Summary
In questo studio, descriviamo il processo di isolamento dei linfociti T da campioni freschi di valvole aortiche calcificate e le fasi analitiche della clonazione delle cellule T per la caratterizzazione dei sottoinsiemi di leucociti adattivi utilizzando l'analisi citometrica a flusso.
Abstract
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD), un processo di malattia attivo che va dal lieve ispessimento della valvola alla calcificazione grave, è associata a un'elevata mortalità, nonostante le nuove opzioni terapeutiche come la sostituzione della valvola aortica transcatetere (TAVR).
I percorsi completi che iniziano con la calcificazione valvolare e portano a una grave stenosi aortica rimangono solo parzialmente compresi. Fornendo una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo, il dosaggio dei linfociti T dal tessuto valvolare stenotico potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione. Dopo l'escissione chirurgica, il campione di valvola aortica fresca viene sezionato in piccoli pezzi e i linfociti T vengono coltivati, clonati e quindi analizzati utilizzando la selezione cellulare attivata a fluorescenza (FACS).
La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono anche essere riparati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I risultati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nelle concentrazioni delle cellule T nel tempo in relazione all'intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottotipi di cellule T di interesse. In questo studio, mostriamo l'isolamento delle cellule T, eseguito su campioni di valvola aortica calcificata fresca e le fasi di analisi dei cloni di cellule T utilizzando la citometria a flusso per comprendere ulteriormente il ruolo dell'immunità adattativa nella fisiopatologia CAVD.
Introduction
La malattia della valvola aortica calcifica (CAVD) è uno dei disturbi valvolari cardiaci più comuni, con un forte impatto sull'assistenza sanitaria. La frequenza di sostituzione della valvola aortica negli ultimi anni è aumentata drasticamente e si prevede che aumenterà ulteriormente, a causa della crescente popolazione anziana1.
La fisiopatologia sottostante della CAVD è solo parzialmente nota e le attuali strategie terapeutiche sono limitate a misure conservative o alla sostituzione della valvola aortica, sia attraverso procedure chirurgiche che percutanee. Ad oggi, nessun trattamento medico efficace può ostacolare o invertire la progressione della CAVD e un'elevata mortalità è associata all'insorgenza precoce dei sintomi, a meno che non venga eseguita la sostituzione della valvola aortica (AVR)2. Nei pazienti con stenosi aortica sintomatica grave, la sopravvivenza libera da sintomi a 3 anni è stata riportata a partire dal 20%3. La sostituzione transcatetere della valvola aortica (TAVR) rappresenta una nuova opzione, rivoluzionando il trattamento per i pazienti ad alto rischio, specialmente tra gli anziani e ha ridotto drasticamente la mortalità, che era intrinsecamente alta in questa popolazione4,5,6. Nonostante i risultati promettenti della TAVR, sono necessarie ulteriori ricerche per comprendere la fisiopatologia della CAVD per identificare nuovi bersagli terapeutici precoci7,8,9.
Precedentemente pensato per essere un processo passivo e degenerativo, la CAVD è ora riconosciuta come una malattia progressiva attiva, caratterizzata da un interruttore fenotipico osteoblastico delle cellule interstiziali della valvola aortica10. Questa malattia comporta una progressiva mineralizzazione, cambiamenti fibrocalcifici e una ridotta motilità dei foglietti della valvola aortica (sclerosi), che alla fine ostruiscono il flusso sanguigno portando al restringimento (stenosi) dell'apertura della valvola aortica11.
L'infiammazione è considerata un processo chiave nella fisiopatologia CAVD, simile al processo di aterosclerosi vascolare. La lesione endoteliale consente la deposizione e l'accumulo di specie lipidiche, in particolare lipoproteine ossidate nella valvola aortica12. Queste lipoproteine ossidate provocano una risposta infiammatoria, in quanto citotossiche, con l'attività infiammatoria che porta alla mineralizzazione. Il ruolo dell'immunità innata e adattativa nello sviluppo della CAVD e nella progressione della malattia è stato recentemente evidenziato13. L'attivazione e l'espansione clonale di specifici sottoinsiemi di cellule T di memoria sono state documentate in pazienti con CAVD e lembi valvolari aortici mineralizzati, in modo che si presume che i processi infiammatori siano coinvolti almeno nello sviluppo di CAVD e presumibilmente anche nella progressione della malattia14. Infatti, sebbene le cellule e i macrofagi che presentano l'antigene siano presenti sia nella valvola sana che in quella malata, la presenza di linfociti T è indicativa di una valvola aortica invecchiata e malata. Questo infiltrato linfocitico insieme ad un aumento della neovascolarizzazione e della metaplasia sono segni istologici caratteristici di CAVD15.
Ipotizziamo l'esistenza di un'interazione tra le cellule interstiziali della valvola aortica e l'attivazione del sistema immunitario, che potenzialmente innesca l'avvio di un processo infiammatorio cronico nella valvola aortica. Il dosaggio delle cellule T dal tessuto della valvola aortica stenotica potrebbe essere un modo efficace per chiarire il loro ruolo nello sviluppo della calcificazione, in quanto può fornire una rappresentazione ravvicinata delle cellule della valvola aortica in vivo. Nel presente lavoro, utilizzando il tessuto valvolare aortico, isoliamo i linfociti T, li colturamo e li cloniamo e successivamente li caratterizziamo utilizzando lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). Campioni freschi di valvola aortica sono stati asportati da pazienti con CAVD che hanno ricevuto la sostituzione chirurgica della valvola per stenosi aortica grave. Dopo l'escissione chirurgica, il campione di valvola fresco è stato sezionato in piccoli pezzi e le cellule T sono state coltivate, clonate e poi analizzate utilizzando la citometria a flusso. La procedura di colorazione è semplice e i tubi colorati possono essere fissati utilizzando lo 0,5% di paraformaldeide e analizzati fino a 15 giorni dopo. I dati generati dal pannello di colorazione possono essere utilizzati per tracciare i cambiamenti nella distribuzione dei linfociti T nel tempo in relazione all'intervento e potrebbero essere facilmente ulteriormente sviluppati per valutare gli stati di attivazione di specifici sottoinsiemi di cellule T di interesse.
L'estrazione del tessuto calcificato, l'isolamento dei leucociti dal tessuto calcificato e in particolare l'uso della citometria a flusso su questo tipo di tessuto possono essere impegnativi, a causa di problemi come l'autofluorescenza. Esistono poche pubblicazioni con protocolli per questo scopo specifico16,17,18. Qui presentiamo un protocollo progettato specificamente per l'isolamento diretto e la coltura di linfociti T da campioni di valvola aortica umana. L'espansione clonale dei linfociti è un segno distintivo dell'immunità adattativa. Lo studio di questo processo in vitro fornisce informazioni approfondite sul livello di eterogeneità dei linfociti19. Dopo un periodo di incubazione di tre settimane, i cloni di cellule T sono pronti per essere espiantati, in quanto è stata ottenuta una quantità adeguata di cellule T da ciascun clone, in modo da consentire lo studio fenotipico e funzionale. Successivamente il fenotipo dei cloni T viene studiato mediante citofluorometria.
Questo protocollo immunologico è un adattamento di un metodo precedentemente sviluppato da Amedei et al. per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule T da tessuto umano, appositamente progettato per il tessuto umano calcificato, come in CAVD20,21,22. Il protocollo qui per l'isolamento delle PBMC (cellule mononucleate del sangue periferico) utilizzando il buffy coat irradiato descrive un modo efficace per ottenere cellule feeder (FC), specificamente regolate per la fase di clonazione dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari. Lo strato di alimentazione è costituito da cellule arrestate dalla crescita, che sono ancora vitali e bioattive. Il ruolo delle cellule feeder è importante per supportare la sopravvivenza in vitro e la crescita dei linfociti T isolati dalle cellule interstiziali valvolari23. Al fine di evitare la proliferazione delle cellule di alimentazione in coltura, queste cellule devono subire un arresto della crescita. Ciò può essere ottenuto in due modi: attraverso metodi fisici come l'irradiazione o attraverso il trattamento con sostanze chimiche citotossiche, come la mitomicina C (MMC), un antibiotico antitumorale che può essere applicato direttamente sulla superficie di coltura24. Qui mostriamo l'arresto della crescita delle cellule di alimentazione ottenuto attraverso l'irradiazione cellulare.
Questo metodo presenta un modo efficiente ed economico per isolare e caratterizzare le cellule T dal tessuto valvolare aortico, contribuendo ad ampliare lo spettro dei metodi immunologici per esplorare la fisiopatologia CAVD.
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Protocol
Lo studio è stato condotto secondo lo Statuto della Charité for Ensuring Good Scientific Practice e sono state rispettate le linee guida e le disposizioni legali in materia di privacy ed etica. Il Comitato Etico ha approvato tutti gli esperimenti umani e la privacy e l'anonimato dei pazienti sono stati mantenuti in conformità con le regole riportate sul Modulo Etico.
NOTA: Per il protocollo descritto di seguito sono stati utilizzati campioni di valvola stenotica umana fresca.
1. Preparazione del reagente
- Preparare il mezzo completo RPMI arricchito aggiungendo in RPMI 1640 Medium: Aminoacidi non essenziali; Piruvato di sodio, L- Glutammina, ß-Mercaptoetanolo e Penicillina-Streptomicina (Pen/Strep). Filtrarlo prima dell'uso. Conservare a +4 °C e utilizzare entro due mesi.
- Preparare il terreno di coltura cellulare (CCM) per la fase di clonazione utilizzando il mezzo completo arricchito RPMI 1640 con conseguente siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS), mezzo basale HB, 50 U di interleuchina 2 (IL-2) e siero umano (HS). Filtra e usalo entro il giorno. Non conservare.
- Preparare il terreno di coltura cellulare per la fase di rialimentazione utilizzando il mezzo completo ARRICCHITO RPMI 1640 con FBS aggiunto, mezzo basale HB, 30 U di IL-2 e HS. Filtra e usalo entro il giorno. Non conservare.
- Preparare il tampone di lavaggio contenente 250 mL di RPMI e 5 mL di Penna/Strep. Conservare a +4 °C, utilizzare entro due mesi.
2. Isolamento dei linfociti T umani e coltura in palloni T-25
- Posizionare il campione della valvola stenotica in una capsula di Petri sterile riempita con tampone di lavaggio, assicurandosi che l'intero campione della valvola sia coperto con esso. Lasciare riposare per 15 minuti.
- Tagliare la valvola stenotica in piccoli pezzi usando un bisturi e lasciarla riposare di nuovo per 10 minuti.
- Preparare il terreno di coltura cellulare con 50 U di IL-2, come descritto in precedenza, e filtrarlo.
- Aggiungere il CCM all'interno dei palloni T25 e, utilizzando una pinza sterile in plastica, posizionare i pezzi della valvola all'interno dei palloni.
- Conservare i palloni in posizione verticale all'interno di un incubatore a CO2 per una settimana, avendo cura di osservare lo stato del pallone al microscopio. I cloni di cellule T dovrebbero essere visibili circa tre giorni dopo la fase di coltura; per una migliore osservazione è consigliabile posizionare i palloni in posizione orizzontale per 20 minuti prima dell'analisi microscopica.
NOTA: La quantità di terreno di coltura cellulare dipende dalla quantità di campione presente e dal numero di palloni T25 che verranno utilizzati. Considerando che ogni pezzo di valvola richiede 10 mL di CCM all'interno di un pallone, 25 mL di CCM in un pallone T25 sono appropriati per 3 pezzi di valvola.
3. Fase di clonazione
NOTA: Per la fase di clonazione delle cellule T, è necessario iniziare con l'isolamento delle cellule feeder da un buffy coat (BC) irradiato, seguendo il protocollo PBMC.
- Aprire la sacca BC sotto il cappuccio a flusso laminare utilizzando la punta del sacchetto con valvola priva di ago e trasferire 50 ml di sangue in un pallone T150. Aggiungere 70 ml di PBS per diluire il sangue all'interno del pallone.
- Prendi quattro tubi conici da 50 mL e posiziona 20 mL di gradiente di densità in ciascuno e sovrapponi con attenzione 30 mL di sangue.
- Centrifugare per 25 min a 800 x g e 20 °C con il freno spento.
- Aspirare accuratamente il surnatante e scartarlo come rifiuto. Raccogliere l'anello PBMC in un nuovo tubo conico da 50 ml aggiungendo all'interno della soluzione PBS fino a un volume di 50 ml.
- Centrifuga per 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Scartare il surnatante e sospendere il pellet aggiungendo all'interno della soluzione PBS fino ad un volume di 50 ml. Ripetere la fase di centrifugazione per 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Scartare il surnatante e sospendere i FC in 10 ml di terreno di coltura cellulare.
- Prendere un nuovo tubo di raccolta e diluire i FC con PBS 1:10 aggiungendo all'interno 9,9 mL di PBS e 100 μL dal tubo con FC e terreno di coltura cellulare. Risciacquare bene con una pipetta e prendere 7 μL da questa diluizione e contare le cellule al microscopio.
- Preparare il terreno di coltura cellulare per la fase di clonazione: 70 mL con 50 U di IL-2, quindi dividerlo in due tubi conici da 50 mL, ogni tubo conterrà 25 mL di terreno di coltura cellulare, come descritto di seguito:
- Tubo 1: 25 mL di CCM + FC + 0,6% di fitoemoagglutinina (PHA)
- Tubo 2: 25 ml di linfociti CCM + T
NOTA: Lo scopo del metodo PMBC è quello di ottenere 2 x 106 celle per ogni mL, quindi i 25 mL di CCM preparati (Tubo 1) devono essere calcolati di conseguenza. La formula generale utilizzata è: Numero di celle contate x 106: 1 mL = CCM x 106: X
4. Coltura di linfociti T in piastre multiwell
- Utilizzando la pipetta elettronica, raccogliere tutto il terreno di coltura cellulare all'interno dei palloni e trasferirlo in un tubo conico da 50 ml. Le fiasche vuote possono essere gettate via.
- Pellet le celle per centrifugazione per 10 min a 400 x g e 20 °C.
- Scartare il surnatante, sospendere il pellet in 50 ml di PBS e raccogliere le cellule mediante centrifugazione per 10 minuti a 400 x g e 20 °C. Ripetere questo passaggio due volte.
- Scartare il surnatante e sospendere il pellet in 1 mL di CCM. Prendi 7 μL da questa diluizione e conta le cellule al microscopio.
NOTA: Il numero di celle contate deve essere moltiplicato per il volume della camera e per la diluizione applicata. - Procedere alla diluizione delle cellule contate da 105 a 103 nel terreno di coltura cellulare e poi prendere 500 μL da 103 e metterlo all'interno del Tubo 2.
- Versare il terreno di coltura cellulare da 25 ml del tubo 1 all'interno di una capsula di Petri di plastica da 100 mm x 15 mm.
- Prendi quattro piastre multiwell inferiori a 96 U e usa una pipetta multicanale impostata su FC di semi da 100 μL in ciascun pozzetto.
- Prendere il tubo 2 e versare il terreno di coltura cellulare all'interno di una capsula di Petri. Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 100 μL, seminare cellule T in ogni pozzetto.
- Conservare le piastre multiwell all'interno di un incubatore a CO2 per una settimana.
5. Prima fase di rialimentazione
- Utilizzando un sacchetto di buffy coat irradiato, seguire il metodo PBMC per ottenere FC come descritto nel metodo precedente.
- Preparare la quantità adeguata di CCM senza PHA e filtrarla.
- Utilizzando una pipetta multicanale, rimuovere 100 μL da ciascun pozzetto, assicurandosi di non toccare il fondo del pozzo.
- Aggiungere 100 μL di FC in tutti i pozzetti come strato di alimentazione per fornire nutrienti di coltura cellulare e cambiare il mezzo.
NOTA: Per ogni multiwell si consiglia di considerare 6 mL di CCM, quindi la quantità consigliata per 4 multiwell è di circa 30 mL. Pha (0,4% della quantità totale di CCM) deve essere aggiunto al CCM una volta ogni due settimane.
6. Seconda fase di rialimentazione
- Ripetere la fase di rialimentazione seguendo il passaggio sopra descritto. Lo 0,4% di PHA deve essere aggiunto al terreno di coltura cellulare.
7. Prima fase di scissione da 1 pozzo/campione a 2 pozzetti/campione
- Controlla tutti e quattro i multiwell al microscopio e vai avanti dividendo quei pozzetti con cloni di cellule T (TCC).
- Seguire il protocollo PBMC per isolare le cellule di alimentazione da un sacchetto di buffy coat irradiato.
- Preparare il terreno di coltura cellulare con 30 U di IL-2. Aggiungi i FC e prendi una nuova piastra multiwell a 96 pozzetti con fondo a U.
- Utilizzando una pipetta impostata a 100 μL, risciacquare bene all'interno dei pozzetti dei campioni selezionati e dividere i 200 μL di volume contenuti in ciascun pozzetto in 2 nuovi pozzetti della nuova piastra multiwell, in modo da avere 100 μL di volume per ciascuno dei nuovi 2 pozzi.
- Aggiungere 100 μL di FC all'interno di tutti i nuovi pozzi. Ogni pozzo deve contenere un volume totale di 200 μL.
- Impostare la pipetta a 100 μL e aggiungere 100 μL in altri due pozzetti, contenenti solo FC per fungere da controllo.
NOTA: utilizzare la microscopia ottica per osservare tutte le piastre multiwell al fine di determinare quali pozzi hanno coltivato con successo TCC. Per facilitare la selezione dei cloni, è possibile effettuare un confronto con il controllo (i due pozzetti contenenti solo FC), con il clone che appare più scuro e più grande rispetto al controllo. I pozzetti da selezionare sono quelli con un clone grande, chiaro, rotondo, con linfociti densamente impacchettati insieme. Se non sono presenti CRC dopo due settimane di rialimentazione, si consiglia di attendere un'altra settimana ed eseguire un'ulteriore fase di rialimentazione.
8. Seconda fase di scissione da 2 pozzi/campione a 4 pozzetti/campione
- Impostare la pipetta a 100 μL, risciacquare bene all'interno dei due pozzetti di ciascun campione e seminare due nuovi pozzetti da 100 μL per ciascuno.
- Preparare il terreno di coltura cellulare con 30 U di IL-2 e seguire la tecnica PBMC per estrarre i FC dalla sacca del buffy coat e posizionare i FC all'interno del CCM.
- Impostare la pipetta a 100 μL e seminare i FC in tutti i pozzetti. Conservare i pozzetti multipli in un incubatore a CO2 per una settimana.
9. Terza fase di scissione da 4 pozzi/campione a 8 pozzetti/campione:
- Utilizzando una pipetta multicanale impostata su 100 μL, sciacquare bene all'interno di tutti e quattro i pozzetti di ciascun campione e seminare 100 μL in ciascuno dei quattro nuovi pozzetti in una nuova piastra a 96 pozzetti.
- Preparare il terreno di coltura cellulare e seguire la tecnica PBMC per estrarre i FC da un sacchetto di buffy coat irradiato.
- Posizionare i FC all'interno del CCM. Impostare la pipetta a 100 μL e seminare i FC in tutti i pozzetti. Conservare i pozzetti multipli in un incubatore a CO2 per una settimana
10. Analisi citofluorimetrica
- Prelevare la piastra multiwell con la data più vecchia dall'incubatore a CO2 e identificare le provette di raccolta con i numeri di campione da analizzare.
- Utilizzando una pipetta multicanale impostata a 200 μL con 2 punte, risciacquare accuratamente all'interno di due pozzetti dello stesso campione e metterli entrambi all'interno dello stesso tubo di raccolta. Ripetere questo passaggio per tutti gli esempi.
NOTA: i campioni di FC non verranno analizzati, in quanto fungono solo da controlli.
11. Preparazione del pannello di colorazione degli anticorpi per l'analisi citofluorimetrica
- Aggiungere 1 mL di soluzione PBS per ogni tubo e centrifuga per 10 minuti a 400 x g e 20 °C.
- Dopo la fase di centrifugazione scartare il surnatante.
NOTA: Il pannello di colorazione degli anticorpi è disponibile nella Tabella 1. Ogni singola concentrazione anticorpale calcolata è di circa 2 μL/campione. Si raccomanda di ruotare brevemente i tubi anticorpali prima dell'uso. Per proteggere gli anticorpi coniugati con fluoroforo dalla luce, tutti i passaggi devono essere eseguiti al buio. - Preparare la miscela di anticorpi all'interno di un tubo da 1,5 ml e vorticarla.
- Aggiungere gli anticorpi all'interno dei campioni e lasciare che i campioni incubano al buio a temperatura ambiente per 15 minuti.
- Aggiungere 1 mL di PBS in ogni campione e centrifugare per 10 minuti a 400 x g e 20 °C.
- Scartare il surnatante e sospendere il pellet con 500 μL di soluzione PBS.
- Procedere con l'analisi citofluorimetrica (analisi FACS, Tabella 1).
NOTA: I campioni colorati possono essere riparati utilizzando paraformaldeide (PFA) allo 0,5% diluita in soluzione PBS e analizzati fino a 15 giorni dopo.
ATTENZIONE: il PFA è tossico e deve essere maneggiato con attenzione.
| Marcatore | Fluoroforo |
| CD3 · | PE/Cy7 |
| CD4 · | Alexa Fluor 488 · |
| CD8 · | Viola brillante 510 |
| CD14 · | Viola brillante 421 |
| CD25 · | PE |
| CD45 · | Viola brillante 711 |
Tabella 1. Pannello di colorazione degli anticorpi per rilevare la popolazione di linfociti T nella malattia della valvola aortica di calcificazione.
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Representative Results
Abbiamo utilizzato un metodo semplice ed economico per caratterizzare la popolazione leucocitaria di campioni di valvole aortiche fresche derivate da pazienti umani con stenosi della valvola aortica grave (fare riferimento al protocollo). Il metodo per isolare le PBMC è un passo fondamentale per ottenere cellule feeder, che vengono utilizzate in ogni fase dell'esperimento (fasi di clonazione, rialimentazione e scissione) e consentono il rilevamento e la caratterizzazione dei leucociti infiltrati nei campioni di valvola aortica. I passaggi chiave di questo metodo sono illustrati nella Figura 1.
Figura 1. Isolamento delle FC dal cappotto buffy. (A) Sangue stratificato su mezzo gradiente di densità (B) Anello dei globuli bianchi ottenuto dopo centrifugazione (C) Globuli bianchi raccolti e risospesi in soluzione PBS (D) Globuli bianchi osservati al microscopio ottico Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dopo due settimane di incubazione, abbiamo clonato e fatto crescere con successo una popolazione di cellule T, come mostrato nella Figura 2.
Figura 2. Clone di cellule T dopo due settimane di incubazione osservate al microscopio ottico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
La Figura 3 illustra lo schema di gating utilizzato per l'analisi delle sottopopolazioni di cellule T in pazienti con CAVD. Come mostrato dal risultato dell'analisi FACS, ci sono più cellule T CD4 + (43,032%) rispetto alle cellule T CD8 + (1,079%).
Figura 3. Schema di gating utilizzato per l'analisi della sottopopolazione di cellule T. (A) È stato applicato un gate per identificare la specifica popolazione di cellule T in una valvola stenotica. (B) Linfociti CD14 negativi e linfociti CD3 positivi. (C) I linfociti CD3 sono controllati per distinguere le cellule T CD4+ dalle cellule T CD8+. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Per dimostrare che gli stessi marcatori di cellule T sono presenti sia in campioni di valvole native che in campioni clonati, abbiamo eseguito l'analisi FACS senza la fase di clonazione, come illustrato nella Figura 4.
Figura 4. Risultati dell'analisi FACS di due campioni di valvole. Abbiamo confrontato le cellule T ottenute da un campione di valvola nativa e un campione clonato, convalidando che le cellule T trovate nella valvola nativa condividono marcatori specifici delle cellule T nel prodotto clonato finale. (A) Risultati FACS di un campione di valvola nativo, senza la fase di clonazione. B) risultati FACS del campione di valvola analizzato dopo la fase di clonazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L'intero flusso di lavoro è riassunto in Figura 5, partendo dalla dissezione della valvola aortica umana e arrivando fino all'analisi FACS. Tutti i passaggi sono necessari per l'analisi di un campione di valvola aortica. La fase 1 mostra l'isolamento dei linfociti dal tessuto della valvola aortica stenotica. I campioni della valvola devono essere tagliati e collocati in una capsula di Petri riempita con tampone di lavaggio. I pezzi della valvola possono essere collocati all'interno di un pallone T25 riempito con CCM e conservati in un incubatore a CO2 per una settimana. La fase 2 mostra la fase di clonazione, che consiste di due parti: 1) isolamento di FC da sacchetto di buffy coat irradiato e 2) fase di clonazione delle cellule T e culmina con la coltura cellulare in una piastra multiwell a 96 pozzetti, che viene immagazzinata in un incubatore a CO2 per una settimana. Le fasi 3 e 4 consistono nella fase di rialimentazione utilizzando FC da buffy coat irradiato; questa fase deve essere ripetuta per due settimane consecutive. Le fasi 4, 5 e 6 mostrano la fase di scissione dei cloni di cellule T; la prima fase di scissione va da 1 pozzo/campione a due pozzetti per ogni campione in una nuova piastra multiwell; la seconda divisione è da 2 pozzetti/campione a 4 pozzetti per ciascuno nella stessa piastra multiwell; la terza e ultima fase di scissione va da 4 pozzetti/campione a 8 in una nuova piastra multiwell. La fase 7 è la fase finale, in cui i campioni vengono analizzati utilizzando l'analisi FACS.
Figura 5. Flusso di lavoro sperimentale CAVD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Dai risultati preliminari (Figura 2) possiamo concludere che i linfociti, insieme ai leucociti CD45+ sono presenti nelle valvole aortiche calcificate, indicando così che la malattia della valvola aortica calcifica è legata all'attivazione del sistema immunitario e all'attività infiammatoria.
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Discussion
Qui presentiamo un metodo per caratterizzare le sottopopolazioni di linfociti T isolate da campioni di valvola aortica stenotica, utilizzando la citometria a flusso. Questo metodo richiede l'uso di buffy coat irradiato per isolare i PBMC. La frequenza di radiazione a cui devono essere sottoposte le borse buffy coat è di 9000 Rad/90 Gray (Gy) e rappresenta un passo cruciale per arrestare la proliferazione delle cellule di alimentazione. Il ruolo delle cellule isolate dai sacchetti di buffy coat è quello di agire solo come cellule di alimentazione e fornire nutrienti per le cellule T isolate dalle valvole. L'uso di una borsa buffy coat non generalizzata promuoverebbe la proliferazione di PBMC in coltura, come è stato notato in passato25. Una frequenza di radiazione inferiore a 90 Gy ha mostrato la proliferazione delle PBMC in coltura, quindi si consiglia di utilizzare esattamente 90 Gy di radiazioni. Da notare, è consigliabile utilizzare il buffy coat irradiato lo stesso giorno o al massimo il giorno successivo, tenendolo su un dispositivo che lo mantenga in costante agitazione. Un altro passaggio cruciale di questo metodo potrebbe essere rappresentato dalla fase di clonazione dei linfociti, che potrebbe essere influenzata da artefatti; per evitare questo evento eseguiamo il FACS su campioni di valvola aortica freschi. La fase di clonazione dei linfociti T ha il vantaggio di ottenere un numero maggiore di cloni T (una media di 15 cloni di cellule T per ogni valvola) da analizzare fenotipicamente e funzionalmente, rispetto al numero ottenuto dall'analisi di un campione fresco. La tecnica di clonazione è stata utilizzata da questo gruppo di ricerca per molti anni e a seconda del tipo di tessuto analizzato, il profilo linfocitario era diverso21,26,27. Il primo passaggio del metodo riguarda l'isolamento delle cellule T da una valvola aortica stenotica. Tutti i passaggi descritti devono essere eseguiti sotto una cappa a flusso laminare in condizioni sterili ed è fortemente raccomandato disinfettare tutti i materiali prima dell'uso. Il tempo necessario per ottenere i risultati è stato di 6 settimane e la media delle cellule dei linfociti T ottenute dalla fase di clonazione è stata di 20 x 106 cellule. La fase di monitoraggio delle piastre multiwell è molto importante e non deve essere trascurata. Un cambiamento nel colore del mezzo in giallo potrebbe rappresentare una contaminazione batterica, nel qual caso tutti gli strumenti utilizzati devono essere sterilizzati e le piastre multiwell gettate via.
Prima dell'analisi FACS è importante stabilire un gate adatto, per verificare che non vi sia alcuna sovrapposizione specifica tra i canali anticorpali. Ciò consente la separazione ottimale tra porte positive e negative. Si raccomanda l'uso degli stessi lotti di anticorpi per tutti i campioni coinvolti nello studio per ottenere un risultato omogeneo. È inoltre necessario proteggere gli anticorpi coniugati con fluoroforo dalla luce, eseguendo tutti i passaggi con la luce spenta.
Questo metodo è efficace nel produrre risultati con elevata riproducibilità e non è costoso. Una limitazione di questo metodo è la piccola dimensione del campione, a causa della limitata disponibilità dei campioni di valvole umane, nonché della mancanza di un gruppo di controllo.
I risultati preliminari supportano il ruolo dell'immunità adattativa come elemento cruciale nello sviluppo e nella progressione della malattia della valvola aortica calcifica. Tutti i pazienti arruolati in questo studio hanno avuto una diagnosi di stenosi aortica calcifica sintomatica grave, con un'età media di 70 anni, per lo più maschi. L'esistenza di popolazioni di cellule T nelle valvole aortiche analizzate fornisce prove dell'attività infiammatoria della valvola aortica malata come checkpoint di attivazione delle cellule immunitarie. Un punto di interesse futuro potrebbe essere quello di analizzare la funzionalità delle cellule T infiltranti CAVD e caratterizzare la specificità delle cellule T come precedentemente riportato in malattie simili, come nell'aterosclerosi28,29,30.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Tutti i sacchetti di buffy coat utilizzati per questo protocollo sono stati irradiati grazie alla disponibilità del Dr. Peter Rosenthal, del Dr. Dirk Böhmer e di tutto il team del Dipartimento di Radiologia di Charité Benjamin Franklin. Borsista / Mary Roxana Christopher, questo lavoro è supportato da una borsa di studio della German Cardiac Society (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
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