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Immunology and Infection

विकिरणित बफी कोट से फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके टी लिम्फोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के माध्यम से महाधमनी वाल्व कैल्सीफिकेशन की जांच करना

Published: February 4, 2021 doi: 10.3791/62059
Automatic Translation
*1,2, *1, 3,4, 1,3, *2,5, *1,6, *1,6
1Department of Cardiology, Campus Benjamin Franklin, Charité Universitätsmedizin Berlin and German Centre for Cardiovascular Research (DZHK), 2Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, 3Berlin Institute of Health, 4Department of Cardiology, German Heart Centre Berlin (DHZB), 5Sod of Interdisciplinary Internal Medicine, Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi (AOUC), 6Department of General and Interventional Cardiology, Helios Klinikum Erfurt
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन में, हम कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व के ताजा नमूनों से टी लिम्फोसाइट अलगाव की प्रक्रिया और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके अनुकूली ल्यूकोसाइट सबसेट के लक्षण वर्णन के लिए टी सेल-क्लोनिंग के विश्लेषणात्मक चरणों का वर्णन करते हैं।

Abstract

कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग (सीएवीडी), वाल्व के हल्के मोटा होने से लेकर गंभीर कैल्सीफिकेशन तक की एक सक्रिय रोग प्रक्रिया, ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (टीएवीआर) जैसे नए चिकित्सीय विकल्पों के बावजूद उच्च मृत्यु दर से जुड़ी हुई है।

वाल्व कैल्सीफिकेशन के साथ शुरू होने वाले और गंभीर महाधमनी स्टेनोसिस का कारण बनने वाले पूर्ण मार्ग केवल आंशिक रूप से समझे जाते हैं। विवो में महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान करके, स्टेनोटिक वाल्व ऊतक से टी लिम्फोसाइट्स की असेइंग कैल्सीफिकेशन के विकास में उनकी भूमिका को स्पष्ट करने का एक कुशल तरीका हो सकता है। सर्जिकल उच्छेदन के बाद, ताजा महाधमनी वाल्व के नमूने को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया जाता है और टी लिम्फोसाइट्स को सुसंस्कृत किया जाता है, क्लोन किया जाता है फिर प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके विश्लेषण किया जाता है।

धुंधला प्रक्रिया सरल है और दाग ट्यूबों को पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 0.5% का उपयोग करके भी ठीक किया जा सकता है और 15 दिनों के बाद तक विश्लेषण किया जा सकता है। स्टेनिंग पैनल से उत्पन्न परिणामों का उपयोग हस्तक्षेप के संबंध में समय के साथ टी सेल सांद्रता में परिवर्तन को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और आसानी से ब्याज के विशिष्ट टी सेल उपप्रकारों के सक्रियण राज्यों का आकलन करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम टी कोशिकाओं के अलगाव को दिखाते हैं, जो ताजा कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व नमूनों पर किया जाता है और सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी में अनुकूली प्रतिरक्षा की भूमिका को समझने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके टी सेल क्लोन का विश्लेषण करने के चरण।

Introduction

कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग (CAVD) स्वास्थ्य देखभाल पर भारी प्रभाव के साथ सबसे आम हृदय वाल्व विकारों में से एक है। पिछले वर्षों में महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन की आवृत्ति नाटकीय रूप से बढ़ी है और बढ़ती बुजुर्ग आबादी के कारण आगे बढ़ने की उम्मीद है1।

CAVD के अंतर्निहित pathophysiology केवल आंशिक रूप से जाना जाता है और वर्तमान चिकित्सीय रणनीतियों रूढ़िवादी उपायों या महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन तक सीमित हैं, या तो सर्जिकल या percutaneous प्रक्रियाओं के माध्यम से। आज तक, कोई भी प्रभावी चिकित्सा उपचार सीएवीडी प्रगति को बाधित या रिवर्स नहीं कर सकता है और उच्च मृत्यु दर प्रारंभिक लक्षण-शुरुआत से जुड़ी हुई है, जब तक कि महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (एवीआर) नहीं किया जाता है। गंभीर रोगसूचक महाधमनी स्टेनोसिस वाले रोगियों में, 3 साल के लक्षण-मुक्त अस्तित्व को 20% 3 के रूप में कम बताया गया था। ट्रांसकैथेटर महाधमनी वाल्व प्रतिस्थापन (टीएवीआर) एक नए विकल्प का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से बुजुर्गों के बीच उच्च जोखिम वाले रोगियों के लिए उपचार में क्रांति लाता है और नाटकीय रूप से मृत्यु दर को कम कर देता है, जो इस आबादी में आंतरिक रूप से उच्च था4,5,6। टीएवीआर के आशाजनक परिणामों के बावजूद, उपन्यास प्रारंभिक चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी को समझने के लिए आगे के शोध की आवश्यकता है7,8,9।

पहले एक निष्क्रिय, अपक्षयी प्रक्रिया माना जाता था, CAVD को अब एक सक्रिय प्रगतिशील बीमारी के रूप में पहचाना जाता है, जो महाधमनी वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं के एक ऑस्टियोब्लास्टिक फेनोटाइप स्विच की विशेषता है10। इस बीमारी में प्रगतिशील खनिजीकरण, फाइब्रोकैल्सिफ़िक परिवर्तन और महाधमनी वाल्व पत्रकों (स्केलेरोसिस) की गतिशीलता में कमी शामिल है, जो अंततः महाधमनी वाल्व ओपनिंग 11 के संकुचन (स्टेनोसिस) के लिए अग्रणी रक्त प्रवाह को बाधित करती है।

सूजन को सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया माना जाता है, जो संवहनी एथेरोस्क्लेरोसिस की प्रक्रिया के समान है। एंडोथेलियल चोट लिपिड प्रजातियों के जमाव और संचय को सक्षम बनाती है, विशेष रूप से महाधमनी वाल्व 12 में ऑक्सीकरण लिपोप्रोटीन। ये ऑक्सीकृत लिपोप्रोटीन एक भड़काऊ प्रतिक्रिया को उत्तेजित करते हैं, क्योंकि वे साइटोटॉक्सिक होते हैं, जिसमें भड़काऊ गतिविधि खनिजीकरण के लिए अग्रणी होती है। CAVD विकास और रोग की प्रगति में जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा की भूमिका को हाल ही में हाइलाइट किया गया है। मेमोरी टी कोशिकाओं के विशिष्ट सबसेट के सक्रियण और क्लोनल विस्तार को सीएवीडी और खनिजीकृत महाधमनी वाल्व पत्रक वाले रोगियों में प्रलेखित किया गया है, ताकि भड़काऊ प्रक्रियाओं को कम से कम सीएवीडी के विकास में शामिल माना जा सके और संभवतः रोग की प्रगति में भी शामिल हो। वास्तव में, हालांकि एंटीजन-प्रस्तुत करने वाली कोशिकाएं और मैक्रोफेज स्वस्थ और रोगग्रस्त वाल्व दोनों में मौजूद हैं, टी लिम्फोसाइट्स की उपस्थिति एक वृद्ध और रोगग्रस्त महाधमनी वाल्व का संकेत है। यह लिम्फोसाइटिक घुसपैठ के साथ-साथ नियोवैस्कुलराइजेशन और मेटाप्लासिया में वृद्धि के साथ-साथ CAVD15 के विशिष्ट हिस्टोलॉजिकल संकेत हैं।

हम महाधमनी वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण के बीच एक बातचीत के अस्तित्व की परिकल्पना करते हैं, जो संभावित रूप से महाधमनी वाल्व में एक पुरानी भड़काऊ प्रक्रिया की शुरुआत को ट्रिगर करता है। स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व ऊतक से टी कोशिकाओं की असेइंग कैल्सीफिकेशन विकास में उनकी भूमिका को स्पष्ट करने का एक प्रभावी तरीका हो सकता है, क्योंकि यह विवो में महाधमनी वाल्व कोशिकाओं का एक करीबी प्रतिनिधित्व प्रदान कर सकता है। वर्तमान काम में, महाधमनी वाल्व ऊतक का उपयोग करके, हम टी-लिम्फोसाइट्स, संस्कृति को अलग करते हैं और उन्हें क्लोन करते हैं, और बाद में प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) का उपयोग करके उन्हें चिह्नित करते हैं। ताजा महाधमनी वाल्व के नमूनों को सीएवीडी रोगियों से उत्पादित किया गया था, जिन्होंने गंभीर महाधमनी स्टेनोसिस के लिए सर्जिकल वाल्व प्रतिस्थापन प्राप्त किया था। सर्जिकल उच्छेदन के बाद, ताजा वाल्व नमूने को छोटे टुकड़ों में विच्छेदित किया गया था और टी कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था, क्लोन किया गया था, फिर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। धुंधला प्रक्रिया सरल है और दाग ट्यूबों को पैराफॉर्मेल्डिहाइड के 0.5% का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है और 15 दिनों बाद तक विश्लेषण किया जा सकता है। स्टेनिंग पैनल से उत्पन्न डेटा का उपयोग हस्तक्षेप के संबंध में समय के साथ टी लिम्फोसाइट वितरण में परिवर्तनों को ट्रैक करने के लिए किया जा सकता है और आसानी से ब्याज के विशिष्ट टी सेल सबसेट के सक्रियण राज्यों का आकलन करने के लिए आगे विकसित किया जा सकता है।

कैल्सीफाइड ऊतक का निष्कर्षण, कैल्सीफाइड ऊतक से ल्यूकोसाइट्स का अलगाव और विशेष रूप से इस प्रकार के ऊतकों पर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग चुनौतीपूर्ण हो सकता है, ऑटोफ्लोरेसेंस जैसे मुद्दों के कारण। इस विशिष्ट उद्देश्य के लिए प्रोटोकॉल के साथ कुछ प्रकाशन मौजूद हैं16,17,18. इसमें हम मानव महाधमनी वाल्व नमूनों से टी लिम्फोसाइट के प्रत्यक्ष अलगाव और संस्कृति के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए एक प्रोटोकॉल को प्रस्तुत करते हैं। लिम्फोसाइटों का क्लोनल विस्तार अनुकूली प्रतिरक्षा की एक पहचान है। विट्रो में इस प्रक्रिया का अध्ययन लिम्फोसाइट विषमता 19 के स्तर पर व्यावहारिक जानकारी प्रदान करता है। तीन सप्ताह की इनक्यूबेशन अवधि के बाद, टी सेल क्लोन को स्पष्टीकरण देने के लिए तैयार हैं, क्योंकि प्रत्येक क्लोन से पर्याप्त मात्रा में टी कोशिकाएं प्राप्त की गई थीं, ताकि फेनोटाइपिक और कार्यात्मक अध्ययन की अनुमति मिल सके। बाद में टी क्लोन के फेनोटाइप का अध्ययन साइटोफ्लोरोमेट्री द्वारा किया जाता है।

यह प्रतिरक्षाविज्ञानी प्रोटोकॉल एक विधि का एक अनुकूलन है जिसे पहले एमेदेई एट अल द्वारा विकसित किया गया था टी सेल अलगाव और मानव ऊतक से लक्षण वर्णन के लिए, विशेष रूप से कैल्सीफाइड मानव ऊतक के लिए डिज़ाइन किया गया था, जैसे कि CAVD20,21,22 में। विकिरणित बफी कोट का उपयोग करके पीबीएमसी (परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं) के अलगाव के लिए यहां प्रोटोकॉल फीडर कोशिकाओं (एफसी) को प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी तरीके का वर्णन करता है, विशेष रूप से वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं से अलग टी लिम्फोसाइट्स के क्लोनिंग चरण के लिए समायोजित किया जाता है। फीडर परत में विकास गिरफ्तार कोशिकाएं होती हैं, जो अभी भी व्यवहार्य और बायोएक्टिव हैं। फीडर कोशिकाओं की भूमिका इन विट्रो अस्तित्व और वाल्व अंतरालीय कोशिकाओं से अलग टी लिम्फोसाइट्स के विकास का समर्थन करने के लिए महत्वपूर्ण है23। संस्कृति में फीडर सेल प्रसार से बचने के लिए, इन कोशिकाओं को विकास गिरफ्तारी से गुजरना चाहिए। यह दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है: विकिरण जैसे भौतिक तरीकों के माध्यम से, या साइटोटॉक्सिक रसायनों के साथ उपचार के माध्यम से, जैसे कि मिटोमाइसिन सी (एमएमसी), एक एंटीट्यूमरल एंटीबायोटिक जिसे सीधे संस्कृति की सतह पर लागू किया जा सकता है24। यहां हम सेल विकिरण के माध्यम से प्राप्त फीडर सेल विकास गिरफ्तारी दिखाते हैं।

यह विधि महाधमनी वाल्व ऊतक से टी कोशिकाओं को अलग करने और चिह्नित करने के लिए एक कुशल, लागत प्रभावी तरीका प्रस्तुत करती है, जो सीएवीडी पैथोफिजियोलॉजी की खोज के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी तरीकों के स्पेक्ट्रम को व्यापक बनाने में योगदान देती है।

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Protocol

यह अध्ययन अच्छे वैज्ञानिक अभ्यास को सुनिश्चित करने के लिए चारिटे के संविधि के अनुसार आयोजित किया गया था और गोपनीयता और नैतिकता पर कानूनी दिशानिर्देशों और प्रावधानों का सम्मान किया गया था। नैतिकता समिति ने सभी मानव प्रयोगों को मंजूरी दे दी और रोगियों की गोपनीयता और गुमनामी को नैतिक फॉर्म पर रिपोर्ट किए गए नियमों के अनुसार बनाए रखा गया था।

नोट: नीचे वर्णित प्रोटोकॉल के लिए ताजा मानव स्टेनोटिक वाल्व के नमूनों का उपयोग किया गया था।

1. अभिकर्मक तैयारी

  1. RPMI 1640 मध्यम में जोड़कर समृद्ध RPMI पूरा माध्यम तैयार करें: गैर-आवश्यक अमीनो एसिड; सोडियम पाइरूवेट, एल- ग्लूटामाइन, π-Mercaptoethanol और पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / स्ट्रेप)। उपयोग करने से पहले इसे फ़िल्टर करें। +4 °C पर स्टोर करें और दो महीने के भीतर उपयोग करें।
  2. समृद्ध RPMI 1640 पूर्ण माध्यम गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), HB बेसल माध्यम, इंटरल्यूकिन 2 (IL-2) और मानव सीरम (HS) के 50 U का उपयोग कर क्लोनिंग चरण के लिए सेल संस्कृति माध्यम (CCM) तैयार करें। फ़िल्टर करें और दिन के भीतर इसका उपयोग करें। स्टोर न करें।
  3. संवर्धित RPMI 1640 पूर्ण माध्यम का उपयोग करके पुन: पीडिंग चरण के लिए सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें, जिसमें जोड़ा गया FBS, HB बेसल माध्यम, IL-2 और HS के 30 U शामिल हैं। फ़िल्टर करें और दिन के भीतर इसका उपयोग करें। स्टोर न करें।
  4. 250 मिलीलीटर आरपीएमआई और 5 एमएल पेन / स्ट्रेप युक्त वॉश बफर तैयार करें। +4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, दो महीने के भीतर उपयोग करें।

2. मानव टी लिम्फोसाइट अलगाव और टी -25 फ्लास्क में संस्कृति

  1. स्टेनोटिक वाल्व के नमूने को वॉश बफर से भरे एक बाँझ पेट्री डिश में रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पूरे वाल्व का नमूना इसके साथ कवर किया गया है। 15 मिनट के लिए खड़े रहने दें।
  2. एक स्केलपेल का उपयोग करके स्टेनोटिक वाल्व को छोटे टुकड़ों में काटें और इसे 10 मिनट के लिए फिर से खड़े होने दें।
  3. आईएल -2 के 50 यू के साथ सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें, जैसा कि पहले वर्णित है, और इसे फ़िल्टर करें।
  4. T25 फ्लास्क के अंदर सीसीएम जोड़ें और एक बाँझ प्लास्टिक प्लायर का उपयोग करके, फ्लास्क के अंदर वाल्व के टुकड़े रखें।
  5. फ्लास्क को एक सप्ताह के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर के अंदर एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्टोर करें, माइक्रोस्कोप के तहत फ्लास्क की स्थिति का निरीक्षण करने का ध्यान रखें। टी सेल क्लोन संस्कृति चरण के लगभग तीन दिन बाद दिखाई देना चाहिए; बेहतर अवलोकन के लिए माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण से पहले फ्लास्क को 20 मिनट के लिए क्षैतिज स्थिति में रखने की सलाह दी जाती है।
    नोट: सेल संस्कृति माध्यम की मात्रा मौजूद नमूने की मात्रा पर निर्भर करती है और कितने T25 फ्लास्क का उपयोग किया जाएगा पर निर्भर करता है। यह देखते हुए कि वाल्व के प्रत्येक टुकड़े को एक फ्लास्क के अंदर 10 मिलीलीटर सीसीएम की आवश्यकता होती है, एक टी 25 फ्लास्क में 25 एमएल सीसीएम वाल्व के 3 टुकड़ों के लिए उपयुक्त है।

3. क्लोनिंग चरण

नोट: टी कोशिकाओं के क्लोनिंग चरण के लिए, PBMCs प्रोटोकॉल का पालन करते हुए एक विकिरणित बफी कोट (BC) से फीडर कोशिकाओं के अलगाव के साथ शुरू करना आवश्यक है।

  1. सुई मुक्त वाल्व के साथ बैग स्पाइक का उपयोग करके लैमिनर फ्लो हुड के नीचे बीसी बैग खोलें और टी 150 फ्लास्क में 50 मिलीलीटर रक्त स्थानांतरित करें। फ्लास्क के अंदर रक्त को पतला करने के लिए पीबीएस के 70 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. चार 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब लें और प्रत्येक में घनत्व ढाल माध्यम के 20 मिलीलीटर रखें और ध्यान से इसके ऊपर 30 मिलीलीटर रक्त की परत करें।
  3. ब्रेक ऑफ के साथ 800 x g और 20 °C पर 25 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  4. सावधानी से supernatant aspirate और इसे अपशिष्ट के रूप में छोड़ दें। 50 मिलीलीटर की मात्रा तक पीबीएस समाधान के अंदर जोड़ने के लिए एक नया 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में PBMCs अंगूठी ले लीजिए।
  5. 400 x g और 20 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  6. supernatant त्यागें और 50 mL की मात्रा तक PBS समाधान के अंदर जोड़कर गोली को निलंबित करें। 400 x g और 20 °C पर 10 मिनट के लिए centrifugation चरण को दोहराएं।
  7. supernatant को छोड़ दें और सेल संस्कृति माध्यम के 10 mL में FCs निलंबित करें।
  8. एक नया संग्रह ट्यूब ले लो और PBS 1: 10 के साथ FCs पतला PBS के 9.9 mL और FCs और सेल संस्कृति माध्यम के साथ ट्यूब से 100 μL के अंदर जोड़कर. एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से कुल्ला और इस कमजोर पड़ने से 7 μL ले लो और माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की गिनती।
  9. क्लोनिंग चरण के लिए सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें: आईएल -2 के 50 यू के साथ 70 मिलीलीटर, और फिर इसे दो 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूबों में विभाजित करें, प्रत्येक ट्यूब में 25 मिलीलीटर सेल संस्कृति माध्यम होगा, जैसा कि नीचे वर्णित है:
    • ट्यूब 1: सीसीएम के 25 मिलीलीटर + एफसी + फाइटोहेमाग्लूटिनिन (पीएचए) का 0.6%
    • ट्यूब 2: सीसीएम + टी लिम्फोसाइटों के 25 मिलीलीटर
      नोट: PMBCs विधि का उद्देश्य प्रत्येक mL के लिए 2 x 106 कोशिकाओं को प्राप्त करना है, इसलिए तैयार किए गए CCM के 25 mL (Tube 1) को तदनुसार गणना करने की आवश्यकता है। उपयोग किया गया सामान्य सूत्र है: गिने गए कक्षों की संख्या x 106: 1 mL = CCM x 106: X

4. टी लिम्फोसाइट्स multiwell प्लेटों में संस्कृति

  1. इलेक्ट्रॉनिक पिपेट का उपयोग करके, फ्लास्क के अंदर सभी सेल संस्कृति माध्यम को इकट्ठा करें और इसे 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें। खाली फ्लास्क को फेंक दिया जा सकता है।
  2. 400 x g और 20 °C पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं गोली.
  3. supernatant त्यागें, पीबीएस के 50 मिलीलीटर में गोली को निलंबित और 400 x जी और 20 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा। इस चरण को दो बार दोहराएं।
  4. supernatant त्यागें और सीसीएम के 1 मिलीलीटर में गोली को निलंबित. इस कमजोर पड़ने से 7 μL लें और माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की गिनती करें।
    नोट:: गिनती कक्षों की संख्या कक्ष की मात्रा के लिए और लागू कमजोर पड़ने के लिए गुणा करने की आवश्यकता है।
  5. सेल कल्चर माध्यम में 105 से 103 तक गिने गए कोशिकाओं को पतला करने के लिए आगे बढ़ें और फिर 103 से 500 μL लें और इसे ट्यूब 2 के अंदर रखें।
  6. एक 100 मिमी x 15 मिमी प्लास्टिक पेट्री पकवान के अंदर ट्यूब 1 के 25 एमएल सेल संस्कृति माध्यम डालो।
  7. चार 96-U नीचे multiwell प्लेटों ले लो और प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μL बीज एफसी के लिए सेट एक multichannel पिपेट का उपयोग कर।
  8. ट्यूब 2 ले लो और एक पेट्री पकवान के अंदर सेल संस्कृति माध्यम डालो। एक multichannel पिपेट का उपयोग करके 100 μL, प्रत्येक अच्छी तरह से बीज टी कोशिकाओं के लिए सेट.
  9. एक सप्ताह के लिए एक CO2 इनक्यूबेटर के अंदर multiwell प्लेटों को स्टोर करें।

5. पहली repeeding चरण

  1. एक विकिरणित बफी कोट बैग का उपयोग करते हुए, पिछली विधि में वर्णित के रूप में एफसी प्राप्त करने के लिए PBMCs विधि का पालन करें।
  2. पीएचए के बिना सीसीएम की उपयुक्त मात्रा तैयार करें और इसे फ़िल्टर करें।
  3. एक multichannel पिपेट का उपयोग करते हुए, प्रत्येक अच्छी तरह से 100 μL निकालें, यह सुनिश्चित करते हुए कि कुएं के नीचे को स्पर्श न करें।
  4. सेल संस्कृति पोषक तत्वप्रदान करने और माध्यम को बदलने के लिए एक खिला परत के रूप में सभी कुओं में एफसी के 100 μL जोड़ें।
    नोट: प्रत्येक मल्टीवेल के लिए सीसीएम के 6 एमएल पर विचार करने की सलाह दी जाती है, इसलिए 4 मल्टीवेल के लिए अनुशंसित मात्रा लगभग 30 एमएल है। पीएचए (कुल सीसीएम मात्रा का 0.4%) को हर दो सप्ताह में एक बार सीसीएम में जोड़ा जाना चाहिए।

6. दूसरा repeeding चरण

  1. ऊपर वर्णित मार्ग के बाद रीफीडिंग चरण को दोहराएं। 0.4% पीएचए को सेल कल्चर माध्यम में जोड़ने की आवश्यकता है।

7. 1 अच्छी तरह से / नमूना से 2 कुओं / नमूने के लिए पहला विभाजन चरण /

  1. माइक्रोस्कोप के तहत सभी चार multiwells की जाँच करें और टी सेल क्लोन (TCCs) के साथ उन कुओं को विभाजित आगे बढ़ें।
  2. एक विकिरणित बफी कोट बैग से फीडर कोशिकाओं को अलग करने के लिए PBMCs प्रोटोकॉल का पालन करें।
  3. आईएल -2 के 30 यू के साथ सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें। एफसी जोड़ें और यू नीचे के साथ एक नया 96-अच्छी तरह से multiwell प्लेट ले लो।
  4. 100 μL पर सेट किए गए पिपेट का उपयोग करके, चयनित नमूनों के कुओं के अंदर अच्छी तरह से कुल्ला करें और प्रत्येक कुएं में निहित मात्रा के 200 μL को नए मल्टीवेल प्लेट के 2 नए कुओं में विभाजित करें, ताकि नए 2 कुओं में से प्रत्येक के लिए 100 μL मात्रा हो।
  5. सभी नए कुओं के अंदर एफसी के 100 μL जोड़ें। प्रत्येक कुएं में 200 μL की कुल मात्रा होनी चाहिए।
  6. पिपेट को 100 μL पर सेट करें और एक अतिरिक्त दो कुओं में 100 μL जोड़ें, जिसमें नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए केवल FCs शामिल हैं।
    नोट: सभी मल्टीवेल प्लेटों का निरीक्षण करने के लिए प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें ताकि यह निर्धारित किया जा सके कि कौन से कुओं ने सफलतापूर्वक टीसीसी विकसित किया है। क्लोन के चयन को आसान बनाने के लिए, नियंत्रण की तुलना की जा सकती है (केवल एफसी वाले दो कुओं), क्लोन नियंत्रण की तुलना में गहरा और बड़ा दिखाई देता है। चुने जाने वाले कुओं में वे हैं जिनके पास एक बड़ा, स्पष्ट, गोल क्लोन है, जिसमें लिम्फोसाइट्स एक साथ घने पैक किए गए हैं। यदि दो सप्ताह के रीफीडिंग के बाद कोई टीसीसी मौजूद नहीं है, तो एक और सप्ताह तक इंतजार करने और एक अतिरिक्त रीफीडिंग चरण करने की सिफारिश की जाती है।

8. 2 कुओं / नमूने से 4 कुओं / नमूने के लिए दूसरा विभाजन चरण /

  1. पिपेट को 100 μL पर सेट करें, प्रत्येक नमूने के दो कुओं के अंदर अच्छी तरह से कुल्ला करें और प्रत्येक के लिए 100 μL के दो नए कुओं को बीज दें।
  2. आईएल -2 के 30 यू के साथ सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें और फूले हुए कोट बैग से एफसी निकालने के लिए पीबीएमसी तकनीक का पालन करें और सीसीएम के अंदर एफसी रखें।
  3. पिपेट को 100 μL पर सेट करें और सभी कुओं में एफसी को बीज दें। एक सप्ताह के लिए एक CO2 इनक्यूबेटर में multiwells स्टोर करें।

9. 4 कुओं / नमूने से 8 कुओं / नमूने के लिए तीसरा विभाजन चरण:

  1. 100 μL पर सेट किए गए एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक नमूने के सभी चार कुओं के अंदर अच्छी तरह से कुल्ला करें और एक नई 96-अच्छी तरह से प्लेट में चार नए कुओं में से प्रत्येक में बीज 100 μL।
  2. सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें और एक विकिरणित बफी कोट बैग से एफसी निकालने के लिए PBMCs तकनीक का पालन करें।
  3. CCM के अंदर FCs रखें। पिपेट को 100 μL पर सेट करें और सभी कुओं में एफसी को बीज दें। एक सप्ताह के लिए एक CO2 इनक्यूबेटर में multiwells स्टोर

10. Cytofluorimetric विश्लेषण

  1. CO2 इनक्यूबेटर से सबसे पुरानी तारीख के साथ मल्टीवेल प्लेट लें और विश्लेषण करने के लिए नमूना संख्याओं के साथ संग्रह ट्यूबों की पहचान करें।
  2. एक multichannel पिपेट का उपयोग करके 2 युक्तियों के साथ 200 μL पर सेट, एक ही नमूने के दो कुओं के अंदर अच्छी तरह से कुल्ला और एक ही संग्रह ट्यूब के अंदर दोनों डाल दिया। सभी नमूनों के लिए इस चरण को दोहराएँ।
    नोट:: FCs नमूने का विश्लेषण नहीं किया जाएगा, क्योंकि वे केवल नियंत्रण के रूप में कार्य करते हैं।

11. एंटीबॉडी धुंधला पैनल cytofluorimetric विश्लेषण के लिए तैयारी

  1. प्रत्येक ट्यूब के लिए पीबीएस समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 400 x g और 20 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  2. centrifugation चरण supernatant छोड़ के बाद.
    नोट: एंटीबॉडी धुंधला पैनल तालिका 1 में पाया जा सकता है। गणना की गई प्रत्येक एकल एंटीबॉडी एकाग्रता लगभग 2 μL / नमूना है। उपयोग से पहले एंटीबॉडी ट्यूबों को संक्षेप में स्पिन करने की सिफारिश की जाती है। फ्लोरोफोर-संयुग्मित एंटीबॉडी को प्रकाश से बचाने के लिए, सभी चरणों को अंधेरे में किया जाना चाहिए।
  3. एक 1.5 मिली ट्यूब के अंदर एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें और इसे भंवर करें।
  4. नमूनों के अंदर एंटीबॉडी जोड़ें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में इनक्यूबेट करने के लिए नमूनों को छोड़ दें।
  5. प्रत्येक नमूने में पीबीएस के 1 एमएल जोड़ें और 400 x g और 20 °C पर 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज।
  6. supernatant त्यागें और पीबीएस समाधान के 500 μL के साथ गोली को निलंबित.
  7. साइटोफ्लोरिमेट्रिक विश्लेषण (FACS विश्लेषण, तालिका 1) के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: दाग नमूनों को पीबीएस समाधान में पतला 0.5% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है और 15 दिनों के बाद तक विश्लेषण किया जा सकता है।
    सावधानी: पीएफए विषाक्त है और इसे सावधानी से संभाला जाना चाहिए।
मार्कर फ्लोरोफोर
CD3 PE/Cy7
CD4 एलेक्सा फ्लोर 488
CD8 शानदार वायलेट 510
CD14 शानदार वायलेट 421
CD25 पीई
CD45 शानदार वायलेट 711

तालिका 1. कैल्सीफिकेशन महाधमनी वाल्व रोग में टी लिम्फोसाइट्स की आबादी का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी धुंधला पैनल।

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Representative Results

हमने गंभीर महाधमनी वाल्व स्टेनोसिस (प्रोटोकॉल का संदर्भ लें) के साथ मानव रोगियों से व्युत्पन्न ताजा महाधमनी वाल्व नमूनों की ल्यूकोसाइट आबादी को चिह्नित करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि का उपयोग किया। PBMCs को अलग करने की विधि फीडर कोशिकाओं को प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कदम है, जिसका उपयोग प्रयोग के हर चरण (क्लोनिंग, रीफीडिंग और विभाजन चरणों) में किया जाता है और महाधमनी वाल्व नमूनों में घुसपैठ करने वाले ल्यूकोसाइट्स का पता लगाने और लक्षण वर्णन को सक्षम करता है। इस विधि के मुख्य चरण चित्र 1 में दिखाए गए हैं।

Figure 1
चित्र 1. Buffy कोट से एफसी अलगाव. (ए) घनत्व ढाल माध्यम पर स्तरित रक्त (बी) सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद प्राप्त सफेद रक्त कोशिकाओं की अंगूठी (सी) पीबीएस समाधान में एकत्र और पुन: निलंबित सफेद रक्त कोशिकाएं (डी) प्रकाश माइक्रोस्कोपी के तहत देखी गई सफेद कोशिकाएं कृपया इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इनक्यूबेशन के दो हफ्तों के बाद, हमने सफलतापूर्वक क्लोन किया और एक टी सेल आबादी को बढ़ाया, जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है।

Figure 2
चित्र 2. प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखे गए इनक्यूबेशन के दो सप्ताह के बाद टी सेल क्लोन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चित्रा 3 CAVD के साथ रोगियों में टी सेल उप-आबादी के विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग योजना को दर्शाता है। जैसा कि FACS विश्लेषण के परिणाम से दिखाया गया है, CD8+ T-cells (1.079%) की तुलना में अधिक CD4+ T-cells (43.032%) हैं।

Figure 3
चित्र 3. टी सेल-उप-जनसंख्या विश्लेषण के लिए उपयोग की जाने वाली गेटिंग योजना। (ए) एक स्टेनोटिक वाल्व में विशिष्ट टी सेल आबादी की पहचान करने के लिए एक गेट लागू किया गया है। (बी) सीडी 14 नकारात्मक लिम्फोसाइटों और सीडी 3 सकारात्मक लिम्फोसाइटों। (सी) सीडी 3 लिम्फोसाइटों को सीडी 8 + टी कोशिकाओं से सीडी 4 + टी कोशिकाओं को अलग करने के लिए गेटेड किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह दिखाने के लिए कि एक ही टी सेल मार्कर देशी वाल्व नमूनों और क्लोन नमूनों दोनों में मौजूद हैं, हमने क्लोनिंग चरण के बिना एफएसीएस विश्लेषण किया, जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है।

Figure 4
चित्र 4. दो वाल्व नमूनों के FACS विश्लेषण परिणाम। हमने एक देशी वाल्व नमूने और एक क्लोन नमूने से प्राप्त टी कोशिकाओं की तुलना की, यह सत्यापित करते हुए कि देशी वाल्व में पाई जाने वाली टी कोशिकाएं अंतिम क्लोन उत्पाद में टी कोशिकाओं के विशिष्ट मार्करों को साझा करती हैं। (ए) क्लोनिंग चरण के बिना, एक देशी वाल्व नमूने के FACS परिणाम। (बी) क्लोनिंग चरण के बाद विश्लेषण किए गए वाल्व नमूने के एफएसीएस परिणाम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरे वर्कफ़्लो को चित्रा 5 में संक्षेप ति किया गया है, जो मानव महाधमनी वाल्व के विच्छेदन से शुरू होता है और FACS विश्लेषण तक जाता है। एक महाधमनी वाल्व नमूने के विश्लेषण के लिए सभी चरणों की आवश्यकता होती है। चरण 1 स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व ऊतक से लिम्फोसाइट अलगाव दिखाता है। वाल्व के नमूनों को काटने और धोने के बफर से भरे पेट्री डिश में रखने की आवश्यकता होती है। वाल्व के टुकड़ों को सीसीएम से भरे टी 25 फ्लास्क के अंदर रखा जा सकता है और एक सप्ताह के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में संग्रहीत किया जा सकता है। चरण 2 क्लोनिंग चरण को दिखाता है, जिसमें दो भाग होते हैं: 1) विकिरणित बफी कोट बैग से एफसी अलगाव और 2) टी कोशिकाएं क्लोनिंग चरण और 96-वेल्स मल्टीवेल प्लेट में सेल संस्कृति के साथ समाप्त होती हैं, जो एक सप्ताह के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में संग्रहीत होती है। चरण 3 और 4 में विकिरणित बफी कोट से एफसी का उपयोग करके रीफीडिंग चरण शामिल है; इस चरण को लगातार दो हफ्तों के लिए दोहराया जाना चाहिए। चरण 4, 5 और 6 टी सेल क्लोन के विभाजन चरण को दिखाते हैं; पहला विभाजन चरण एक नई मल्टीवेल प्लेट में प्रत्येक नमूने के लिए 1 अच्छी तरह से / नमूना से दो कुओं तक है; दूसरा विभाजन एक ही मल्टीवेल प्लेट में प्रत्येक के लिए 2 कुओं / नमूने से 4 कुओं तक है; तीसरा और अंतिम विभाजन चरण एक नई मल्टीवेल प्लेट में 4 कुओं / नमूने से 8 तक है। चरण 7 अंतिम चरण है, जहां एफएसीएस विश्लेषण का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण किया जाता है।

Figure 5
चित्र 5. CAVD प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रारंभिक परिणामों (चित्रा 2) से हम यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि लिम्फोसाइट्स, सीडी 45 + ल्यूकोसाइट्स के साथ कैल्सीफाइड महाधमनी वाल्व में मौजूद हैं, इस प्रकार यह दर्शाता है कि कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग प्रतिरक्षा प्रणाली और भड़काऊ गतिविधि के सक्रियण से जुड़ा हुआ है।

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Discussion

यहां हम प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व के नमूनों से अलग किए गए टी लिम्फोसाइट उप-आबादी को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। इस विधि के लिए PBMCs को अलग करने के लिए विकिरणित बफी कोट के उपयोग की आवश्यकता होती है। विकिरण आवृत्ति जिसके लिए बफी कोट बैग के अधीन किया जाना चाहिए 9000 Rad / 90 ग्रे (Gy) है और यह फीडर कोशिकाओं के प्रसार को रोकने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है। बफी कोट बैग से अलग कोशिकाओं की भूमिका केवल फीडर कोशिकाओं के रूप में कार्य करना और वाल्व से अलग टी कोशिकाओं के लिए पोषक तत्व प्रदान करना है। एक unirradiaded buffy कोट बैग का उपयोग संस्कृति में PBMCs के प्रसार को बढ़ावा देगा, जैसा कि पिछले 25 में उल्लेख किया गया है। 90 Gy से नीचे एक विकिरण आवृत्ति ने संस्कृति में PBMCs प्रसार दिखाया, इसलिए हम विकिरण के बिल्कुल 90 Gy का उपयोग करने की सलाह देते हैं। ध्यान दें, एक ही दिन या अधिक से अधिक अगले दिन विकिरणित बफी कोट का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, इसे एक उपकरण पर रखते हुए जो इसे निरंतर आंदोलन में रखता है। इस विधि का एक और महत्वपूर्ण कदम लिम्फोसाइट क्लोनिंग चरण द्वारा दर्शाया जा सकता है, जो कलाकृतियों से प्रभावित हो सकता है; इस घटना से बचने के लिए हम ताजा महाधमनी वाल्व नमूनों पर FACS प्रदर्शन. टी लिम्फोसाइट्स के क्लोनिंग चरण में एक नए नमूने के विश्लेषण से प्राप्त संख्या की तुलना में फेनोटाइपिक और कार्यात्मक रूप से विश्लेषण करने के लिए टी क्लोन (प्रत्येक वाल्व के लिए 15 टी कोशिकाओं के क्लोन का औसत) की एक बड़ी संख्या प्राप्त करने का लाभ होता है। क्लोनिंग तकनीक का उपयोग इस शोध समूह द्वारा कई वर्षों से किया गया है और विश्लेषण किए गए ऊतक के प्रकार के आधार पर, लिम्फोसाइट प्रोफ़ाइल अलग-अलग 21,26,27 थी। विधि का पहला मार्ग एक स्टेनोटिक महाधमनी वाल्व से टी सेल अलगाव की चिंता करता है। वर्णित सभी चरणों को बाँझ स्थितियों में एक लैमिनर प्रवाह हुड के तहत किया जाना चाहिए और उपयोग से पहले सभी सामग्रियों को कीटाणुरहित करने की दृढ़ता से सिफारिश की जाती है। परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक समय 6 सप्ताह था और क्लोनिंग चरण से प्राप्त टी लिम्फोसाइट कोशिकाओं का औसत 20 x 106 कोशिकाएं थीं। मल्टीवेल प्लेटों का निगरानी चरण बहुत महत्वपूर्ण है और इसे अनदेखा नहीं किया जाना चाहिए। माध्यम से पीले रंग के रंग में परिवर्तन जीवाणु संदूषण का प्रतिनिधित्व कर सकता है, इस मामले में उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को निष्फल करने की आवश्यकता होती है और मल्टीवेल प्लेटों को फेंक दिया जाता है।

एफएसीएस विश्लेषण से पहले यह सत्यापित करने के लिए कि एंटीबॉडी चैनलों के बीच कोई विशिष्ट ओवरलैप नहीं है, एक उपयुक्त गेट स्थापित करना महत्वपूर्ण है। यह सकारात्मक और नकारात्मक द्वारों के बीच इष्टतम अलगाव को सक्षम बनाता है। अध्ययन में शामिल सभी नमूनों के लिए एंटीबॉडी के समान बहुत सारे के उपयोग को सजातीय परिणाम प्राप्त करने की सिफारिश की जाती है। फ्लोरोफोर-संयुग्मित एंटीबॉडी को प्रकाश से बचाने के लिए भी आवश्यक है, प्रकाश बंद के साथ सभी चरणों का प्रदर्शन करना।

यह विधि उच्च पुनरुत्पादन के साथ परिणाम देने में प्रभावी है और महंगी नहीं है। इस विधि की एक सीमा मानव वाल्व नमूनों की सीमित उपलब्धता के साथ-साथ एक नियंत्रण समूह की कमी के कारण, छोटे नमूने का आकार है।

प्रारंभिक परिणाम कैल्सिफिक महाधमनी वाल्व रोग के विकास और प्रगति में एक महत्वपूर्ण तत्व के रूप में अनुकूली प्रतिरक्षा की भूमिका का समर्थन करते हैं। इस अध्ययन में नामांकित सभी रोगियों में गंभीर रोगसूचक कैल्सिफिक महाधमनी स्टेनोसिस का निदान था, जिसमें औसत आयु 70 थी, ज्यादातर पुरुष। विश्लेषण किए गए महाधमनी वाल्वों में टी सेल आबादी का अस्तित्व प्रतिरक्षा कोशिका सक्रियण के चेकपॉइंट के रूप में रोगग्रस्त महाधमनी वाल्व की भड़काऊ गतिविधि के लिए सबूत प्रदान करता है। भविष्य की रुचि का एक बिंदु CAVD-घुसपैठ करने वाली टी कोशिकाओं की कार्यक्षमता का विश्लेषण करना और टी सेल विशिष्टता को चिह्नित करना हो सकता है जैसा कि पहले इसी तरह की बीमारियों में बताया गया था, जैसे कि एथेरोस्क्लेरोसिस 28,29,30 में।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी बफी कोट बैग डॉ पीटर रोसेंथल, डॉ डिर्क बोहमर और चारिटे बेंजामिन फ्रैंकलिन के रेडियोलॉजी विभाग की पूरी टीम की उपलब्धता के लिए विकिरणित थे। छात्रवृत्ति धारक / मैरी रॉक्साना क्रिस्टोफर, यह काम जर्मन कार्डियक सोसाइटी (डीजीके) से छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 mL plastic syringes Fisherbrand 9000701
96- well U- bottom Multiwell plates Greiner Bio-One 10638441
Bag Spike (needle free) Sigma P6148 Dilute to 4% with PBS
CD14 Brilliant violet 421  Biolegend 560349
CD25 PE  Biolegend 302621
CD3 PE/Cy7  Biolegend 300316
CD4 Alexa Fluor 488  Biolegend 317419
CD45 Brilliant violet 711  Biolegend 304137
CD8 Brilliant violet 510  Biolegend 301047
Eppendorf tube 1.5 mL Eppendorf 13094697
Eppendorf tube 0.5 mL Thermo Scientific AB0533
Falcon 15 mL conical centrifuge tube Falcon 10136120
Falcon 50 mL conical centrifuge tubes Falcon 10788561
Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes BD 2300E
Fast read 102 plastic counting chamber KOVA INTERNATIONAL 630-1893
Filters for culture medium 250 mL NalgeneThermo Fisher Scientific 168-0045
Filters for culture medium 500 mL NalgeneThermo Fisher Scientific 166-0045
HB 101 Lyophilized Supplement Irvine Scientific T151
HB Basal Medium Irvine Scientific T000
Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) Euroclone ECS0180L
HS (Human serum) Sigma Aldrich H3667
Human IL-2 IS Miltenyi Biotec 130-097-744
L-Glutamine Gibco 11140050
Lymphoprep Falcon 352057
Non-essential amino acids solution Sigma 11082132001
Paraformaldehyde Thermo Fisher Scientific 10538931
PBS (Phosphate-buffered saline) Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/Streptomycin Gibco 15070063 10000 U/mL
PHA (phytohemagglutinin) Stem Cell Technologies 7811
Plastic Petri dishes Thermo Scientific R80115TS 10 0mm x 15 mm
RPMI 1640 Media HyClone 15-040-CV
Sodium pyruvate Gibco by Life technologies 11360070
Syringe Filters 0,45µl Rotilabo-Spritzenfilter P667.1
T-25 Cell culture flasks InvitrogenThermo Fisher Scientific AM9625
T-75 Cell culture flask Thermo Fisher Scientific 10232771
β- Mercaptoethanol Gibco A2916801

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 168 महाधमनी वाल्व रोग महाधमनी स्टेनोसिस टी कोशिकाओं निष्कर्षण TAVI buffy कोट प्रवाह cytometry विश्लेषण अनुकूली प्रतिरक्षा.
विकिरणित बफी कोट से फीडर कोशिकाओं का उपयोग करके टी लिम्फोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के माध्यम से महाधमनी वाल्व कैल्सीफिकेशन की जांच करना
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Curini, L., Christopher, M. R., Grubitzsch, H., Landmesser, U., Amedei, A., Lauten, A., Alushi, B. Investigating Aortic Valve Calcification via Isolation and Culture of T Lymphocytes using Feeder Cells from Irradiated Buffy Coat. J. Vis. Exp. (168), e62059, doi:10.3791/62059 (2021).

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