой микроскопии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3 иллюстрирует схему гатинга, используемую для анализа субпопуляций Т-клеток у пациентов с CAVD. Как показал результат анализа FACS, СУЩЕСТВУЕТ БОЛЬШЕ CD4+ Т-клеток (43,032%), чем CD8+ Т-клеток (1,079%).
Рисунок 3. Схема гатинга, используемая для анализа субпопуляции Т-клеток. (A) Для идентификации конкретной популяции Т-клеток в стенологическом клапане был применен затвор. (B) CD14 отрицательные лимфоциты и CD3-положительные лимфоциты. (C) ЛИМФОЦИТЫ CD3 предназначены для отличия CD4+ Т-клеток от CD8+ Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы показать, что одни и те же маркеры Т-клеток присутствуют как в образцах нативных клапанов, так и в клонированных образцах, мы провели анализ FACS без фазы клонирования, как показано на рисунке 4.
Рисунок 4. Результаты анализа FACS двух образцов клапанов. Мы сравнили Т-клетки, полученные из образца нативного клапана и клонированного образца, проверив, что Т-клетки, обнаруженные в нативном клапане, имеют специфические маркеры Т-клеток в конечном клонированном продукте. (A) Результаты FACS образца собственного клапана без фазы клонирования. B) результаты СУИМ пробы клапана, проанализированной после этапа клонирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Весь рабочий процесс обобщен на рисунке 5, начиная с расслоения аортального клапана человека и заканчивая анализом FACS. Все этапы необходимы для анализа одного образца аортального клапана. Фаза 1 показывает выделение лимфоцитов из стенотической ткани аортального клапана. Образцы клапана должны быть разрезаны и помещены в чашку Петри, заполненную буфером для мытья. Части клапана могут быть помещены в колбу T25, заполненную CCM, и храниться в CO2-инкубаторе в течение одной недели. Фаза 2 показывает фазу клонирования, которая состоит из двух частей: 1) изоляция ФК из облученного мешка для пальто и 2) фаза клонирования Т-клеток и завершается культурой клеток в многолуночной пластине с 96 лунками, которая хранится в инкубаторе CO2 в течение одной недели. Фазы 3 и 4 состоят из фазы повторного кормления с использованием FC из облученного пальто; эта фаза должна повторяться в течение двух недель подряд. Фазы 4, 5 и 6 показывают фазу расщепления клонов Т-клеток; первая фаза расщепления составляет от 1 скважины/образца до двух скважин для каждого образца в новой многолуночной пластине; второе расщепление составляет от 2 скважин/пробы до 4 скважин на каждую в одной и той же многолуночной плите; третья и последняя фаза расщепления составляет от 4 скважин/образец до 8 в новой многолуночной плите. Фаза 7 является заключительной фазой, где образцы анализируются с использованием анализа FACS.
Рисунок 5. CAVD Экспериментальный рабочий процесс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Из предварительных результатов (рисунок 2) можно сделать вывод, что лимфоциты вместе с CD45+ лейкоцитами присутствуют в кальцинированных аортальных клапанах, что указывает на то, что заболевание кальцифицированного аортального клапана связано с активацией иммунной системы и воспалительной активностью.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь представлен метод характеристики субпопуляций Т-лимфоцитов, выделенных из стенотических образцов аортального клапана, с использованием проточной цитометрии. Этот метод требует использования облученного пухлого слоя для изоляции PBMCs. Частота излучения, которой должны подвергаться мешки для пальто, составляет 9000 Rad/90 Gray (Gy), и это представляет собой решающий шаг для остановки пролиферации клеток кормушки. Роль клеток, выделенных из пушистых мешков шерсти, заключается в том, чтобы действовать только как питательные клетки и обеспечивать питательные вещества для Т-клеток, выделенных из клапанов. Как отмечалось в прошлом25, использование необлученного пальто будет способствовать распространению НБМК в культуре. Частота излучения ниже 90 Гр показала распространение НБМК в культуре, поэтому мы рекомендуем использовать ровно 90 Гр излучения. Следует отметить, что желательно использовать пальто, облученное в тот же день или максимум на следующий день, держа его на устройстве, которое держит его в постоянном перемешивании. Другим важным этапом этого метода может быть фаза клонирования лимфоцитов, на которую могут влиять артефакты; чтобы избежать этого события, мы выполняем FACS на свежих образцах аортального клапана. Фаза клонирования Т-лимфоцитов имеет то преимущество, что получается большее количество Т-клонов (в среднем 15 клонов Т-клеток для каждого клапана), подлежащих анализу фенотипически и функционально, чем количество, полученное при анализе одного свежего образца. Метод клонирования использовался этой исследовательской группой в течение многих лет, и в зависимости от типа анализируемой ткани профиль лимфоцитов был разным21,26,27. Первое прохождение метода касается выделения Т-клеток из стенотического аортального клапана. Все описанные этапы должны выполняться под ламинарной вытяжкой в стерильных условиях и настоятельно рекомендуется дезинфицировать все материалы перед использованием. Время, необходимое для получения результатов, составило 6 недель, а среднее количество Т-лимфоцитарных клеток, полученных из фазы клонирования, составило 20 х 106 клеток. Фаза мониторинга многоскважинных плит очень важна и не должна упускаться из виду. Изменение цвета среды на желтый может представлять собой бактериальное загрязнение, и в этом случае все используемые инструменты должны быть стерилизованы, а многолуночные пластины выброшены.
Перед анализом FACS важно установить подходящий затвор, чтобы убедиться, что между каналами антител нет специфического перекрытия. Это обеспечивает оптимальное разделение между положительными и отрицательными затворами. Использование одинаковых партий антител для всех образцов, участвующих в исследовании, рекомендуется для получения однородного результата. Также необходимо защищать флуорофор-конъюгированные антитела от света, выполняя все шаги при выключенном свете.
Этот метод эффективен в получении результатов с высокой воспроизводимостью и не является дорогостоящим. Ограничением этого метода является небольшой размер выборки, из-за ограниченной доступности образцов клапана человека, а также отсутствия контрольной группы.
Предварительные результаты подтверждают роль адаптивного иммунитета как важнейшего элемента в развитии и прогрессировании заболевания кальцификального аортального клапана. Все пациенты, включенные в это исследование, имели диагноз тяжелого симптоматического кальцифицирующего стеноза аорты, со средним возрастом 70 лет, в основном мужчины. Существование популяций Т-клеток в проанализированных аортальных клапанах свидетельствует о воспалительной активности больного аортального клапана как контрольной точки активации иммунных клеток. Предметом будущего интереса может быть анализ функциональности CAVD-инфильтрирующих Т-клеток и характеристика специфичности Т-клеток, как сообщалось ранее при аналогичных заболеваниях, таких как атеросклероз28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Все пушистые пальто, используемые для этого протокола, были облучены благодаря наличию доктора Питера Розенталя, доктора Дирка Бёмера и всей команды отделения радиологии Charité Benjamin Franklin. Стипендиат / Мэри Роксана Кристофер, эта работа поддерживается стипендией немецкого кардиологического общества (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
