Summary
I denne studien beskriver vi prosessen med T-lymfocyttisolasjon fra ferske prøver av forkalkede aortaventiler og de analytiske trinnene i T-cellekloning for karakterisering av adaptive leukocyttundergrupper ved hjelp av strømningscytometrianalyse.
Abstract
Calcific aorta ventil sykdom (CAVD), en aktiv sykdomsprosess som spenner fra mild fortykning av ventilen til alvorlig forkalkning, er forbundet med høy dødelighet, til tross for nye terapeutiske alternativer som transkateter aortaventil erstatning (TAVR).
De komplette veiene som starter med ventilforkalkning og fører til alvorlig aortastenose forblir bare delvis forstått. Ved å gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo, kan analysen av T-lymfocytter fra stenotisk ventilvev være en effektiv måte å avklare deres rolle i utviklingen av forkalkning. Etter kirurgisk eksisjon dissekeres den ferske aortaventilprøven i små biter, og T-lymfocyttene dyrkes, klones og analyseres deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS).
Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan også festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Resultatene generert fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-cellekonsentrasjoner over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celleundertyper av interesse. I denne studien viser vi isolasjonen av T-celler, utført på ferske forkalkede aortaventilprøver og trinnene for å analysere T-cellekloner ved hjelp av strømningscytometri for å forstå rollen som adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.
Introduction
Calcific aortaklaffsykdom (CAVD) er en av de vanligste hjerteklaffforstyrrelsene, med stor innvirkning på helsevesenet. Hyppigheten av aortaventilerstatning de siste årene har økt dramatisk og forventes å øke ytterligere på grunn av den voksende eldre befolkningen1.
Den underliggende patofysiologien til CAVD er bare delvis kjent, og de nåværende terapeutiske strategiene er begrenset til konservative tiltak eller aortaventilerstatning, enten gjennom kirurgiske eller perkutane prosedyrer. Til dags dato kan ingen effektiv medisinsk behandling hindre eller reversere CAVD-progresjon og høy dødelighet er forbundet med tidlig symptomstart, med mindre aortaventilerstatning (AVR) utføres2. Hos pasienter med alvorlig symptomatisk aortastenose ble den 3-årige symptomfrie overlevelsen rapportert så lavt som 20%3. Transkateter aortaventilerstatning (TAVR) representerer et nytt alternativ, revolusjonerende behandling for høyrisikopasienter, spesielt blant eldre og har dramatisk redusert dødeligheten, som var iboende høy i denne befolkningen4,5,6. Til tross for de lovende resultatene fra TAVR, er videre forskning nødvendig for å forstå CAVD patofysiologi for å identifisere nye tidlige terapeutiske mål7,8,9.
Tidligere antatt å være en passiv, degenerativ prosess, er CAVD nå anerkjent som en aktiv progressiv sykdom, preget av en osteoblastisk fenotypebryter av aortaventilen interstitielle celler10. Denne sykdommen innebærer progressiv mineralisering, fibrokaltiske endringer og redusert bevegelighet av aortaventilbrosjyrene (sklerose), som til slutt hindrer blodstrømmen som fører til innsnevring (stenose) av aortaventilåpningen11.
Betennelse betraktes som en nøkkelprosess i CAVD patofysiologi, som ligner prosessen med vaskulær aterosklerose. Endotelskade muliggjør avsetning og akkumulering av lipidarter, spesielt oksidert lipoproteiner i aortaventilen12. Disse oksiderte lipoproteinene provoserer en inflammatorisk respons, da de er cytotoksiske, med den inflammatoriske aktiviteten som fører til mineralisering. Rollen som medfødt og adaptiv immunitet i CAVD-utvikling og sykdomsprogresjon har nylig blitt fremhevet13. Aktivering og klonisk utvidelse av spesifikke undergrupper av minne T-celler er dokumentert hos pasienter med CAVD og mineraliserte aortaventilbrosjyrer, slik at inflammatoriske prosesser antas å være involvert i det minste i utviklingen av CAVD og antagelig i sykdomsprogresjon også14. Faktisk, selv om antigen-presenterende celler og makrofager er til stede i både den sunne og syke ventilen, er tilstedeværelsen av T-lymfocytter indikativ for en alderen og syk aortaventil. Denne lymfocytiske infiltraten sammen med en økning i neovascularization og metaplasi er karakteristiske histologiske tegn på CAVD15.
Vi hypoteser eksistensen av en interaksjon mellom aortaventilens interstitialceller og aktiveringen av immunsystemet, noe som potensielt utløser initiering av en kronisk inflammatorisk prosess i aortaventilen. Analysen av T-celler fra stenotisk aortaventilvev kan være en effektiv måte å avklare sin rolle i forkalkningsutvikling, da det kan gi en nær representasjon av aortaventilcellene in vivo. I det nåværende arbeidet, ved hjelp av aortaventilvev, isolerer vi T-lymfocytter, kultur og kloner dem, og karakteriserer dem deretter ved hjelp av fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Ferske aortaventilprøver ble utskilt fra CAVD-pasienter som fikk kirurgisk ventilerstatning for alvorlig aortastenose. Etter kirurgisk eksisjon ble den ferske ventilprøven dissekert i små biter og T-cellene ble dyrket, klonet og deretter analysert ved hjelp av strømningscytometri. Fargingsprosedyren er enkel og de fargede rørene kan festes ved hjelp av 0,5% av paraformaldehyd og analyseres opptil 15 dager senere. Dataene som genereres fra fargingspanelet kan brukes til å spore endringer i T-lymfocyttfordeling over tid i forhold til intervensjon og kan enkelt videreutvikles for å vurdere aktiveringstilstander av spesifikke T-celledelsett av interesse.
Utvinning av forkalket vev, isolering av leukocytter fra forkalket vev og spesielt bruk av strømningscytometri på denne typen vev kan være utfordrende, på grunn av problemer som autofluorescence. Det finnes få publikasjoner med protokoller for dette spesifikke formålet16,17,18. Her presenterer vi en protokoll designet spesielt for direkte isolasjon og kultur av T-lymfocytt fra humane aortaventilprøver. Clonal utvidelse av lymfocytter er et kjennetegn på adaptiv immunitet. Å studere denne prosessen in vitro gir innsiktsfull informasjon om nivået av lymfocytt heterogenitet19. Etter en tre ukers inkubasjonsperiode er T-celleklonene klare til å bli fremskyndet, da en tilstrekkelig mengde T-celler fra hver klone ble oppnådd, for å tillate fenotypisk og funksjonell studie. Deretter studeres fenotypen av T-kloner ved cytofluorometri.
Denne immunologiske protokollen er en tilpasning av en metode som tidligere ble utviklet av Amedei et al. for T-celleisolasjon og karakterisering fra humant vev, spesielt designet for forkalket menneskelig vev, for eksempel i CAVD20,21,22. Protokollen her for isolering av PBMCer (perifere blodmonykleære celler) ved hjelp av bestrålet buffy coat beskriver en effektiv måte å skaffe materceller (FC), spesielt justert for kloningsfasen av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle celler. Materlaget består av i vekst arresterte celler, som fortsatt er levedyktige og bioaktive. Matercellens rolle er viktig for å støtte in vitro overlevelse og vekst av T-lymfocytter isolert fra ventilinterstitielle celler23. For å unngå spredning av materceller i kulturen, må disse cellene gjennomgå en vekststans. Dette kan oppnås på to måter: gjennom fysiske metoder som bestråling, eller gjennom behandling med cytotoksiske kjemikalier, som mitomycin C (MMC), et antitumoralt antibiotika som kan påføres direkte på kulturoverflaten24. Her viser vi matercellevekst arrestasjon oppnådd gjennom cellebestråling.
Denne metoden presenterer en effektiv, kostnadseffektiv måte å isolere og karakterisere T-celler fra aortaventilvev, noe som bidrar til å utvide spekteret av immunologiske metoder for å utforske CAVD patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien ble gjennomført i henhold til Charité-vedtektene for å sikre god vitenskapelig praksis, og de juridiske retningslinjene og bestemmelsene om personvern og etikk ble respektert. Etikkkomiteen godkjente alle menneskelige eksperimenter, og pasientenes personvern og anonymitet ble opprettholdt i samsvar med reglene som er rapportert på etikkformen.
MERK: For protokollen beskrevet nedenfor ble det brukt ferske humane stenotiske ventilprøver.
1. Reagens forberedelse
- Forbered det berikede RPMI komplette mediet ved å legge til RPMI 1640 Medium: Ikke-essensielle aminosyrer; Natriumpyuvatt, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol og Penicillin-Streptomycin (Penn/Strep). Filtrer den før bruk. Oppbevars ved +4 °C og brukes innen to måneder.
- Forbered cellekulturmediet (CCM) for kloningsfasen ved hjelp av det berikede RPMI 1640 komplette mediet tilsatt varmeinaktivert foster Bovine Serum (FBS), HB basal medium, 50 U interleukin 2 (IL-2) og humant serum (HS). Filtrer og bruk det i løpet av dagen. Må ikke lagres.
- Forbered cellekulturmediet for omfeedingsfasen ved hjelp av det berikede RPMI 1640 komplette mediet med ekstra FBS, HB basal medium, 30 U IL-2 og HS. Filtrer og bruk det i løpet av dagen. Må ikke lagres.
- Klargjør vaskebufferen som inneholder 250 ml RPMI og 5 ml penn/strep. Oppbevars ved +4 °C, brukes innen to måneder.
2. Human T lymfocyttisolasjon og kultur i T-25 kolber
- Plasser den stenotiske ventilprøven i en steril Petri-tallerken fylt med vaskebuffer, og sørg for at hele ventilprøven er dekket med den. La stå i 15 minutter.
- Klipp stenotisk ventil i små biter ved hjelp av en skalpell og la den stå igjen i 10 minutter.
- Forbered cellekulturmediet med 50 U IL-2, som tidligere beskrevet, og filtrer det.
- Tilsett CCM inne i T25-kolber og bruk en steril plasttangen, plasser ventilstykkene inne i kolbeene.
- Oppbevar kolbeene i vertikal stilling inne i en CO2-inkubator i en uke, og pass på å observere kolbens status under mikroskopet. T celle kloner skal være synlige omtrent tre dager etter kulturtrinnet; For bedre observasjon er det tilrådelig å plassere kolber i horisontal stilling i 20 minutter før den mikroskopiske analysen.
MERK: Mengden cellekulturmedium avhenger av mengden prøve som er til stede og hvor mange T25-kolber som skal brukes. Tatt i betraktning at hvert stykke ventil krever 10 ml CCM inne i en kolbe, er 25 ml CCM i en T25-kolbe egnet for 3 stykker ventil.
3. Kloning fase
MERK: For kloningsfasen av T-celler er det nødvendig å starte med isolering av materceller fra en bestrålet buffy coat (BC), etter PBMCs-protokollen.
- Åpne BC-posen under laminær strømningshette ved hjelp av posespissen med nålfri ventil og overfør 50 ml blod i en T150-kolbe. Tilsett 70 ml PBS for å fortynne blod inne i kolben.
- Ta fire 50 ml koniske rør og legg 20 ml tetthetsgradientmedium i hver og lag forsiktig 30 ml blod over den.
- Sentrifuge i 25 min ved 800 x g og 20 °C med bremsen av.
- Aspirer forsiktig supernatanten og kast den som avfall. Samle PBMCs-ringen i et nytt 50 ml konisk rør som tilsetter inne i PBS-løsningen opp til et volum på 50 ml.
- Sentrifuge i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kast supernatanten og suspender pelletsen ved å legge til inne i PBS-løsningen opp til et volum på 50 ml. Gjenta sentrifugeringsfasen i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kast supernatanten og suspender FCene i 10 ml cellekulturmedium.
- Ta et nytt oppsamlingsrør og fortynn FCene med PBS 1:10 ved å legge til inne 9,9 ml PBS og 100 μL fra røret med FCs og cellekulturmedium. Skyll godt med en pipette og ta 7 μL fra denne fortynningen og tell cellene under mikroskopet.
- Forbered cellekulturmediet for kloningsfasen: 70 ml med 50 U IL-2, og del det deretter i to 50 ml koniske rør, hvert rør vil inneholde 25 ml cellekulturmedium, som beskrevet nedenfor:
- Rør 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% av fytohemagglutinin (PHA)
- Rør 2: 25 ml CCM + T lymfocytter
MERK: Målet med PMBCs-metoden er å oppnå 2 x 106 celler for hver ml, så 25 ml CCM-forberedt (rør 1) må beregnes tilsvarende. Den generelle formelen som brukes er: Antall telte celler x 106: 1 ml = CCM x 106: X
4. T Lymfocytter kultur i multiwell plater
- Bruk den elektroniske pipetten, samle alle cellekulturmediet inne i kolber og overfør det til et 50 ml konisk rør. De tomme kolbeene kan kastes.
- Pellet cellene ved sentrifugering i 10 min ved 400 x g og 20 °C.
- Kast supernatanten, suspender pelletsen i 50 ml PBS og samle cellene ved sentrifugering i 10 min ved 400 x g og 20 °C. Gjenta dette trinnet to ganger.
- Kast supernatanten og heng pelletsen i 1 ml CCM. Ta 7 μL fra denne fortynning og telle cellene under mikroskopet.
MERK: Antall telte celler må multipliseres for volumet av kammeret og for fortynning påført. - Fortsett å fortynne cellene som telles fra 105 til 103 i cellekulturmediet, og ta deretter 500 μL fra 103 og legg det inne i rør 2.
- Hell det 25 ml cellekulturmediet til Tube 1 inne i en 100 mm x 15 mm plast Petri-tallerken.
- Ta fire 96-U bunn multiwell plater og bruke en flerkanals pipette satt til 100 μL frø FCs i hver brønn.
- Ta Tube 2 og hell cellekulturmediet inne i en Petri-tallerken. Ved hjelp av en flerkanals pipette satt til 100 μL, frø T-celler i hver brønn.
- Oppbevar multiwellplatene inne i en CO2-inkubator i en uke.
5. Første omfeedingsfase
- Bruk en bestrålet, buffy coat bag, følg PBMCs-metoden for å få FCs som beskrevet i den forrige metoden.
- Forbered den passende mengden CCM uten PHA og filtrer den.
- Bruk en flerkanals pipette, fjern 100 μL fra hver brønn, og sørg for ikke å berøre bunnen av brønnen.
- Tilsett 100 μL FCs i alle brønnene som et fôringslag for å gi cellekulturnæringsstoffer og endre mediet.
MERK: For hver multiwell anbefales det å vurdere 6 ml CCM, så den anbefalte mengden for 4 multiwells er ca. 30 ml. PHA (0,4 % av det totale CCM-antallet) må legges til CCM én gang annenhver uke.
6. Andre omfeedingsfase
- Gjenta ommatingsfasen etter avsnittet som er beskrevet ovenfor. 0,4 % PHA må legges til cellekulturmediet.
7. Første oppdelingsfase fra 1 brønn/prøve til 2 brønner/prøve
- Sjekk alle de fire multiwells under mikroskopet og gå videre splitting disse brønnene med T celle kloner (TCCs).
- Følg PBMCs-protokollen for å isolere materceller fra en bestrålet, buffy frakkpose.
- Forbered cellekulturmediet med 30 U av IL-2. Tilsett FC-ene og ta en ny 96-brønns multiwell plate med U-bunn.
- Bruk en pipette satt til 100 μL, skyll godt inne i brønnene til de valgte prøvene og del volumvolumet på 200 μL i hver brønn i 2 nye brønner i den nye multiwellplaten, for å ha 100 μL volum for hver av de nye 2 brønnene.
- Tilsett 100 μL FCs inne i alle de nye brønnene. Hver brønn må inneholde et totalt volum på 200 μL.
- Sett pipetten på 100 μL og tilsett 100 μL i ytterligere to brønner, som bare inneholder FCer som skal fungere som en kontroll.
MERK: Bruk lett mikroskopi for å observere alle flerboplater for å finne ut hvilke brønner som har vokst TCC. For å gjøre valg av kloner enklere, kan det gjøres en sammenligning med kontrollen (de to brønnene som bare inneholder FCs), med klonen som ser mørkere og større ut sammenlignet med kontrollen. Brønnene som skal velges er de med en stor, klar, rund klone, med lymfocytter tett pakket sammen. Hvis ingen TCCer er til stede etter to ukers omfeeding, anbefales det å vente en uke til og utføre en ekstra omfeedingsfase.
8. Andre oppdelingsfase fra 2 brønner/prøve til 4 brønner/prøve
- Sett pipetten til 100 μL, skyll godt inne i de to brønnene i hver prøve og frø to nye brønner på 100 μL for hver enkelt.
- Forbered cellekulturmediet med 30 U IL-2 og følg PBMCs-teknikken for å trekke ut FCene fra den buffy frakkposen og plassere FCene inne i CCM.
- Sett pipetten til 100 μL og frø FCene i alle brønnene. Oppbevar multiwells i en CO2-inkubator i en uke.
9. Tredje oppdelingsfase fra 4 brønner/prøve til 8 brønner/prøve:
- Bruk en flerkanals pipette satt til 100 μL, skyll godt inne i alle fire brønnene i hver prøve og frø 100 μL i hver av de fire nye brønnene i en ny 96-brønnsplate.
- Forbered cellekulturmediet og følg PBMCs-teknikken for å trekke ut FCene fra en bestrålet buffy frakkpose.
- Plasser FCene inne i CCM. Sett pipetten til 100 μL og frø FCene i alle brønnene. Oppbevar multiwells i en CO2-inkubator i en uke
10. Cytofluorimetrisk analyse
- Ta multiwellplaten med den eldste datoen fra CO2-inkubatoren og identifiser oppsamlingsrørene med prøvenumrene som skal analyseres.
- Bruk en flerkanals pipette satt til 200 μL med 2 spisser, skyll grundig inne i to brønner av samme prøve og legg begge inne i samme oppsamlingsrør. Gjenta dette trinnet for alle eksemplene.
MERK: FCs-prøvene vil ikke bli analysert, da de bare fungerer som kontroller.
11. Fremstilling av antistofffargingspanel for cytofluorimetrisk analyse
- Tilsett 1 ml PBS-oppløsning for hvert rør og sentrifuger i 10 minutter ved 400 x g og 20 °C.
- Etter sentrifugeringsfasen kast supernatanten.
MERK: Antistofffargingspanelet finnes i tabell 1. Hver enkelt antistoffkonsentrasjon som beregnes er ca. 2 μL/prøve. Det anbefales å spinne antistoffrørene kort før bruk. For å beskytte fluoroforkonjugede antistoffer fra lys, bør alle trinn utføres i mørket. - Forbered antistoffblandingen inne i et 1,5 ml rør og virvel det.
- Tilsett antistoffene inne i prøvene og la prøvene inkubere i mørket ved romtemperatur i 15 min.
- Tilsett 1 ml PBS i hver prøve og sentrifuge i 10 minutter ved 400 x g og 20 °C.
- Kast supernatanten og heng pelletsen med 500 μL PBS-oppløsning.
- Fortsett med den cytofluorimetriske analysen (FACS-analyse, tabell 1).
MERK: De fargede prøvene kan festes ved hjelp av 0,5 % paraformaldehyd (PFA) fortynnet i PBS-oppløsning og analysert opptil 15 dager senere.
FORSIKTIG: PFA er giftig og må håndteres nøye.
| Markør | Fluorofor |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Strålende fiolett 510 |
| CD14 | Strålende fiolett 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Strålende fiolett 711 |
Tabell 1. Antistofffargingspanel for å oppdage T-lymfocytterpopulasjonen i forkalkningsaortaventilsykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi brukte en enkel og kostnadseffektiv metode for å karakterisere leukocyttpopulasjonen av ferske aortaventilprøver avledet fra menneskelige pasienter med alvorlig aortaventilstenose (se protokoll). Metoden for å isolere PBMCer er et viktig skritt for å skaffe materceller, som brukes i hvert trinn av eksperimentet (kloning, refeeding og splitting av faser) og muliggjør deteksjon og karakterisering av infiltrerende leukocytter i aortaventilprøver. De viktigste trinnene i denne metoden vises i figur 1.
Figur 1. FCs isolasjon fra buffy frakk. (A) Blod lagvis over tetthet gradient medium (B) Hvite blodlegemer ring oppnådd etter sentrifugering (C) Hvite blodlegemer samlet og resuspendert i PBS løsning (D) Hvite celler observert under lysmikroskopi Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Etter to uker med inkubasjon klonet vi vellykket og vokste en T-cellepopulasjon, som vist i figur 2.
Figur 2. T celle klone etter to uker med inkubasjon observert ved hjelp av lysmikroskopi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 illustrerer gatingordningen som brukes til analyse av T-celle subpopulasjoner hos pasienter med CAVD. Som vist fra resultatet av FACS-analysen, er det flere CD4 + T-celler (43,032%) enn CD8 + T-celler (1,079%).
Figur 3. Gating ordningen benyttet for T celle-subpopulation analyse. (A) Det er brukt en port for å identifisere den spesifikke T-cellepopulasjonen i en stenotisk ventil. (B) CD14 negative lymfocytter og CD3 positive lymfocytter. (C) CD3-lymfocytter er inngjerdet for å skille CD4+ T-celler fra CD8+ T-celler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
For å vise at de samme T-cellemarkørene er til stede i både innfødte ventilprøver og klonede prøver, utførte vi FACS-analyse uten kloningsfasen, som illustrert i figur 4.
Figur 4. FACS analyseresultater av to ventilprøver. Vi sammenlignet T-cellene hentet fra en innfødt ventilprøve og en klonet prøve, og validerte at T-cellene som finnes i den opprinnelige ventilen deler spesifikke markører av T-cellene i det endelige klonede produktet. (A) FACS-resultater av en innfødt ventilprøve, uten kloningsfasen. (B) FACS-resultater av ventilprøven analysert etter kloningsfasen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Hele arbeidsflyten er oppsummert i figur 5, med utgangspunkt i disseksjonen av den menneskelige aortaventilen og før FACS-analysen. Alle trinn er nødvendige for analyse av en aortaventilprøve. Fase 1 viser lymfocyttisolasjonen fra stenotisk aortaventilvev. Ventilprøvene må kuttes og plasseres i en Petri-tallerken fylt med vaskebuffer. Ventilstykkene kan plasseres inne i en T25-kolbe fylt med CCM og lagres i en CO2-inkubator i en uke. Fase 2 viser kloningsfasen, som består av to deler: 1) FCs isolasjon fra bestrålet buffy coat bag og 2) T celler kloning fase og kulminerer med cellekulturen i en 96-brønn multiwell plate, som er lagret i en CO2 inkubator i en uke. Fase 3 og 4 består av ommatingsfasen ved hjelp av FCer fra bestrålet, buffy coat; denne fasen må gjentas i to påfølgende uker. Fase 4, 5 og 6 viser delingsfasen av T-cellekloner; Den første oppdelingsfasen er fra 1 brønn/prøve til to brønner for hver prøve i en ny flermannsplate; Den andre splittingen er fra 2 brønner /prøve til 4 brønner for hver i samme multiwell plate; den tredje og siste oppdelingsfasen er fra 4 brønner/prøve til 8 i en ny flermannsplate. Fase 7 er den siste fasen, der prøvene analyseres ved hjelp av FACS-analyse.
Figur 5. CAVD eksperimentell arbeidsflyt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Fra de foreløpige resultatene (figur 2) kan vi konkludere med at lymfocytter, sammen med CD45 + leukocytter, er til stede i forkalkede aortaventiler, og indikerer dermed at kalsifisert aortaventilsykdom er knyttet til aktivering av immunsystemet og inflammatorisk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her presenterer vi en metode for å karakterisere T-lymfocytt subpopulations isolert fra stenotiske aortaventilprøver, ved hjelp av strømningscytometri. Denne metoden krever bruk av bestrålet buffy frakk for å isolere PBMCene. Strålingsfrekvensen som de buffy frakkposene må utsettes for, er 9000 Rad/90 Gray (Gy), og det representerer et avgjørende skritt for å stoppe spredningen av matercellene. Cellenes rolle isolert fra de buffy frakkposene er å fungere bare som materceller og gi næringsstoffer til T-cellene isolert fra ventilene. Bruken av en unirradiaded buffy coat bag ville fremme spredning av PBMCs i kultur, som det har blitt notert i de siste25. En strålingsfrekvens under 90 Gy viste PBMCs spredning i kulturen, så vi anbefaler å bruke nøyaktig 90 Gy av stråling. Vær oppmerksom på at det er tilrådelig å bruke den buffy kappen bestrålet på samme dag eller på det meste neste dag, og holde den på en enhet som holder den i konstant agitasjon. Et annet viktig trinn i denne metoden kan representeres av lymfocyttkloningsfasen, som kan påvirkes av gjenstander; for å unngå denne hendelsen utfører vi FACS på ferske aortaventilprøver. Kloningsfasen av T-lymfocytter har fordelen av å oppnå et større antall T-kloner (i gjennomsnitt 15 T celle kloner for hver ventil) som skal analyseres fenotypisk og funksjonelt, enn tallet oppnådd ved analyse av en fersk prøve. Kloningsteknikken har blitt brukt av denne forskningsgruppen i mange år, og avhengig av hvilken type vev som ble analysert, var lymfocyttprofilen forskjellig21,26,27. Den første passasjen av metoden gjelder T-celleisolasjonen fra en stenotisk aortaventil. Alle trinnene som er beskrevet må utføres under en laminær strømningshette under sterile forhold, og det anbefales på det sterkeste å desinfisere alle materialer før bruk. Tiden som kreves for å oppnå resultater var 6 uker og gjennomsnittet av T-lymfocyttceller hentet fra kloningsfasen var 20 x 106 celler. Overvåkingsfasen av multiwellplatene er svært viktig og må ikke overses. En endring i fargen på mediet til gult kan representere bakteriell forurensning, i så fall må alle instrumentene som brukes steriliseres og de multiwellplatene kastes bort.
Før FACS-analyse er det viktig å etablere en passende port, for å bekrefte at det ikke er noen spesifikk overlapping mellom antistoffkanalene. Dette muliggjør optimal separasjon mellom positive og negative porter. Bruk av de samme mange antistoffene for alle prøver involvert i studien anbefales for å oppnå homogent resultat. Det er også nødvendig å beskytte fluorofor-konjugede antistoffer fra lys, og utføre alle trinn med lyset av.
Denne metoden er effektiv for å gi resultater med høy reproduserbarhet og er ikke dyrt. En begrensning av denne metoden er den lille prøvestørrelsen, på grunn av den begrensede tilgjengeligheten av de menneskelige ventilprøvene, samt mangelen på en kontrollgruppe.
De foreløpige resultatene støtter rollen som adaptiv immunitet som et avgjørende element i utviklingen og progresjonen av kalsifisert aortaventilsykdom. Alle pasientene som deltok i denne studien hadde en diagnose av alvorlig symptomatisk kalsifisert aortastenose, med en gjennomsnittsalder på 70, for det meste mannlig. Eksistensen av T-cellepopulasjoner i aortaventilene som analyseres, gir bevis for den inflammatoriske aktiviteten til den syke aortaventilen som et kontrollpunkt for immuncelleaktivering. Et poeng av fremtidig interesse kan være å analysere funksjonaliteten til CAVD-infiltrerende T-celler og karakterisere T-cellespesifikkitet som tidligere rapportert i lignende sykdommer, for eksempel i aterosklerose28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Alle de buffy frakkposene som ble brukt til denne protokollen ble bestrålet takket være tilgjengeligheten til Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer og hele teamet til Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Stipendholder/Mary Roxana Christopher, dette arbeidet støttes av et stipend fra Det tyske hjerteselskapet (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
