Summary
이 연구에서는, 우리는 유동 세포 분석분석을 사용하여 적응성 백혈구 하위 집합의 특성화를 위한 T 세포 복제의 신선한 견본 및 T 세포 복제의 분석 단계에서 T 림프구 절연의 과정을 기술합니다.
Abstract
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD), 밸브의 온화한 두껍게에서 심한 석회화에 이르기까지 활성 질병 과정, 고체 대동맥 판막 교체 (TAVR)와 같은 새로운 치료 옵션에도 불구하고, 높은 사망률과 연관된다.
밸브 석회화로 시작하여 심각한 대동맥 협착증으로 이어지는 전체 경로는 부분적으로만 이해됩니다. 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공함으로써, 스테노판 막부 조직에서 T 림프구의 분석은 석회화의 발달에 있는 그들의 역할을 명확히 하는 능률적인 방법이 될 수 있었습니다. 수술 후, 신선한 대동맥 판막 시료는 작은 조각으로 해부되고 T 림프구가 배양되고 복제된 다음 형광 활성 세포 분류(FACS)를 사용하여 분석합니다.
염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 염색 패널에서 생성된 결과는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 세포 농도의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 관심의 특정 T 세포 아류형의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다. 이 연구에서는, 우리는 새로운 석회화 대동맥 판막 샘플과 CAVD 병리생리학에서 적응성 면역의 역할을 더 이해하기 위해 유동 세포 세포를 분석하는 단계와 T 세포 클론에 수행 T 세포의 절연을 보여줍니다.
Introduction
석회화 대동맥 판막 질환 (CAVD)은 가장 흔한 심장 판막 질환 중 하나이며 의료에 큰 영향을 미칩니다. 지난 몇 년 동안 대동맥 판막 교체의 빈도가 급격히 증가하고 있으며, 고령인구가 증가함에 따라 더욱 증가할 것으로 예상됩니다1.
CAVD의 근본적인 병리생리학은 부분적으로만 알려져 있으며 현재 치료 전략은 외과 또는 경피 적 절차를 통해 보수적 인 조치 또는 대동맥 판막 교체로 제한됩니다. 현재까지, 어떤 효과적인 치료도 CAVD 진행을 방해하거나 되돌릴 수 없으며 높은 사망률은 대동맥 판막 교체(AVR)가 수행되지 않는 한 초기 증상 발병과 관련이 있습니다2. 심한 증상 대동맥 협착증 환자에서 3 년 증상없는 생존은 20%3으로 낮게 보고되었습니다. Transcatheter 대동맥 판막 교체 (TAVR)는 새로운 옵션을 나타냅니다, 고위험 환자에 대한 치료를 혁명, 특히 노인 중 극적으로 사망률을 감소했다, 이는 본질적으로 이 인구4,5,6. TAVR의 유망한 결과에도 불구하고, 새로운 초기 치료 목표를 확인하기 위해 CAVD 병리 생리학을 이해하기 위해 추가 연구가 필요합니다7,8,9.
이전에는 수동적이고 퇴행성 공정으로 여겨졌던 CAVD는 이제 대동맥 판막 간질 세포의 골세포 표현형 스위치를 특징으로 하는 활성 진행성 질환으로 인식되고 있다10. 이 질병은 진행성 광물화, 섬유질 변화 및 대동맥 판막 전단지 (경화증)의 감소 된 운동성을 포함하며 궁극적으로 대동맥 판막 개구부의 협착 (협착)으로 이어지는 혈류를 방해합니다11.
염증은 혈관 동맥 경화증의 과정과 유사한 CAVD 병리 생리학의 중요한 과정으로 간주됩니다. 내피 손상은 지질 종, 특히 대동맥 판막12에서 산화 지단백질의 증착 및 축적을 가능하게합니다. 이러한 산화 지단백질은 염증 반응을 유발, 그들은 세포 독성으로, 미네랄화로 이어지는 염증 활성. CAVD 개발 및 질병 진행에서 선천적이고 적응성 면역의 역할이 최근 강조되고 있다13. 메모리 T 세포의 특정 하위 집합의 활성화 및 복제 확장은 CAVD 및 광물화 대동맥 판막 전단지 환자에서 문서화되어 염증 과정이 적어도 CAVD의 개발에 관여하는 것으로 가정되고 아마도 질병 진행에 관여할 수 있도록14. 사실, 항원 제시 세포및 대식세포는 건강하고 병든 판막둘다 존재하더라도, T 림프구의 존재는 노인과 병든 대동맥 판막을 나타낸다. 이 림프구성은 신생아와 대사의 증가와 함께 침투하는 것은 CAVD15의 특징적인 조직학적 징후이다.
우리는 대동맥 판막 간질 세포와 면역 계통의 활성화 사이의 상호 작용의 존재를 가설, 이는 잠재적으로 대동맥 판막에서 만성 염증 과정의 개시를 트리거. 스테노성 대동맥 판막 조직에서 T 세포의 분석은 생체 내 대동맥 판막 세포의 밀접한 표현을 제공 할 수 있기 때문에 석회화 발달에서 자신의 역할을 명확히하는 효율적인 방법이 될 수 있습니다. 본 작업에서, 대동맥 판막 조직을 사용하여, 우리는 T-림프구를 분리하고, 배양하고 복제하고, 그 후에 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 사용하여 그(것)들을 특성화합니다. 신선한 대동맥 판막 샘플은 중증 대동맥 협착증에 대한 외과 용 판막 교체를받은 CAVD 환자로부터 절제되었습니다. 수술 후, 신선한 판막 샘플은 작은 조각으로 해부되었고 T 세포는 배양되었고, 그 후 유동 세포 측정을 사용하여 분석하였다. 염색 절차는 간단하고 스테인드 튜브는 파라포름알데히드의 0.5%를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다. 스테닝 패널에서 생성된 데이터는 개입과 관련하여 시간이 지남에 따라 T 림프구 분포의 변화를 추적하는 데 사용될 수 있으며 특정 T 세포 하위 집합의 활성화 상태를 평가하기 위해 쉽게 더 발전될 수 있다.
석회화 된 조직의 추출, 석회화 된 조직에서 백혈구의 분리 및 특히 조직의이 유형에 유동 세포종의 사용은 자동 형광과 같은 문제로 인해 어려울 수 있습니다. 이 특정 목적에 대한 프로토콜이 존재하는 간행물은 거의 없습니다16,17,18. 본 발명에서는 인간 대동맥 판막 시료로부터 T 림프구의 직접 절연 및 배양을 위해 특별히 설계된 프로토콜을 제시한다. 림프구의 클로날 확장은 적응성 면역의 특징입니다. 시험관 에서이 과정을 연구 림프구 이질성의 수준에 통찰력있는 정보를 제공합니다19. 3주 간의 인큐베이션 기간 이후에, T 세포 클론은 각 클론으로부터 적절한 양의 T 세포를 얻어서, 표현성 및 기능적 연구를 허용하도록 하여 배분할 준비가 되어 있다. 그 후 T 클론의 표현형은 세포성 평성에 의해 연구된다.
이러한 면역 학적 프로토콜은 이전에 Amedei 외에 의해 개발 된 방법의 적응이다 T 세포 격리 및 인간 조직에서 특성화, 특히 CAVD20,21,22에서와 같은 석회화 인간 조직을 위해 설계. 조사된 버피 코트를 이용한 PBMC(말초 혈액 단핵세포)의 분리를 위한 프로토콜은 밸브 간질 세포로부터 분리된 T 림프구의 복제 상을 위해 특별히 조정된 피더 세포(FC)를 얻는 효과적인 방법을 설명합니다. 피더 층은 여전히 실행 가능하고 생리활성인 성장 체포 된 세포로 구성됩니다. 피더 세포의 역할은 밸브 간질 세포23에서 분리된 T 림프구의 체외 생존 및 성장을 지원하는 것이 중요합니다. 배양에서 피더 세포 확산을 피하기 위해, 이러한 세포는 성장 체포를 받아야한다. 이는 조사와 같은 물리적 방법을 통해, 또는 미토마이신 C(MMC)와 같은 세포독성 화학물질로 치료를 통해 배양 표면에 직접 적용될 수 있는 항종양 항생제24로 달성될 수 있다. 여기서 우리는 세포 조사를 통해 달성 된 피더 세포 성장 체포를 보여줍니다.
이 방법은 대동맥 판막 조직에서 T 세포를 분리하고 특성화하는 효율적이고 비용 효율적인 방법을 제시하여 CAVD 병리생리학을 탐구하기 위한 면역 학적 방법의 스펙트럼을 넓히는 데 기여합니다.
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Protocol
이 연구는 좋은 과학적 관행을 보장하기위한 Charité의 법령에 따라 수행되었으며 개인 정보 보호 및 윤리에 대한 법적 지침과 조항이 존중되었습니다. 윤리위원회는 모든 인간의 실험을 승인하고 환자의 개인 정보 보호 및 익명성은 윤리 양식에 보고 된 규칙에 따라 유지되었다.
참고: 신선한 인간 스테노틱 밸브 샘플 아래에 설명된 프로토콜을 위해 사용되었습니다.
1. 시약 준비
- RPMI 1640 배지: 비필수 아미노산에 첨가하여 농축 된 RPMI 완전 매체를 준비; 피루바테 나트륨, L-글루타민, ß-메르카포에탄올, 페니실린-스트렙토마이신 (펜/스트렙). 사용하기 전에 필터링합니다. +4°C에 보관하고 2개월 이내에 사용하십시오.
- 농축 RPMI 1640 완전 배지추가 열불성 태아 소 혈청(FBS), HB 기저형, 인터류빈 2(IL-2) 및 인간 혈청(HS)의 50U를 사용하여 복제 상을 위한 세포 배양 배지(CCM)를 준비한다. 필터링하고 하루 내에 사용합니다. 보관하지 마십시오.
- FBS, HB 기저배지, IL-2 및 HS의 30U를 첨가하여 농축 된 RPMI 1640 완전 배지를 사용하여 재공급 국면에 대한 세포 배양 배지를 준비한다. 필터링하고 하루 내에 사용합니다. 보관하지 마십시오.
- RPMI 250mL 및 5mL 펜/스트렙이 포함된 세척 버퍼를 준비합니다. +4°C에 보관하고 2개월 이내에 사용하십시오.
2. 인간 T 림프구 절연 및 문화로 T-25 플라스크
- 스테노틱 밸브 샘플을 워시 버퍼로 채워진 멸균 페트리 접시에 넣고 전체 밸브 샘플이 덮여 있는지 확인합니다. 15분 간 방치하십시오.
- 메스를 사용하여 작은 조각으로 스테노틱 밸브를 자르고 10 분 동안 다시 방치하십시오.
- 앞서 설명한 대로 IL-2의 50U로 세포 배양 배지를 준비하고 필터링한다.
- T25 플라스크 내부에 CCM을 추가하고 멸균 플라스틱 펜치를 사용하여 밸브 조각을 플라스크 내부에 놓습니다.
- 플라스크를 CO2 인큐베이터 내부의 수직 위치에 1주일 동안 저장하여 현미경으로 플라스크의 상태를 관찰합니다. T 세포 클론은 배양 단계 후 약 3일 후에 표시되어야 한다; 더 나은 관찰을 위해 현미경 분석 전에 20 분 동안 플라스크를 수평 위치에 배치하는 것이 좋습니다.
참고: 세포 배양 배지의 양은 현재 샘플의 양과 얼마나 많은 T25 플라스크가 사용될지에 따라 달라집니다. 각 밸브는 플라스크 내부에 10mL의 CCM이 필요하다는 점을 고려할 때 T25 플라스크에서 25mL의 CCM이 3개의 밸브에 적합합니다.
3. 복제 단계
참고: T 세포의 복제 단계의 경우, PBMC 프로토콜에 따라 조사된 버피 코트(BC)로부터 피더 세포의 분리로 시작해야 합니다.
- 바늘없는 밸브가달린 백 스파이크를 사용하여 라미나르 플로우 후드 아래에 BC 백을 열고 T150 플라스크에 50mL의 혈액을 옮긴다. 70mL의 PBS를 추가하여 플라스크 내부의 혈액을 희석시합니다.
- 4개의 50mL 원문관을 가지고 각각 20mL의 밀도 그라데이션 배지를 배치하고 30mL의 혈액을 조심스럽게 층으로 배치하십시오.
- 브레이크오프시 800xg에서 25분, 20°C의 원심분리기.
- 신중하게 슈퍼 나티퍼를 흡인하고 폐기물로 폐기하십시오. PBS 솔루션 내부에 최대 50ml의 부피까지 추가하는 새로운 50ml 원물 튜브에서 PBMC 링을 수집합니다.
- 원심 분리기는 400 x g 및 20 °C에서 10 분 동안.
- 50mL의 부피까지 PBS 용액 내부에 추가하여 상체를 버리고 펠릿을 일시 중단합니다. 400 x g 및 20°C에서 10분 동안 원심 분리 단계를 반복합니다.
- 상체를 버리고 10mL의 세포 배양 배지에서 FC를 중단한다.
- 새로운 수집 튜브를 가지고 PBS 1:10으로 FC를 희석하고 FC 및 세포 배양 배지로 튜브에서 9.9mL의 PBS 및 100 μL 내부를 추가하여 희석하십시오. 파이펫으로 잘 헹구고 이 희석에서 7 μL을 취하고 현미경의 밑에 세포를 계산하십시오.
- 복제 단계에 대한 세포 배양 배지 준비: IL-2의 50U를 가진 70 mL, 다음 두 개의 50 mL 원추형 튜브로 분할, 각 튜브는 세포 배양 배지의 25 mL을 포함합니다, 아래 설명처럼:
- 튜브 1: CCM + FC 25mL + 식물성 헤마글루티닌 0.6%
- 튜브 2: CCM + T 림프구 25mL
참고: PMBC 방법의 목적은 각 mL에 대해 2 x 106 셀을 획득하는 것이므로 제조된 CCM(Tube 1)의 25mL(Tube 1)을 그에 따라 계산해야 합니다. 사용되는 일반 수식은 : 계산 된 셀 수 x 106 : 1 mL = CCM x 106 : X
4. 멀티웰 플레이트의 T 림프구 배양
- 전자 파이펫을 사용하여 플라스크 내부의 모든 세포 배양 배지를 수집하고 50mL 원추형 튜브로 옮킨다. 빈 플라스크를 버릴 수 있습니다.
- 400 x g 및 20°C에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 펠렛.
- 상체를 버리고, PBS의 50mL에서 펠릿을 중단하고 400 x g 및 20 °C에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
- 상체를 버리고 CCM의 1 mL에서 펠릿을 중단하십시오. 이 희석에서 7 μL을 가지고 현미경의 밑에 세포를 계산합니다.
참고: 세수 셀의 수는 챔버의 부피와 적용된 희석을 곱해야 합니다. - 세포 배양 배지에서 105 에서 103 으로 계산된 세포를 희석한 다음 103 에서 500 μL을 복용한 다음 튜브 2 내부에 넣습니다.
- 튜브 1의 25mL 세포 배양 배지를 100mm x 15mm 플라스틱 페트리 접시 안에 붓습니다.
- 4 개의 96-U 바닥 멀티웰 플레이트를 가지고 각 우물에서 100 μL 시드 FC로 설정된 멀티 채널 파이펫을 사용하십시오.
- 튜브 2를 가져 와서 페트리 접시 안에 세포 배양 배지를 붓습니다. 100 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물의 T 셀을 시드합니다.
- 멀티웰 플레이트를 CO2 인큐베이터 내부에 1주일 간 보관합니다.
5. 첫 번째 재공급 단계
- 조사된 버피 코트 백을 사용하여, 이전 방법에 설명된 바와 같이 PBMC 방법을 따라 FC를 얻을 수 있습니다.
- PHA 없이 적절한 양의 CCM을 준비하고 필터링합니다.
- 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 100 μL을 제거하여 우물 바닥을 만지지 않도록 합니다.
- 모든 우물에 100μL의 FC를 공급층으로 추가하여 세포 배양 영양소를 제공하고 배지를 변경합니다.
참고 : 각 멀티 웰에 대해 CCM의 6 mL을 고려하는 것이 좋습니다, 그래서 4 멀티 웰에 대한 권장 수량은 약 30 mL입니다. PHA(총 CCM 수량의 0.4%)를 2주에 한 번씩 CCM에 추가해야 합니다.
6. 두 번째 재공급 단계
- 위에서 설명한 구절에 따라 재공급 단계를 반복한다. 0.4% PHA는 세포 배양 배지에 첨가될 필요가 있다.
7. 1 우물 / 샘플에서 2 우물 / 샘플로 첫 번째 분할 단계
- 현미경의 밑에 있는 모든 4개의 멀티웰을 확인하고 T 세포 클론 (TCC)로 그 우물을 분할전진하십시오.
- 조사된 버피 코트 백에서 피더 셀을 분리하기 위해 PBMC 프로토콜을 따릅니다.
- IL-2의 30U로 세포 배양 배지를 준비한다. FC를 추가하고 U 바닥으로 새로운 96 웰 플레이트를 가져 가라.
- 100 μL로 설정된 파이펫을 사용하여 선택한 샘플의 우물 내부에 잘 헹구고 각각 에 포함된 200 μL의 부피를 새로운 멀티웰 플레이트의 2개의 새로운 우물로 나누어 새로운 2개의 우물 각각에 대해 100μL의 부피를 갖습니다.
- 모든 새로운 우물 안에 100 μL의 FC를 추가합니다. 각 우물에는 총 부피가 200 μL이어야 합니다.
- 파이펫을 100 μL로 설정하고 100 μL을 추가2개의 우물에 추가하여 제어 역할을 하는 FC만 포함합니다.
참고: 라이트 현미경 검사를 사용하여 모든 다중웰 플레이트를 관찰하여 TCC가 성공적으로 성장한 우물을 결정합니다. 클론의 선택을 쉽게 하기 위해 컨트롤(FC만 포함하는 두 개의 우물)에 대한 비교를 할 수 있으며, 복제본은 컨트롤에 비해 어둡고 더 크게 나타납니다. 선택해야 할 우물은 크고 맑고 둥근 클론을 가진 우물이며 림프구는 조밀하게 함께 포장됩니다. 2주 간의 재수유 후에 는 TCC가 없는 경우 1주일 이상 기다렸다가 추가 재공급 단계를 수행하는 것이 좋습니다.
8. 2 우물 / 샘플에서 4 우물 / 샘플로 두 번째 분할 단계
- 파이펫을 100 μL로 설정하고 각 샘플의 두 우물 안에 잘 헹구고 각 샘플에 대해 100 μL의 두 개의 새로운 우물을 시드합니다.
- IL-2의 30U로 세포 배양 배지를 준비하고 PBMC 기술을 따라 버피 코트 백에서 FC를 추출하고 CCM 내부에 FC를 배치합니다.
- 파이펫을 100 μL로 설정하고 모든 우물에서 FC를 시드합니다. 멀티웰을 CO2 인큐베이터에 1주일 동안 보관합니다.
9. 4 우물 / 샘플에서 8 우물 / 샘플로 세 번째 분할 단계 :
- 100 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 각 샘플의 4개의 우물 안에 잘 헹구고 새로운 96웰 플레이트의 4개의 새로운 우물에 100 μL을 시드합니다.
- 세포 배양 배지를 준비하고 PBMC 기술을 따라 조사된 버피 코트 백에서 FC를 추출합니다.
- CCM 내부에 FC를 배치합니다. 파이펫을 100 μL로 설정하고 모든 우물에서 FC를 시드합니다. 멀티웰을 CO2 인큐베이터에 1주일 간 보관
10. 세포불화 분석
- CO2 인큐베이터에서 가장 오래된 날짜와 멀티웰 플레이트를 가지고 분석할 샘플 번호로 수집 튜브를 식별합니다.
- 2개의 팁이 있는 200 μL로 설정된 멀티채널 파이펫을 사용하여 동일한 샘플의 두 우물 안에 철저히 헹구고 동일한 수집 튜브 안에 모두 넣습니다. 모든 샘플에 대해 이 단계를 반복합니다.
참고: FC 샘플은 컨트롤로만 작동하므로 분석되지 않습니다.
11. 세포성 플루오리메트릭 분석을 위한 항체 염색 패널 준비
- 각 튜브및 원심분리기에 대해 1mL의 PBS 용액을 400 x g 및 20°C에서 10분 간 추가합니다.
- 원심 분리 단계 후 상체를 폐기합니다.
참고: 항체 염색 패널은 표 1에서 찾을 수 있습니다. 계산된 각 단일 항체 농도는 약 2 μL/시료이다. 사용하기 전에 항체 튜브를 잠시 회전하는 것이 좋습니다. 불소로포레가 공주된 항체를 빛으로부터 보호하기 위해 모든 단계는 어둠 속에서 수행되어야 합니다. - 1.5 mL 튜브 내부의 항체 혼합을 준비하고 소용돌이.
- 샘플 내부에 항체를 추가하고 15 분 동안 실온에서 어둠 속에서 배양하기 위해 샘플을 둡니다.
- 각 샘플에 PBS 1mL을 추가하고 원심분리기는 400 x g 및 20°C에서 10분 동안 추가합니다.
- 상체를 버리고 PBS 용액의 500 μL로 펠릿을 일시 중단하십시오.
- 세포불화 분석(FACS 분석, 표 1)을 진행한다.
참고: 스테인드 샘플은 PBS 용액에서 희석된 0.5% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 고정할 수 있으며 최대 15일 후에 분석할 수 있습니다.
주의: PFA는 독성이 있으며 신중하게 처리해야 합니다.
| 마커 | 플루오로포레 |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | 알렉사 플루어 488 |
| CD8 | 화려한 바이올렛 510 |
| CD14 | 브릴리언트 바이올렛 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | 화려한 바이올렛 711 |
표 1. 석회화 대동맥 판막 질환에서 T 림프구 집단을 검출하는 항체 염색 패널.
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Representative Results
우리는 중증 대동맥 판막 협착증 (프로토콜 참조)을 가진 인간 환자에게서 파생된 신선한 대동맥 판막 샘플의 백혈구 집단을 특성화하기 위하여 간단하고 비용 효과적인 방법을 이용했습니다. PBMC를 격리하는 방법은 실험의 모든 단계(복제, 재공급 및 분할 단계)에 사용되는 피더 세포를 획득하는 데 중요한 단계이며 대동맥 밸브 샘플에서 백혈구에 침투하는 검출 및 특성화를 가능하게 합니다. 이 메서드의 주요 단계는 그림 1에 표시됩니다.
그림 1. FC는 버피 코트에서 격리됩니다. (A) 밀도 그라데이션 배지(B) 백혈구 고리를 통해 층화된 혈액은 원심분리(C) 백혈구가 경현미경검사하에서 관찰된 PBS 용액(D) 백혈구에서 수집및 재장제된 후 얻어진 후 얻어진 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2주 간의 잠복 후 , 도 2에 나타난 바와 같이 T 세포 집단을 성공적으로 복제하고 증가시켰습니다.
그림 2. T 세포 클론은 빛 현미경 검사를 사용하여 관찰 된 배양 2 주 후에 관찰되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3은 CAVD 환자에서 T 세포 하위 집단의 분석을 위해 활용된 게이팅 방식을 도시한다. FACS 분석 결과와 같이 CD8+ T셀(1.079%)보다 CD4+ T셀(43.032%)이 더 많다.
그림 3. T 세포 하위 인구 분석에 활용 된 게이팅 방식. (A) 스테노틱 밸브에서 특정 T 세포 집단을 식별하기 위해 게이트가 적용되었다. (B) CD14 음림프구 및 CD3 양성 림프구. (C) CD3 림프구는 CD4+ T 세포를 CD8+ T 세포로부터 구별하기 위해 게이트된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
동일한 T 세포 마커가 네이티브 밸브 샘플과 복제된 샘플 모두에 존재한다는 것을 보여주기 위해 도 4에 도시된 바와 같이 복제 단계 없이 FACS 분석을 수행했습니다.
그림 4. 두 개의 밸브 샘플의 FACS 분석 결과. 우리는 네이티브 밸브 샘플과 복제 된 샘플에서 얻은 T 세포를 비교하여 네이티브 밸브에서 발견되는 T 세포가 최종 복제 된 제품에서 T 세포의 특정 마커를 공유한다는 것을 검증했습니다. (A) 복제 단계 없이 네이티브 밸브 샘플의 FACS 결과. (B) 복제 단계 후 분석된 밸브 샘플의 FACS 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
전체 워크플로우는 인간 대동맥 판막의 해부에서 시작하여 FACS 분석으로 이어지는 그림 5로 요약됩니다. 하나의 대동맥 밸브 시료를 분석하려면 모든 단계가 필요합니다. 1단계는 스테노성 대동맥 판막 조직에서 림프구 절연을 나타낸다. 밸브 샘플을 절단하고 세척 버퍼로 채워진 페트리 접시에 배치해야합니다. 밸브 조각은 CCM로 채워진 T25 플라스크 내부에 배치하고 1 주일 동안 CO2 인큐베이터에 보관 할 수 있습니다. 2상은 조사된 버피 코트 백과 2) T 세포 복제 단계로부터 의 2부로 구성된 복제 위상을 나타내며, 1주일 동안 CO2 인큐베이터에 보관되는 96웰 멀티웰 플레이트에서 세포 배양으로 절정을 이시합니다. 3상 과 4는 조사된 버피 코트에서 FC를 이용한 재공급 단계로 구성된다. 이 단계는 2주 연속 반복되어야 합니다. 상 4, 5 및 6은 T 세포 클론의 분할 단계를 보여 준다; 첫 번째 분할 단계는 새로운 멀티웰 플레이트의 각 샘플에 대해 1 웰/샘플에서 2개의 우물까지입니다. 두 번째 분할은 동일한 멀티웰 플레이트에 각각 2개의 우물/샘플에서 4개의 우물로; 세 번째 및 마지막 분할 단계는 새로운 멀티웰 플레이트에서 4 개의 우물 / 샘플에서 8까지입니다. 7단계는 FACS 분석을 사용하여 샘플을 분석하는 최종 단계입니다.
그림 5. CAVD 실험 워크플로우. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
예비 결과(그림 2)에서 우리는 CD45+ 백혈구와 함께 림프구가 석회화 대동맥 판막에 존재한다는 결론을 내릴 수 있으므로 석회화 대동맥 판막 질환이 면역 체계 및 염증 활성의 활성화와 관련이 있음을 나타냅니다.
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Discussion
여기서 는 유동 세포측정법을 사용하여 스테노성 대동맥 판막 시료로부터 분리된 T 림프구 하위 모집단을 특성화하는 방법을 제시합니다. 이 방법은 조사 된 버피 코트를 사용하여 PBMC를 격리해야합니다. 버피 코트 백이 반드시 복종해야 하는 방사선 주파수는 9000 Rad/90 Gray(Gy)이며 피더 세포의 증식을 중단하는 중요한 단계를 나타냅니다. 버피 코트 백에서 분리 된 세포의 역할은 피더 세포로만 작용하고 밸브에서 분리 된 T 세포에 대한 영양소를 제공하는 것입니다. 지난 25년에 언급된 바와 같이, 비단한 버피 코트 백을 사용하면 문화분야에서 PBMC의 확산을 촉진할 수 있습니다. 90 이하의 방사선 주파수는 문화권에서 PBMC의 증식을 보여주었기 때문에 정확히 90Gy의 방사선을 사용하는 것이 좋습니다. 참고로, 같은 날 또는 대부분의 다음 날에 조사된 버피 코트를 사용하여 지속적인 동요를 유지하는 장치에 보관하는 것이 좋습니다. 이 방법의 또 다른 중요한 단계는 유물의 영향을 받을 수 있는 림프구 복제 단계로 나타낼 수 있습니다. 이 이벤트를 피하기 위해 우리는 신선한 대동맥 밸브 샘플에 FACS를 수행합니다. T 림프구의 복제 단계는 하나의 신선한 샘플의 분석에서 얻은 수보다 더 많은 수의 T 클론(각 밸브에 대한 평균 15 T 세포 클론)을 획득하여 페노전성 및 기능적으로 분석할 수 있는 장점이 있다. 복제 기술은 수년 동안 이 연구군에 의해 사용되어 왔으며 분석된 조직의 종류에 따라 림프구 프로파일은 21,26,27로 달랐다. 이 방법의 첫 번째 통과는 스테노틱 대동맥 판막으로부터T 세포 절연에 관한 것입니다. 설명된 모든 단계는 멸균 조건에서 라미나르 유동 후드 하에서 수행해야 하며 사용하기 전에 모든 재료를 소독하는 것이 좋습니다. 결과를 얻는 데 필요한 시간은 6주였고 복제 단계에서 얻은 T 림프구 세포의 평균은 20 x 106 세포였다. 멀티웰 플레이트의 모니터링 단계는 매우 중요하며 간과해서는 안됩니다. 중간에서 노란색으로 의 색의 변화는 세균 오염을 나타낼 수 있으며, 이 경우 사용되는 모든 계측기를 살균하고 다중 웰 플레이트를 버려야 합니다.
FACS 분석 전에 적절한 게이트를 설정하고 항체 채널 간에 특정 중첩이 없는지 확인하는 것이 중요합니다. 이렇게 하면 양수 게이트와 음수 게이트 를 최적로 분리할 수 있습니다. 연구에 관여하는 모든 시료에 대해 동일한 많은 항체를 사용하여 균질성 결과를 얻는 것이 좋습니다. 또한 빛으로부터 불소엽공-공주 항체를 보호하리라, 모든 단계를 빛으로 꺼낼 필요가 있다.
이 방법은 높은 재현성을 가진 결과를 산출에 효과적이며 비용이 많이 않습니다. 이 방법의 제한은 인간 밸브 샘플의 제한된 가용성뿐만 아니라 대조군의 부족으로 인해 작은 샘플 크기입니다.
예비 결과는 석회화 대동맥 판막 질환의 개발 및 진행에 중요한 요소로서 적응성 면역의 역할을 지원합니다. 이 연구에 등록된 모든 환자는 평균 연령 70세, 주로 남성인 심한 증상 석회화 대동맥 협착증진단을 받았다. 분석된 대동맥 판막에서 T 세포 집단의 존재는 면역 세포 활성화의 검사점으로서 병든 대동맥 판막의 염증 활성에 대한 증거를 제공한다. 향후 관심의 포인트는 CAVD 침투 T 세포의 기능을 분석하고 죽상 경화증과 같은 유사한 질병에 이전에 보고된 T 세포 특이성을 특성화하는 것입니다28,29,30.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 프로토콜에 사용된 모든 버피 코트 백은 피터 로젠탈 박사, 더크 뵈머 박사, 샤리테 벤자민 프랭클린 방사선학과 전체 팀의 가용성 덕분에 조사되었습니다. 장학금 소지자 / 메리 록사나 크리스토퍼,이 작품은 독일 심장 학회 (DGK)에서 장학금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
