Summary
本研究では、石灰化大動脈弁の新鮮なサンプルからのTリンパ球分離のプロセスと、フローサイトメトリー分析を用いた適応性白血球サブセットの特性評価のためのT細胞クローニングの分析ステップについて述べた。
Abstract
カルシフィック大動脈弁疾患(CAVD)は、弁の軽度の肥厚から重度の石灰化に至るまでの活動的な疾患プロセスであり、経カテーテル大動脈弁置換術(TAVR)のような新しい治療オプションにもかかわらず、高い死亡率に関連している。
バルブ石灰化から始まり、重度の大動脈狭窄につながる完全な経路は、部分的にしか理解されていない。生体内で大動脈弁細胞を密接に表現することで、ステノスティック弁組織からのTリンパ球のアッシングは、石灰化の発展におけるその役割を明確にする効率的な方法となる可能性がある。外科的切除後、新鮮な大動脈弁サンプルを小片で解剖し、Tリンパ球を培養し、クローン化し、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて分析する。
染色手順は簡単で、染色チューブも0.5%のパラホルムアルデヒドを使用して固定し、15日後まで分析することができます。染色パネルから生成された結果は、介入に関連して時間の経過とともにT細胞濃度の変化を追跡するために使用することができ、関心のある特定のT細胞サブタイプの活性化状態を評価するために容易に開発することができる。本研究では、新鮮な石灰化大動脈弁サンプルに対して行われるT細胞の単離と、CAVD病態生理学における適応免疫の役割をさらに理解するために、フローサイトメトリーを用いてT細胞クローンを分析するステップを示す。
Introduction
カルシフィック大動脈弁疾患(CAVD)は、医療に大きな影響を与える最も一般的な心臓弁障害の1つです。ここ数年の大動脈弁置換の頻度は劇的に増加しており、高齢者人口の増加によりさらに増加すると予想される1。
CAVDの基礎となる病態生理学は部分的にしか知られておらず、現在の治療戦略は外科的または経皮的処置を通じて、保守的な措置または大動脈弁置換に限定されている。現在までに、効果的な治療は、大動脈弁置換(AVR)が行われない限り、CAVD進行を妨げたり逆転させたりすることはなく、早期の症状発症に関連する高い死亡率は2である。重度の症候性大動脈狭窄症の患者では、3年間の症状のない生存率は20%3と報告された。経カテーテル大動脈弁置換術(TAVR)は、特に高齢者の間でリスクの高い患者の治療に革命を起こし、この人口で本質的に高かった死亡率を劇的に減少させた新しい選択肢を表す4,5,6。TAVRの有望な結果にもかかわらず、CAVD病態生理学を理解して新たな早期治療目標を同定するためには、さらなる研究が必要である7,8,9.
以前は受動的で変性プロセスであると考えられていたCAVDは、現在、大動脈弁間質細胞10の骨芽細胞表現型スイッチによって特徴付けられる活性進行性疾患として認識されている。この疾患は、進行性の塩分化、線維性変化および大動脈弁リーフレット(硬化症)の運動性の低下を伴い、最終的には大動脈弁開口部11の狭窄(狭窄)につながる血流を妨げる。
炎症は、血管アテローム性動脈硬化症のプロセスと同様に、CAVD病態生理学における重要なプロセスと考えられている。内皮損傷は、脂質種の沈着および蓄積、特に大動脈弁12における酸化リポタンパク質を可能にする。これらの酸化リポタンパク質は、細胞毒性を持ち、炎症性活性が鉱化につながるため、炎症反応を引き起こす。CAVDの発症および疾患進行における先天性免疫および適応免疫の役割が最近強調されている13.メモリT細胞の特定のサブセットの活性化およびクローン拡張は、CAVDおよびミネラル化大動脈弁リーフレットを有する患者において文書化されており、炎症プロセスは少なくともCAVDの発症およびおそらく同様に疾患進行に関与すると仮定される。実際、抗原提示細胞とマクロファージは健康で病気の弁の両方に存在するが、Tリンパ球の存在は、老化し、病気の大動脈弁を示す。このリンパ球浸潤は、新血管新生および転移の増加とともに、CAVD15の特徴的な組織学的徴候である。
大動脈弁間質細胞と免疫系の活性化との相互作用の存在を仮説し、大動脈弁における慢性炎症プロセスの開始を引き起こす可能性がある。ステノスティック大動脈弁組織からのT細胞のアッシングは、生体内の大動脈弁細胞の密接な表現を提供することができるので、石灰化の発達におけるその役割を明確にする効率的な方法である可能性がある。本研究では、大動脈弁組織を用いて、Tリンパ球を単離し、培養し、それらをクローン化し、その後蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いてそれらを特徴付ける。新鮮な大動脈弁サンプルは、重度の大動脈狭窄症の外科的弁置換術を受けたCAVD患者から切除された。外科的切除後、新鮮な弁サンプルを小片で解剖し、T細胞を培養し、その後、フローサイトメトリーを用いて分析した。染色手順は簡単で、染色チューブはパラホルムアルデヒドの0.5%を使用して固定し、15日後まで分析することができます。染色パネルから生成されたデータは、介入に関連して時間の経過とともにTリンパ球分布の変化を追跡するために使用することができ、関心のある特定のT細胞サブセットの活性化状態を評価するために容易に開発することができる。
石灰化組織の抽出、石灰化組織からの白血球の単離、特にこのタイプの組織に対するフローサイトメトリーの使用は、自己蛍光などの問題のために困難であり得る。この特定の目的のためのプロトコルを持つ出版物はほとんど存在しません16,17,18。本明細書では、ヒト大動脈弁試料からのTリンパ球の直接単離および培養のために特別に設計されたプロトコルを提示する。リンパ球のクローン拡張は、適応免疫の特徴である。このプロセスをインビトロで研究することは、リンパ球異遺伝子性19のレベルに関する洞察に満ちた情報を提供する。3週間のインキュベーション期間の後、T細胞クローンは、各クローンから十分な量のT細胞が得られたように、表現型および機能的研究を可能にするように、剥離する準備ができている。続いてTクローンの表現型をサイトフルオロメトリーで研究する。
この免疫学的プロトコルは、ヒト組織からのT細胞の単離および特徴付けのためにAmedeiらによって以前に開発された方法の適応であり、特にCAVD20、21,22のような石灰化ヒト組織のために設計されている。照射されたバフィーコートを用いたPBMC(末梢血単核細胞)の単離のためのプロトコルは、弁間質細胞から分離されたTリンパ球のクローニング段階に特異的に調整されたフィーダー細胞(FC)を得る有効な方法を説明する。フィーダー層は、増殖で構成され、未だに生存可能で生理活性である。フィーダー細胞の役割は、弁間質細胞23から分離されたTリンパ球のインビトロ生存および増殖を支えるために重要である。培養中のフィーダー細胞増殖を避けるために、これらの細胞は増殖停止を受けなければならない。これは、照射などの物理的方法を通じて、または細胞毒性化学物質(例えば、マイトマイシンC(MMC)、培養表面24に直接適用することができる抗腫瘍性抗生物質による治療を通じて、2つの方法で達成することができる。ここでは、細胞照射を通じて達成されたフィーダー細胞増殖停止を示す。
この方法は、大動脈弁組織からT細胞を分離し、特徴付ける効率的で費用対効果の高い方法を提示し、CAVD病態生理学を探索するための免疫学的方法のスペクトルを広げることに寄与する。
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Protocol
この研究は、良い科学的実践を保証するための慈善団体の法令に従って行われ、プライバシーと倫理に関する法的ガイドラインと規定が尊重されました。倫理委員会は、すべての人間の実験を承認し、患者のプライバシーと匿名性は、倫理フォームに報告された規則に従って維持されました。
注:以下に説明するプロトコルについては、新鮮なヒトステノティックバルブサンプルが使用されました。
1. 試薬の準備
- RPMI 1640培地に添加することにより濃縮されたRPMI完全培地を調製:非必須アミノ酸;ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、ß-メルカプトエタノールおよびペニシリンストレプトマイシン(ペン/ストレップ)。使用前にフィルター処理します。+4 °Cで保管し、2ヶ月以内に使用してください。
- 濃縮されたRPMI 1640完全培地を加えた濃縮されたRPMIを使用してクローニング段階の細胞培養培地(CCM)を調製し、熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、HB基底培地、インターロイキン2(IL-2)の50 U(IL-2)およびヒト血清(HS)を添加した。フィルターを適用し、その日の中でそれを使用します。保存しないでください。
- 濃縮されたRPMI 1640完全培地を加えたFBS、HB基底培地、IL-2およびHSの30 Uを用いて再送出段階の細胞培地を調製する。フィルターを適用し、その日の中でそれを使用します。保存しないでください。
- 250 mLのRPMIと5 mLペン/ストレップを含む洗浄バッファーを準備します。+4 °Cで保管し、2ヶ月以内に使用してください。
2. ヒトTリンパ球の分離とT-25フラスコへの培養
- ステノスティックバルブサンプルをウォッシュバッファで満たされた滅菌ペトリ皿に入れ、バルブサンプル全体が覆われていることを確認します。15分間放置します。
- メスを使って小さく切り、もう一度10分間放置します。
- IL-2の50Uで細胞培養培地を調製し、前述のように、それを濾過する。
- T25フラスコの中にCCMを追加し、無菌プラスチックペンイヤーを使用して、フラスコの中にバルブピースを置きます。
- フラスコは、顕微鏡下でフラスコの状態を観察するように注意して、CO2 インキュベーター内の垂直方向の位置に1週間保管します。T細胞クローンは、培養ステップの約3日後に可視にする必要があります。より良い観察のために顕微鏡分析の前に20分の水平位置にフラスコを置くことをお勧めします。
注:細胞培養培地の量は、サンプルの存在量と使用されるT25フラスコの数によって異なります。各バルブはフラスコ内に10mLのCCMを必要とすることを考慮すると、T25フラスコ内のCCMの25 mLは、3個のバルブに適しています。
3. クローニングフェーズ
注: T 細胞のクローニングフェーズでは、PBMCs プロトコルに従って、照射されたバフィー コート (BC) からのフィーダー セルの分離から始める必要があります。
- 針のないバルブで袋のスパイクを使用して層流フードの下にBCバッグを開き、T150フラスコで50 mLの血液を移動させます。70mLのPBSを加えると、フラスコ内部の血液を希釈します。
- 4つの50 mL円錐形のチューブを取り、それぞれに20 mLの密度勾配媒体を入れ、慎重に30mLの血液をその上に重ねていきます。
- 800 x g で 25 分間の遠心分離機、ブレーキをオフにして 20 °C。
- 上清を慎重に吸引し、廃棄物として廃棄する。50mlの体積までPBS溶液の内部に加える新しい50ml円錐管のPBMCリングを集める。
- 遠心分離機は400xg及び20°Cで10分間
- 上清を捨て、PBS溶液内部に50mLの体積まで添加してペレットを一時停止します。400xgおよび20°Cで10分間遠心分離フェーズを繰り返します。
- 上清を捨て、10mLの細胞培養培地でFCを一時停止する。
- 新しい回収管を取り、PBS 1:10で、9.9mLのPBSの内部に加え、FCと細胞培養培地でチューブから100 μLを加えて、FCを希釈します。ピペットでよくすすいで、この希釈から7μLを取り、顕微鏡下の細胞を数えます。
- クローニングフェーズの細胞培養培地を準備する:IL-2の50 Uで70mL、そしてそれを2つの50 mL円錐形チューブに分割すると、各チューブは、以下に説明されるように、細胞培養培地の25 mLを含む。
- チューブ1:CCM+ FCの25 mL + 0.6% フィトヘマグルチニン(PHA)
- チューブ2:CCM+ Tリンパ球の25 mL
注: PMBC法の目的は、mLごとに2 x 106 個のセルを得るため、25 mLのCCMを調製(チューブ1)に応じて計算する必要があります。使用される一般的な式は、カウントされたセルの数 x 106:1 mL = CCM x 106: X
4. T マルチウェルプレートにおけるリンパ球培養
- 電子ピペットを使用して、フラスコ内のすべての細胞培養培地を収集し、50 mL円錐管に移します。空のフラスコは捨てることができます。
- ペレット細胞は、400xg及び20°Cで10分間遠心分離して細胞をペレット化した。
- 上清を捨て、PBSの50mLにペレットを懸濁し、400xg及び20°Cで10分間遠心分離して細胞を採取する。 この手順を 2 回繰り返します。
- 上清を捨て、CCMの1mLでペレットを一時停止します。この希釈から7μLを取り、顕微鏡下で細胞を数えます。
注: チャンバの容積と希釈を掛けるために、カウントされたセルの数を乗算する必要があります。 - 細胞培養培地で105 から103 まで数えた細胞を希釈し、103 から500μLを取り、チューブ2の内部に入れます。
- チューブ1の25mL細胞培養培地を100mm x 15mmプラスチックペトリ皿の中に注ぎます。
- 4つの96-U底マルチウェルプレートを取り、各ウェルに100 μLシードFCに設定されたマルチチャンネルピペットを使用します。
- チューブ2を取り、ペトリ皿の中に細胞培養培地を注ぎます。100 μLに設定したマルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルにT細胞をシードします。
- マルチウェルプレートをCO2 インキュベーター内に1週間保管します。
5. 最初の再摂食段階
- 照射されたバフィーコートバッグを使用して、PBMc法に従って、前の方法で説明したようにFCsを取得する。
- PHAなしで適切な量のCCMを準備し、それをフィルタリングする。
- マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルから100 μLを取り出し、井戸の底部に触れないようにします。
- 細胞培養栄養素を提供し、培地を変更するために、すべてのウェルに100 μLのFCを摂食層として加えます。
注:各マルチウェルでは、CCMの6 mLを考慮することをお勧めしますので、4つのマルチウェルの推奨数量は約30 mLです。PHA (CCM の総量の 0.4%) を 2 週間に 1 回 CCM に追加する必要があります。
6. 第二再摂食段階
- 上記の節に従って再給餌フェーズを繰り返す。0.4% PHAを細胞培養培地に添加する必要があります。
7. 最初の分割フェーズ 1 ウェル/サンプルから 2 つのウェル/サンプルへ
- 顕微鏡下で4つのマルチウェルをすべてチェックし、T細胞クローン(TCC)でそれらの井戸を分割してください。
- PBMCs プロトコルに従って、照射されたバフィー コート バッグからフィーダー セルを分離します。
- IL-2の30Uで細胞培養培地を調製する。FCを追加し、U底の新しい96ウェルマルチウェルプレートを取ります。
- 100 μLに設定したピペットを使用して、選択したサンプルのウェル内をよくすすいで、各ウェルに含まれる200 μLの体積を新しいマルチウェルプレートの2つの新しいウェルウェルに分割し、新しい2つのウェルごとに100 μLの体積を持たせます。
- 新しいウェルの中に100 μLのFCを追加します。各ウェルには、合計容量200 μLが含まれている必要があります。
- ピペットを100 μLにセットし、コントロールとして機能するFCのみを含む2つのウェルに100 μLを追加します。
注:TCCが正常に成長した井戸を特定するために、すべてのマルチウェルプレートを観察するために光顕微鏡を使用してください。クローンの選択を容易にするために、コントロール(FCのみを含む2つのウェル)を比較し、クローンはコントロールと比較して暗く、より大きく見えます。選択されるウェルは、大きく、透明で丸いクローンを持ち、リンパ球が密に詰め込まれた井戸です。2週間の再摂食後にTCCが存在しない場合は、もう1週間待って追加の再給餌フェーズを行うことをお勧めします。
2ウェル/サンプルから4つのウェル/サンプルへの第2分割フェーズ
- ピペットを100 μLに設定し、各サンプルの2つのウェルの内側をよくすすいで、それぞれに100 μLの新しいウェルを2つ種付けます。
- IL-2の30 Uで細胞培養培地を調製し、PBMC技術に従って、バフィーコートバッグからFCを抽出し、CCMの内部にFCを配置します。
- ピペットを100 μLにセットし、すべてのウェルにFCをシードします。マルチウェルをCO2 インキュベーターに1週間保管します。
9. 4つのウェル/サンプルから8つの井戸/サンプルへの第3の分割フェーズ:
- 100 μL に設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルの 4 つのウェルの内側をよくすすいで、新しい 96 ウェル プレートの 4 つの新しいウェルのそれぞれに 100 μL をシードします。
- 細胞培養培地を調製し、PBMC技術に従って、照射されたバフィーコートバッグからFCを抽出します。
- CCM 内に FC を配置します。ピペットを100 μLにセットし、すべてのウェルにFCをシードします。CO2インキュベーターにマルチウェルを1週間保存
10. 細胞蛍光分析
- CO2インキュベーターから最も古い日付のマルチウェルプレートを取り、分析するサンプル番号を持つ回収管を特定します。
- 2つの先端と200 μLに設定されたマルチチャンネルピペットを使用して、同じサンプルの2つのウェルの内側を十分に洗い流し、両方を同じコレクションチューブの中に入れます。すべてのサンプルに対してこの手順を繰り返します。
注: これらのサンプルはコントロールとしてのみ機能するため、解析されません。
11. 細胞蛍光分析のための抗体染色パネルの準備
- 各チューブに1mLのPBS溶液を加え、遠心分離機を400xgおよび20°Cで10分間加えます。
- 遠心段階の後、上清を捨てる。
注: 抗体染色パネルは 、表1にあります。計算される各単一抗体濃度は約2μL/サンプルです。使用前に抗体チューブを短時間回転することをお勧めします。蛍光色素共役抗体を光から保護するために、すべてのステップは暗闇の中で行われるべきです。 - 1.5 mLチューブ内の抗体ミックスを調製し、それを渦に入れます。
- サンプル内に抗体を加え、試料を残して室温で15分間インキュベートします。
- 各サンプルにPBS 1 mLを加え、遠心分離機を400 x gと20 °Cで10分間加えます。
- 上清を捨て、500 μLのPBS溶液でペレットを一時停止します。
- 細胞蛍光分析を進めます(FACS分析、 表1)。
注:染色されたサンプルは、PBS溶液で希釈した0.5%パラホルムアルデヒド(PFA)を使用して固定し、15日後まで分析することができます。
注意: PFA は毒性があり、慎重に取り扱う必要があります。
| マーカー | フルオロフォア |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | アレクサ・フルオール 488 |
| CD8 | ブリリアントバイオレット510 |
| CD14 | ブリリアントバイオレット 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | ブリリアントバイオレット 711 |
表 1.石灰化大動脈弁疾患におけるTリンパ球集団を検出する抗体染色パネル。
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Representative Results
我々は、重度の大動脈弁狭窄症を有するヒト患者由来の新鮮な大動脈弁サンプルの白血球集団を特徴付けるために、簡便で費用対効果の高い方法を用いた(プロトコル参照)。PBMCsを単離する方法は、実験のあらゆる段階(クローニング、再給餌および分割段階)で使用されるフィーダー細胞を得る上で重要なステップであり、大動脈弁サンプル中の浸潤性白血球の検出と特性評価を可能にします。この方法の主要な手順を 図 1 に示します。
図 1.FCはバフィーコートから隔離します。(A)遠心分離後に得られた白血球環(C)PBS溶液で採取し再懸濁した白血球(D)光顕微鏡下で観察された白色細胞を(A)より大きなバージョンのこの図を見るには、ここをクリックしてください。
2週間のインキュベーションの後、図2に示すように、T細胞集団のクローン化と成長に 成功しました。
図 2.2週間のインキュベーション後のT細胞クローンは、光顕微鏡を用いて観察した。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3は、CAVD患者におけるT細胞亜集団の分析に利用される格言スキームを示す。FACS分析の結果から示すように、CD8+ T細胞(1.079%)よりも多くのCD4+ T細胞(43.032%)があります。
図 3.T細胞サブ人口解析に利用される格言スキーム。 (A) ゲートが適用され、ステナティックバルブ内の特定のT細胞集団を同定する。(B) CD14陰性リンパ球およびCD3陽性リンパ球。(C) CD3リンパ球は、CD8+ T細胞とCD4+ T細胞を区別するためにゲートされる。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ネイティブバルブサンプルとクローンサンプルの両方に同じT細胞マーカーが存在することを示すために、 図4に示すように、クローニングフェーズなしでFACS分析を行った。
図 4.2つのバルブサンプルのFACS分析結果。 ネイティブバルブサンプルとクローンサンプルから得られたT細胞を比較し、ネイティブバルブに見られるT細胞が最終クローン生成物のT細胞の特定マーカーを共有していることを検証した。(A) クローンフェーズを伴わないネイティブバルブサンプルのFACS結果。(B) クローニングフェーズ後に分析されたバルブサンプルのFACS結果。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ワークフロー全体を 図 5 にまとめ、人間の大動脈弁の解剖から始まり、FACS 解析に至ります。すべてのステップは、1つの大動脈弁サンプルの分析に必要です。第1相は、ステノスティック大動脈弁組織からのリンパ球単離を示す。バルブサンプルは、洗浄バッファーで満たされたペトリ皿にカットして配置する必要があります。バルブピースはCCMで満たされたT25フラスコの中に入れ、1週間CO2 インキュベーターに保管することができます。フェーズ2は、2つの部分で構成されるクローニングフェーズを示しています:1)1)ICは照射されたバフィーコートバッグからの単離と2)T細胞クローニング相と、CO2 インキュベーターに1週間保存される96ウェルマルチウェルプレートで細胞培養で最高潮に達します。フェーズ3と4は、照射されたバフィーコートからのFCを使用した再供給フェーズで構成されています。このフェーズは、2 週間連続して繰り返す必要があります。フェーズ 4、5、および 6 は、T 細胞クローンの分割フェーズを示します。最初の分割フェーズは、新しいマルチウェルプレートの各サンプルの1ウェル/サンプルから2つのウェルに、1個のウェル/サンプルから2つのウェルに、1つのウェル/サンプルから2つのウェルに、1つのサンプルの分割フェーズを行います。2 番目の分割は、同じマルチウェル プレート内の各ウェルに対して 2 つのウェル /sample から 4 つのウェルに分割されます。3番目と最後の分割フェーズは、新しいマルチウェルプレートの4つのウェル/サンプルから8までです。フェーズ 7 は、FACS 分析を使用してサンプルを分析する最終フェーズです。
図 5.CAVD 実験的ワークフロー。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
予備的な結果(図2)から、CD45+白血球と共にリンパ球が石灰化大動脈弁に存在すると結論付けることができ、したがって、石灰化大動脈弁疾患が免疫系の活性化および炎症活性と関連していることを示す。
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Discussion
ここでは、フローサイトメトリーを用いて、ステノスティック大動脈弁サンプルから分離されたTリンパ球亜集団を特徴付ける方法を提示する。この方法では、PBMCを分離するために照射されたバフィーコートを使用する必要があります。バフィーコートバッグが受け取らなければならない放射線周波数は9000 Rad/ 90 Gray(Gy)であり、フィーダー細胞の増殖を止める重要なステップを表しています。バフィーコートバッグから分離された細胞の役割は、フィーダー細胞としてのみ作用し、弁から分離されたT細胞に栄養素を提供することです。未照射のバフィーコートバッグの使用は、過去25に述べられてきたように、培養におけるPBMCの増殖を促進するであろう。90Gy未満の放射線周波数は培養中にPBMCsの増殖を示したので、正確に90Gyの放射線を使用することをお勧めします。注意すべきは、同じ日または次の日に照射されたバフィーコートを使用し、一定の攪拌状態に保つ装置に保管することをお勧めします。この方法のもう一つの重要なステップは、リンパ球クローニング相によって表され、人工物の影響を受ける可能性があります。このイベントを回避するために、新鮮な大動脈弁サンプルでFACSを実行します。Tリンパ球のクローニング段階は、1つの新鮮なサンプルの分析から得られた数よりも、フェノタイプかつ機能的に分析されるTクローン(弁ごとに平均15T細胞クローン)を得る利点を有する。クローニング技術は長年この研究グループによって使用されており、分析された組織の種類に応じて、リンパ球プロファイルは異なっていました21,26,27.この方法の最初の通過は、T細胞がステナティック大動脈弁から分離することに関する。記載されているすべてのステップは、滅菌条件で層流フードの下で行われなければならない、それは強く使用する前にすべての材料を消毒することをお勧めします。結果を得るのに要する時間は6週間であり、クローニング段階から得られたTリンパ球細胞の平均は20 x 106細胞であった。マルチウェルプレートの監視段階は非常に重要であり、見落としてはならない。培地の色から黄色への変化は細菌汚染を表す可能性があり、その場合、使用されるすべての器具を殺菌し、マルチウェルプレートを捨てる必要があります。
FACS分析の前に、適切なゲートを確立し、抗体チャネル間に特異的な重複がないことを確認することが重要である。これにより、正ゲートと負ゲートの間の最適な分離が可能になります。同種の結果を得るために、研究に関与するすべてのサンプルに対して同じ多くの抗体を使用することが推奨されます。また、光を消してすべてのステップを実行し、光からフルオロフォア共役抗体を保護する必要があります。
この方法は、高い再現性を有する結果を生み出す上で有効であり、高価ではない。この方法の制限は、人間のバルブサンプルの入手が限られているため、また対照群の欠如によるサンプルサイズが小さいです。
予備的な結果は、石灰化大動脈弁疾患の発症および進行における重要な要素としての適応免疫の役割を支持する。この研究に登録されたすべての患者は、重度の症候性高カルシウム性大動脈狭窄症の診断を受け、平均年齢は70歳、主に男性である。分析された大動脈弁中のT細胞集団の存在は、免疫細胞活性化のチェックポイントとして、疾患大動脈弁の炎症活性の証拠を提供する。今後の関心点として、CAVD浸潤性T細胞の機能を分析し、アテローム性動脈硬化症28,29,30などの類似疾患で以前に報告されたT細胞特異性を特徴付ける可能性があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
このプロトコルに使用されるすべてのバフィーコートバッグは、ピーター・ローゼンタール博士、ダーク・ベーマー博士、シャリテ・ベンジャミン・フランクリン放射線科のチーム全体の可用性のおかげで照射されました。奨学金ホルダー/メアリー・ロクサーナ・クリストファー、この作品はドイツ心臓協会(DGK)からの奨学金によって支えられます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
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