Summary
I denna studie beskriver vi processen för T lymfocyt isolering från färska prover av förkalkade aorta ventiler och analytiska steg av T cell-kloning för karakterisering av adaptiva leukocyte undergrupper med hjälp av flöde cytometry analys.
Abstract
Calcific kolorektal ventil sjukdom (CAVD), en aktiv sjukdom process som sträcker sig från mild förtjockning av ventilen till allvarlig förkalkning, är associerad med hög dödlighet, trots nya terapeutiska alternativ såsom transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR).
De kompletta vägarna som börjar med ventil förkalkning och leder till allvarliga aorta stenos förblir endast delvis förstådda. Genom att tillhandahålla en nära representation av aorta valve cellerna in vivo, kan analysen av T lymfocyter från stenotic ventil vävnad vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i utvecklingen av förkalkning. Efter kirurgisk excision dissekeras det färska kolorektalventilprovet i små bitar och T-lymfocyterna odlas, klonas och analyseras sedan med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS).
Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan också fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. Resultaten från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-cellkoncentrationer över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundertyper av intresse. I denna studie visar vi isolering av T-celler, utförs på färska förkalkade aorta ventil prover och stegen för att analysera T cell kloner med flöde cytometry att ytterligare förstå rollen av adaptiv immunitet i CAVD patofysiologi.
Introduction
Calcific aorta ventil sjukdom (CAVD) är en av de vanligaste hjärtklaff störningar, med en stor inverkan på hälso-och sjukvården. Frekvensen av aortaklaffbyten under de senaste åren har ökat dramatiskt och förväntas öka ytterligare på grund av den växande äldre befolkningen1.
Den underliggande patofysiologi av CAVD är endast delvis känd och de nuvarande terapeutiska strategierna är begränsade till konservativa åtgärder eller kolorektal ventil ersätter, antingen genom kirurgiska eller perkutan förfaranden. Hittills kan ingen effektiv medicinsk behandling hindra eller vända CAVD progression och hög dödlighet är associerad med tidig symptom-debut, om inte aorta ventil ersättning (AVR) utförs2. Hos patienter med svår symptomatisk aorta stenos rapporterades den 3-åriga symptomfria överlevnaden så låg som 20%3. Transcatheter kolorektal ventil ersättning (TAVR) representerar ett nytt alternativ, revolutionerande behandling för högriskpatienter, särskilt bland äldre och har dramatiskt minskat dödligheten, som var i sig hög i denna population4,5,6. Trots de lovande resultaten av TAVR är ytterligare forskning nödvändig för att förstå CAVD patofysiologi för att identifiera nya tidiga terapeutiska mål7,8,9.
Tidigare tros vara en passiv, degenerativ process, CAVD är nu erkänd som en aktiv progressiv sjukdom, kännetecknas av en osteoblastic fenotyp switch av aorta ventil interstitial celler10. Denna sjukdom innebär progressiv mineralisering, fibrokala förändringar och minskad motilitet av kolorektal ventil broschyrer (skleros), som i slutändan hindrar blodflödet leder till förträngning (stenos) av kolorektal ventilöppning11.
Inflammation anses vara en nyckelprocess i CAVD patofysiologi, som liknar processen med vaskulär åderförkalkning. Endotelskada möjliggör deponering och ackumulering av lipidarter, särskilt oxiderade lipoproteiner i kolorektalventilen12. Dessa oxiderade lipoproteiner provocerar ett inflammatoriskt svar, eftersom de är cytotoxiska, med den inflammatoriska aktiviteten som leder till mineralisering. Rollen av medfödd och adaptiv immunitet i CAVD utveckling och sjukdomsprogression har nyligen belysts13. Aktivering och klonurvalet expansion av specifika delmängder av minne T-celler har dokumenterats hos patienter med CAVD och mineraliserade aorta valve broschyrer, så att inflammatoriska processer antas vara inblandade åtminstone i utvecklingen av CAVD och förmodligen i sjukdomsprogression samt14. Faktum är att även om antigen-presentera celler och makrofager finns i både friska och sjuka ventilen, är förekomsten av T lymfocyter vägledande för en åldring och sjuk aorta ventil. Denna lymfatiska infiltrate tillsammans med en ökning av neovascularization och metaplasi är karakteristiska histologiska tecken på CAVD15.
Vi t ställa hypotesen förekomsten av en interaktion mellan aorta ventil interstitial celler och aktivering av immunsystemet, som potentiellt utlöser inledandet av en kronisk inflammatorisk process i aorta ventilen. Analys av T-celler från stenotic aorta ventil vävnad kan vara ett effektivt sätt att klargöra deras roll i förkalkning utveckling, eftersom det kan ge en nära representation av aorta ventilceller in vivo. I det nuvarande arbetet, med hjälp av kolorektal ventil vävnad, isolerar vi T-lymfocyter, kultur och klonar dem, och därefter karakterisera dem med fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Färska aorta valve prover togs bort från CAVD patienter som fick kirurgiska ventil ersätter för allvarliga aorta stenos. Efter kirurgiska excision dissekerades den färska ventilprovet i små bitar och T-cellerna odlades, klonades sedan analyseras med hjälp av flöde cytometri. Färgningsproceduren är enkel och de färgade rören kan fixas med 0,5% av paraformaldehyd och analyseras upp till 15 dagar senare. De data som genereras från färgningspanelen kan användas för att spåra förändringar i T-lymfocytfördelning över tid i förhållande till intervention och kan enkelt vidareutvecklas för att bedöma aktiveringstillstånd för specifika T-cellsundergrupper av intresse.
Extraktion av förkalkad vävnad, isolering av leukocyter från förkalkad vävnad och särskilt användningen av flödescytometri på denna typ av vävnad kan vara utmanande på grund av problem som autofluorescens. Få publikationer finns med protokoll för detta specifika ändamål16,17,18. Häri presenterar vi ett protokoll utformat speciellt för direkt isolering och kultur av T lymfocyt från mänskliga aorta ventil prover. Klonisk expansion av lymfocyter är ett kännetecken för adaptiv immunitet. Att studera denna process in vitro ger insiktsfull information om nivån av lymfocyt heterogenitet19. Efter en inkubationsperiod på tre veckor är T-cellsklonerna redo att explanteras, eftersom en tillräcklig mängd T-celler från varje klon erhölls, så att den fenotypiska och funktionella studien kan tillåtas. Därefter studeras fenotypen av T kloner av cytofluorometri.
Detta immunologiska protokoll är en anpassning av en metod som tidigare utvecklats av Amedei et al. för T-cellsisolering och karakterisering från mänsklig vävnad, särskilt utformad för förkalkad mänsklig vävnad, såsom i CAVD20,21,22. Protokollet här för isolering av PBMCs (perifera blod mononukleära celler) med hjälp av bestrålade buffy coat beskriver ett effektivt sätt att erhålla matare celler (FC), särskilt justerat för kloning fasen av T lymfocyter isolerade från ventil interstitiella celler. Matarskiktet består av tillväxt arresterade celler, som fortfarande är livskraftiga och bioaktiva. Matarcellernas roll är viktig för att stödja överlevnad och tillväxt av T-lymfocyter isolerade från ventilinterstitiella celler23. För att undvika spridning av matarceller i kulturen måste dessa celler genomgå ett tillväxtstopp. Detta kan uppnås på två sätt: genom fysiska metoder som bestrålning, eller genom behandling med cytotoxiska kemikalier, såsom mitomycin C (MMC), ett antitumoralt antitumoral antibiotikum som kan appliceras direkt på odlingsytan24. Här visar vi feeder cell tillväxt arrest uppnås genom cell bestrålning.
Denna metod presenterar ett effektivt, kostnadseffektivt sätt att isolera och karakterisera T-celler från aorta ventil vävnad, bidrar till att bredda spektrumet av immunologiska metoder för att utforska CAVD patofysiologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studien genomfördes i enlighet med stadgan för Charité for Ensuring Good Scientific Practice och de rättsliga riktlinjerna och bestämmelserna om integritet och etik respekterades. Etikkommittén godkände alla mänskliga experiment och patienternas integritet och anonymitet bibehölls i enlighet med de regler som rapporterades på etikformen.
OBS: För protokollet som beskrivs nedan användes färska mänskliga stenotic ventil prover.
1. Reagensberedning
- Förbered det berikade RPMI-kompletta mediet genom att tillsätta i RPMI 1640 Medium: Icke-essentiella aminosyror; Natrium pyruvat, L- Glutamin, ß-Mercaptoethanol och Penicillin-Streptomycin (Penna/Strep). Filtrera den före användning. Förvara vid +4 °C och använd inom två månader.
- Förbered cellodlingsmediet (CCM) för kloningsfasen med hjälp av den berikade RPMI 1640 kompletta medium tillsatt värmeinaktiverat fetala bovinserum (FBS), HB basalmedium, 50 U Interleukin 2 (IL-2) och Human Serum (HS). Filtrera och använd den inom dagen. Förvara inte.
- Förbered cellodlingsmediet för återmatningsfasen med det berikade RPMI 1640 kompletta mediet med tillsatt FBS, HB basalmedium, 30 U IL-2 och HS. Filtrera och använd den inom dagen. Förvara inte.
- Förbered tvättbufferten som innehåller 250 ml RPMI och 5 ml penna/strep. Förvara vid +4 °C, använd inom två månader.
2. Mänsklig T-lymfocytisolering och odling i T-25-flaskor
- Placera stenotiska ventilprovet i en steril Petri-skål fylld med tvättbuffert och se till att hela ventilprovet är täckt med den. Låt stå i 15 minuter.
- Skär stenotisk ventil i små bitar med en skalpell och låt den stå igen i 10 minuter.
- Förbered cellodlingsmediet med 50 U IL-2, som tidigare beskrivits, och filtrera det.
- Tillsätt CCM inuti T25-kolvarna och använd en steril plastpägare och placera ventilbitarna inuti kolvarna.
- Förvara kolvarna i vertikalt läge inuti en CO2-inkubator i en vecka och var noga med att iaktta kolvens status under mikroskopet. T-cellskloner bör vara synliga ungefär tre dagar efter odlingssteget; För bättre observation är det lämpligt att placera kolvarna i horisontellt läge i 20 minuter före den mikroskopiska analysen.
OBS: Mängden cellodlingsmedium beror på mängden prov som finns och hur många T25-flaskor som kommer att användas. Med tanke på att varje ventil kräver 10 ml CCM inuti en kolv, är 25 ml CCM i en T25-kolv lämplig för 3 ventilstycken.
3. Kloningsfasen
OBS: För kloningsfasen av T-celler är det nödvändigt att börja med isolering av matarceller från en bestrålad buffy coat (BC), enligt PBMCs-protokollet.
- Öppna BC-påsen under den laminära flödeshuven med påspiken med nålfri ventil och överför 50 ml blod i en T150-kolv. Tillsätt 70 ml PBS för att späda ut blod inuti kolven.
- Ta fyra 50 ml koniska rör och placera 20 ml densitetsgradientmedium i varje och försiktigt lägga 30 ml blod över det.
- Centrifugera i 25 min vid 800 x g och 20 °C med bromsen avstängd.
- Aspirera försiktigt supernatanten och kassera den som avfall. Samla PBMCs-ringen i ett nytt 50ml koniskt rör som lägger till i PBS-lösningen upp till en volym på 50 ml.
- Centrifugera i 10 min vid 400 x g och 20 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten genom att lägga inuti PBS-lösningen upp till en volym på 50 ml. Upprepa centrifugeringsfasen i 10 minuter vid 400 x g och 20 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera FCs i 10 ml cellodlingsmedium.
- Ta ett nytt uppsamlingsrör och späd FCs med PBS 1:10 genom att lägga till inuti 9,9 ml PBS och 100 μL från röret med FCs och cellodlingsmedium. Skölj väl med en pipett och ta 7 μL från denna utspädning och räkna cellerna under mikroskopet.
- Förbered cellodlingsmediet för kloningsfasen: 70 ml med 50 U IL-2 och dela det sedan i två 50 ml koniska rör, varje rör kommer att innehålla 25 ml cellodlingsmedium, enligt beskrivningen nedan:
- Rör 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% fytohemagglutinin (PHA)
- Rör 2: 25 ml CCM + T-lymfocyter
OBS: Syftet med PMBCs-metoden är att erhålla 2 x 106 celler för varje ml, så 25 ml CCM som bereds (rör 1) måste beräknas i enlighet därmed. Den allmänna formeln som används är: Antal räknade celler x 106: 1 ml = CCM x 106: X
4. T Lymfocyter kultur i multiwell plattor
- Använd den elektroniska pipetten och samla in allt cellodlingsmedium inuti kolvarna och överför det till ett koniskt rör på 50 ml. De tomma kolvarna kan kastas bort.
- Pellet cellerna genom centrifugering i 10 min vid 400 x g och 20 °C.
- Kassera supernatanten, suspendera pelleten i 50 ml PBS och samla cellerna genom centrifugering i 10 minuter vid 400 x g och 20 °C. Upprepa det här steget två gånger.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten i 1 ml CCM. Ta 7 μL från denna utspädning och räkna cellerna under mikroskopet.
OBS: Antalet räknade celler måste multipliceras för kammarens volym och för utspädning som appliceras. - Fortsätt att späda ut de celler som räknats från 105 till 103 i cellodlingsmedium och ta sedan 500 μL från 103 och lägg den i röret 2.
- Häll 25 ml cellodlingsmediet i rör 1 inuti en 100 mm x 15 mm petriskål av plast.
- Ta fyra 96-U botten multiwell plattor och med en flerkanals pipett inställd på 100 μL frö FCs i varje brunn.
- Ta tuben 2 och häll cellodlingsmediet i en Petri-maträtt. Använd en flerkanalspipett inställd på 100 μL, sådd T-celler i varje brunn.
- Förvara multibrunnplattorna i en CO2-inkubator i en vecka.
5. Första återmatningsfasen
- Använd en bestrålad buffy coat bag, följ PBMCs-metoden för att erhålla FCs enligt beskrivningen i föregående metod.
- Förbered lämplig mängd CCM utan PHA och filtrera den.
- Använd en flerkanalspipett och ta bort 100 μL från varje brunn och se till att inte vidröra brunnens botten.
- Tillsätt 100 μL FCs i alla brunnar som ett foderlager för att ge cellodlingsnäring och ändra mediet.
OBS: För varje multiwell rekommenderas att överväga 6 ml CCM, så den rekommenderade kvantiteten för 4 multiwells är ca 30 ml. PHA (0,4 % av den totala CCM-kvantiteten) måste läggas till ccm en gång varannan vecka.
6. Andra återmatningsfasen
- Upprepa återmatningsfasen efter det avsnitt som beskrivs ovan. 0,4% PHA måste läggas till cellodlingsmediet.
7. Första delningsfasen från 1 brunn/prov till 2 brunnar/prov
- Kontrollera alla fyra multiwells under mikroskopet och gå vidare dela dessa brunnar med T-cellskloner (TCCs).
- Följ PBMCs-protokollet för att isolera matarceller från en bestrålad buffy coat bag.
- Förbered cellodlingsmediet med 30 U IL-2. Tillsätt FCs och ta en ny 96-brunns multiwellplatta med U-botten.
- Använd en pipett som är inställd på 100 μL, skölj väl inuti brunnarna i de valda proverna och dela upp volymen på 200 μL i varje brunn i 2 nya brunnar på den nya multibrunnplattan, för att ha 100 μL volym för var och en av de nya 2 brunnarna.
- Tillsätt 100 μL FCs i alla nya brunnar. Varje brunn måste innehålla en total volym på 200 μL.
- Ställ pipetten på 100 μL och tillsätt 100 μL i ytterligare två brunnar, som endast innehåller FCs för att fungera som en kontroll.
OBS: Använd lätt mikroskopi för att observera alla multiwellplattor för att avgöra vilka brunnar som framgångsrikt har odlat TCC. För att göra valet av kloner enklare kan en jämförelse göras med kontrollen (de två brunnarna som endast innehåller FCs), med klonen som verkar mörkare och större jämfört med kontrollen. De brunnar som ska väljas är de med en stor, klar, rund klon, med lymfocyter tätt packade tillsammans. Om inga TV-nätverkskort finns efter två veckors ommatning rekommenderas att vänta ytterligare en vecka och utföra en ytterligare ommatningsfas.
8. Andra delningsfasen från 2 brunnar/prov till 4 brunnar/prov
- Ställ pipetten på 100 μL, skölj väl inuti de två brunnarna i varje prov och frö två nya brunnar på 100 μL för var och en.
- Förbered cellodlingsmediet med 30 U IL-2 och följ PBMCs-tekniken för att extrahera FCs från den buffy coat bag och placera FCs inuti CCM.
- Ställ pipetten på 100 μL och så FCs i alla brunnar. Förvara multiwells i en CO2 inkubator i en vecka.
9. Tredje delningsfasen från 4 brunnar/prov till 8 brunnar/prov:
- Använd en flerkanalspipett inställd på 100 μL, skölj väl inuti alla fyra brunnarna i varje prov och frö 100 μL i var och en av de fyra nya brunnarna i en ny 96-brunnsplatta.
- Förbered cellodlingsmediet och följ PBMCs-tekniken för att extrahera FCs från en bestrålad buffy coat bag.
- Placera FCs inuti CCM. Ställ pipetten på 100 μL och så FCs i alla brunnar. Förvara multiwells i en CO2 inkubator i en vecka
10. Cytofluorimetrisk analys
- Ta multiwellplattan med det äldsta datumet från CO2-inkubatorn och identifiera uppsamlingsrören med provnumren för att analysera.
- Använd en flerkanalspipett inställd på 200 μL med 2 spetsar, skölj noggrant inuti två brunnar av samma prov och lägg båda i samma uppsamlingsrör. Upprepa det här steget för alla exempel.
FCs-exemplen kommer inte att analyseras, eftersom de bara fungerar som kontroller.
11. Antikroppsfärgningspanel Förberedelse för cytofluorimetrisk analys
- Tillsätt 1 ml PBS-lösning för varje rör och centrifug i 10 min vid 400 x g och 20 °C.
- Efter centrifugeringsfasen kassera supernatanten.
OBS: Panelen för antikroppsfärgning finns i tabell 1. Varje beräknad antikroppskoncentration är ca 2 μL/prov. Det rekommenderas att kortvarigt snurra antikroppsrören före användning. För att skydda de fluoroforkonjugerade antikropparna från ljus bör alla steg utföras i mörkret. - Förbered antikroppsblandningen inuti ett 1,5 ml-rör och virvla det.
- Tillsätt antikropparna inuti proverna och låt proverna inkuberas i mörker vid rumstemperatur i 15 minuter.
- Tillsätt 1 ml PBS i varje prov och centrifugera i 10 min vid 400 x g och 20 °C.
- Kassera supernatanten och suspendera pelleten med 500 μL PBS-lösning.
- Fortsätt med cytofluorimetrisk analys (FACS-analys, tabell 1).
OBS: De färgade proverna kan fixeras med 0,5% paraformaldehyd (PFA) utspädd i PBS-lösning och analyseras upp till 15 dagar senare.
VARNING: PFA är giftigt och måste hanteras varsamt.
| Markör | Fluorofor |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Briljant violett 510 |
| CD14 | Briljant violett 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Briljant violett 711 |
Tabell 1. Antikroppsfärgning panel för att upptäcka T lymfocyter populationen i förkalkning aorta ventil sjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi använde en enkel och kostnadseffektiv metod för att karakterisera leukocytpopulationen av färska aorta ventil prover härrör från mänskliga patienter med allvarliga aorta ventil stenos (se protokollet). Metoden för att isolera PBBC är ett viktigt steg för att erhålla matningsceller, som används i varje steg i experimentet (kloning, återmatning och klyvningsfaser) och möjliggör detektion och karakterisering av infiltrerande leukocyter i aortaklaffprover. De viktigaste stegen i den här metoden visas i figur 1.
Figur 1. FCs isolering från buffy coat. (A) Blod skiktat över densitetsgradientmedium (B) Vita blodkroppar ring erhållna efter centrifugering (C) Vita blodkroppar samlas in och återanvänds i PBS lösning (D) Vita celler observerade under ljusmikroskopi Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Efter två veckors inkubation klonade vi framgångsrikt och växte en T-cellpopulation, som visas i figur 2.
Figur 2. T-cellsklon efter två veckors inkubation observerad med lätt mikroskopi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 3 illustrerar det gitterschema som används för analys av T-cellssubpopulationer hos patienter med CAVD. Som framgår av resultatet av FACS-analysen finns det fler CD4 + T-celler (43,032%) än CD8 + T-celler (1,079%).
Figur 3. Gating schema används för T cell-subpopulation analys. A) En grind har anbringats för att identifiera den specifika T-cellpopulationen i en stenotisk ventil. B) CD14-negativa lymfocyter och CD3-positiva lymfocyter. (C) CD3-lymfocyter är gated för att skilja CD4 + T-celler från CD8 + T-celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
För att visa att samma T-cellmarkörer finns i både inhemska ventilprover och klonade prover utförde vi FACS-analys utan kloningsfasen, vilket illustreras i figur 4.
Figur 4. FACS-analysresultat från två ventilprover. Vi jämförde T-cellerna som erhållits från ett inbyggt ventilprov och ett klonat prov, vilket validerar att de T-celler som finns i den ursprungliga ventilen delar specifika markörer för T-cellerna i den slutliga klonade produkten. A) FACS-resultat av ett inbyggt ventilprov, utan kloningsfasen. B) FACS-resultat av det ventilprov som analyserats efter kloningsfasen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Hela arbetsflödet sammanfattas i figur 5, med början från dissekeringen av den mänskliga aortaventilen och leder fram till FACS-analysen. Alla steg krävs för analys av ett aortaventilprov. Fas 1 visar lymfocytisolering från stenotisk aorta ventil vävnad. Ventilproverna måste skäras och placeras i en Petri-skål fylld med tvättbuffert. Ventilstyckena kan placeras inuti en T25-kolv fylld med CCM och förvaras i en CO2-inkubator i en vecka. Fas 2 visar kloningsfasen, som består av två delar: 1) FCs isolering från bestrålad buffy coat bag och 2) T-celler kloning fas och kulminerar med cellkulturen i en 96-brunns multiwell platta, som lagras i en CO2 inkubator i en vecka. Faserna 3 och 4 består av återmatningsfasen med hjälp av FCs från bestrålad buffy coat. denna fas måste upprepas under två på varandra följande veckor. Faserna 4, 5 och 6 visar delningsfasen av T-cellskloner. Den första delningsfasen är från 1 brunn/prov till två brunnar för varje prov i en ny flerbrunnplatta. Den andra delningen är från 2 brunnar /prov till 4 brunnar för var och en i samma multiwellplatta; den tredje och sista delningsfasen är från 4 brunnar/prov till 8 i en ny flerbrunnplatta. Fas 7 är slutfasen, där proverna analyseras med hjälp av FACS-analys.
Figur 5. CAVD Experimentellt arbetsflöde. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Från de preliminära resultaten (figur 2) kan vi dra slutsatsen att lymfocyter, tillsammans med CD45 + leukocyter finns i förkalkade aortaventiler, vilket indikerar att calcific aorta ventil sjukdom är kopplad till aktivering av immunsystemet och inflammatorisk aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här presenterar vi en metod för att karakterisera T lymfocyt subpopulationer isolerade från stenotic aorta ventil prover, med hjälp av flöde cytometry. Denna metod kräver användning av bestrålad buffy coat för att isolera PBMCs. Den strålningsfrekvens som de buffy coat bags måste utsättas för är 9000 Rad/90 Gray (Gy) och det utgör ett avgörande steg för att stoppa spridningen av matarcellerna. Rollen för de celler som isoleras från de buffy coat bags är att fungera endast som matarceller och ge näringsämnen för T-cellerna isolerade från ventilerna. Användningen av en enfräterad buffy coat bag skulle främja spridningen av PBMCs i kulturen, vilket har noterats under de senaste25. En strålningsfrekvens under 90 Gy visade PBMCs spridning i kultur, så vi rekommenderar att du använder exakt 90 Gy av strålning. Observera att det är lämpligt att använda den buffy kappan bestrålad på samma dag eller högst nästa dag och hålla den på en enhet som håller den i konstant agitation. Ett annat avgörande steg i denna metod kan representeras av lymfocytkloningsfasen, som kan påverkas av artefakter; för att undvika denna händelse utför vi FACS på färska aorta ventilprover. Kloningsfasen av T-lymfocyter har fördelen att erhålla ett större antal T-kloner (i genomsnitt 15 T-cellskloner för varje ventil) som ska analyseras fenotypiskt och funktionellt, än det antal som erhålls från analysen av ett färskt prov. Kloningstekniken har använts av denna forskargrupp i många år och beroende på vilken typ av vävnad som analyserades var lymfocytprofilen olika21,26,27. Den första passagen av metoden gäller T-cellsisoleringen från en stenotisk aortaklaff. Alla beskrivna steg måste utföras under en laminär flödeshuv under sterila förhållanden och det rekommenderas starkt att desinficera alla material före användning. Den tid som krävdes för att uppnå resultat var 6 veckor och genomsnittet av T lymfocytceller som erhållits från kloningsfasen var 20 x 106 celler. Övervakningsfasen av multiwellplattorna är mycket viktig och får inte förbises. En förändring i färgen på mediet till gult kan representera bakteriell förorening, i vilket fall alla instrument som används måste steriliseras och multiwellplattorna kastas bort.
Före FACS-analysen är det viktigt att upprätta en lämplig grind för att kontrollera att det inte finns någon specifik överlappning mellan antikroppskanalerna. Detta möjliggör optimal separation mellan positiva och negativa grindar. Användning av samma partier antikroppar för alla prover som ingår i studien rekommenderas för att uppnå ett homogent resultat. Det är också nödvändigt att skydda de fluoroforkonjugerade antikropparna från ljus och utföra alla steg med ljuset av.
Denna metod är effektiv för att ge resultat med hög reproducerbarhet och är inte dyr. En begränsning av denna metod är den lilla provstorleken, på grund av den begränsade tillgängligheten av de mänskliga ventilproverna, liksom bristen på en kontrollgrupp.
De preliminära resultaten stöder rollen av adaptiv immunitet som ett avgörande element i utvecklingen och utvecklingen av calcific aorta valve sjukdom. Alla patienter som deltog i denna studie hade en diagnos av allvarliga symptomatiskt värmeorektal stenos, med en genomsnittlig ålder på 70, mestadels manliga. Förekomsten av T-cellspopulationer i de aortaventiler som analyseras ger bevis för den inflammatoriska aktiviteten hos den sjuka aortaklaffen som en kontrollpunkt för immuncellaktivering. En punkt av framtida intresse kan vara att analysera funktionaliteten hos CAVD-infiltrera T-celler och karakterisera T-cells specificitet som tidigare rapporterats i liknande sjukdomar, såsom vid åderförkalkning28,29,30.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Alla buffy coat väskor som används för detta protokoll bestrålades tack vare tillgängligheten av Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer och hela teamet av Radiology Department of Charité Benjamin Franklin. Stipendiat/Mary Roxana Christopher, detta arbete stöds av ett stipendium från German Cardiac Society (DGK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
- Nkomo, V. T., et al. Burden of valvular heart diseases: a population-based study. Lancet. 368 (9540), 1005-1011 (2006).
- Clavel, M. A., et al. Impact of aortic valve calcification, as measured by MDCT, on survival in patients with aortic stenosis: results of an international registry study. Journal of the American College of Cardiology. 64 (12), 1202-1213 (2014).
- Rosenhek, R., et al. Predictors of outcome in severe, asymptomatic aortic stenosis. The New England Journal of Medicine. 343 (9), 611-617 (2000).
- Alushi, B., et al. Pulmonary Hypertension in Patients With Severe Aortic Stenosis: Prognostic Impact After Transcatheter Aortic Valve Replacement: Pulmonary Hypertension in Patients Undergoing TAVR. JACC: Cardiovascular Imaging. 12 (4), 591-601 (2019).
- Figulla, H. R., Franz, M., Lauten, A. The History of Transcatheter Aortic Valve Implantation (TAVI)-A Personal View Over 25 Years of development. Cardiovascular Revascularization Medicine. 21 (3), 398-403 (2020).
- Lauten, A., et al. TAVI for low-flow, low-gradient severe aortic stenosis with preserved or reduced ejection fraction: a subgroup analysis from the German Aortic Valve Registry (GARY). Euro Intervention Journal. 10 (7), 850-859 (2014).
- Mirna, M., et al. Multi-biomarker analysis in patients after transcatheter aortic valve implantation (TAVI). Biomarkers. 23 (8), 773-780 (2018).
- Wernly, B., et al. Transcatheter aortic valve replacement for pure aortic valve regurgitation: "on-label" versus "off-label" use of TAVR devices. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 921-930 (2019).
- Wernly, B., et al. Transcatheter valve-in-valve implantation (VinV-TAVR) for failed surgical aortic bioprosthetic valves. Clinical Research in Cardiology. 108 (1), 83-92 (2019).
- Mathieu, P., Bouchareb, R., Boulanger, M. C. Innate and Adaptive Immunity in Calcific Aortic Valve Disease. Journal of Immunology Research. 2015, 851945 (2015).
- Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. Calcific Aortic Valve Disease: Molecular Mechanisms and Therapeutic Approaches. European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).
- Olsson, M., Thyberg, J., Nilsson, J. Presence of oxidized low density lipoprotein in nonrheumatic stenotic aortic valves. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 19 (5), 1218-1222 (1999).
- Mazzone, A., et al. T-lymphocyte infiltration, and heat shock protein-60 are biological hallmarks of an immunomediated inflammatory process in end-stage calcified aortic valve stenosis. Journal of the American College of Cardiology. 43 (9), 1670-1676 (2004).
- Wu, H. D., et al. The Lymphocytic Infiltration in Calcific Aortic Stenosis Predominantly Consists of Clonally Expanded T Cells. The Journal of Immunology. 178 (8), 5329-5339 (2007).
- Raddatz, M. A., Madhur, M. S., Merryman, W. D. Adaptive immune cells in calcific aortic valve disease. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 317 (1), 141-155 (2009).
- Galkina, E., et al. Lymphocyte recruitment into the aortic wall before and during development of atherosclerosis is partially L-selectin dependent. The Journal of Experimental Medicine. 203 (5), 1273-1282 (2006).
- Poursaleh, A., et al. Isolation of intimal endothelial cells from the human thoracic aorta: Study protocol. Medical journal of the Islamic Republic of Iran. 33, 51 (2019).
- Yun, T. J., Lee, J. S., Shim, D., Choi, J. H., Cheong, C. Isolation and Characterization of Aortic Dendritic Cells and Lymphocytes in Atherosclerosis. Methodsin Molecular Biology. 11559, 419-437 (2017).
- Adams, N. M., Grassmann, S., Sun, J. C. Clonal expansion of innate and adaptive lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 20 (11), 694-707 (2020).
- Amedei, A., et al. Characterization of tumor antigen peptide-specific T cells isolated from the neoplastic tissue of patients with gastric adenocarcinoma. Cancer Immunology & Immunotherapy. 58 (11), 1819-1830 (2009).
- Niccolai, E., et al. Intra-tumoral IFN-gamma-producing Th22 cells correlate with TNM staging and the worst outcomes in pancreatic cancer. Clinical Science (London). 130 (4), 247-258 (2016).
- Niccolai, E., et al. The Different Functional Distribution of "Not Effector" T Cells (Treg/Tnull) in Colorectal Cancer. Frontiers in Immunology. 8, 1900 (2017).
- Llames, S., Garcia-Perez, E., Meana, A., Larcher, F., del Rio, M. Feeder Layer Cell Actions and Applications. Tissue Engineering Part B: Reviews. 21 (4), 345-353 (2015).
- Ponchio, L., et al. Mitomycin C as an alternative to irradiation to inhibit the feeder layer growth in long-term culture assays. Cytotherapy. 2 (4), 281-286 (2000).
- Delso-Vallejo, M., Kollet, J., Koehl, U., Huppert, V. Influence of Irradiated Peripheral Blood Mononuclear Cells on Both Ex Vivo Proliferation of Human Natural Killer Cells and Change in Cellular Property. Frontiers in Immunology. 8, 854 (2017).
- Amedei, A., et al. Molecular mimicry between Helicobacter pylori antigens and H+, K+ --adenosine triphosphatase in human gastric autoimmunity. Journal of Experimental Medicine. 198 (8), 1147-1156 (2003).
- Lienhardt, C., et al. Active tuberculosis in Africa is associated with reduced Th1 and increased Th2 activity in vivo. European Journal of Immunology. 32 (6), 1605-1613 (2002).
- Benagiano, M., et al. Chlamydophila pneumoniae phospholipase D (CpPLD) drives Th17 inflammation in human atherosclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1222-1227 (2012).
- Benagiano, M., et al. Human 60-kDa heat shock protein is a target autoantigen of T cells derived from atherosclerotic plaques. Journal of Immunology. 174 (10), 6509-6517 (2005).
- Benagiano, M., et al. T helper type 1 lymphocytes drive inflammation in human atherosclerotic lesions. Procceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (11), 6658-6663 (2003).
