Summary
In dieser Studie beschreiben wir den Prozess der T-Lymphozyten-Isolierung aus frischen Proben verkalkter Aortenklappen und die analytischen Schritte des T-Zell-Klonens zur Charakterisierung der adaptiven Leukozyten-Untergruppen unter Verwendung der Durchflusszytometrie-Analyse.
Abstract
Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD), ein aktiver Krankheitsprozess, der von einer leichten Verdickung der Klappe bis hin zu schwerer Verkalkung reicht, ist trotz neuer Therapieoptionen wie dem Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) mit einer hohen Mortalität verbunden.
Die kompletten Wege, die mit der Klappenverkalkung beginnen und zu einer schweren Aortenstenose führen, bleiben nur teilweise verstanden. Durch eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo könnte die Untersuchung von T-Lymphozyten aus stenotischem Klappengewebe ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Entwicklung der Verkalkung zu klären. Nach der chirurgischen Exzision wird die frische Aortenklappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Lymphozyten werden kultiviert, kloniert und dann mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) analysiert.
Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können auch mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Ergebnisse können verwendet werden, um Änderungen der T-Zell-Konzentrationen im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Subtypen von Interesse zu bewerten. In dieser Studie zeigen wir die Isolierung von T-Zellen, die an frisch verkalkten Aortenklappenproben durchgeführt wurden, und die Schritte der Analyse von T-Zell-Klonen mittels Durchflusszytometrie, um die Rolle der adaptiven Immunität in der CAVD-Pathophysiologie besser zu verstehen.
Introduction
Die Kalziffische Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist eine der häufigsten Herzklappenerkrankungen mit starken Auswirkungen auf das Gesundheitswesen. Die Häufigkeit des Aortenklappenersatzes hat in den letzten Jahren dramatisch zugenommen und wird aufgrund der wachsenden älteren Bevölkerung voraussichtlich weiter zunehmen1.
Die zugrunde liegende Pathophysiologie der CAVD ist nur teilweise bekannt und die aktuellen therapeutischen Strategien beschränken sich auf konservative Maßnahmen oder Aortenklappenersatz, entweder durch chirurgische oder perkutane Verfahren. Bis heute kann keine wirksame medizinische Behandlung das Fortschreiten der CAVD behindern oder umkehren, und eine hohe Mortalität ist mit einem frühen Symptombeginn verbunden, es sei denn, es wird ein Aortenklappenersatz (AVR) durchgeführt2. Bei Patienten mit schwerer symptomatischer Aortenstenose wurde das symptomfreie 3-Jahres-Überleben von nur 20%3 berichtet. Der Transkatheter-Aortenklappenersatz (TAVR) stellt eine neue Option dar, die die Behandlung von Hochrisikopatienten, insbesondere bei älteren Menschen, revolutioniert und die Mortalität, die in dieser Population an sich hoch war, dramatisch gesenkt hat4,5,6. Trotz der vielversprechenden Ergebnisse von TAVR ist weitere Forschung notwendig, um die CAVD-Pathophysiologie zu verstehen, um neue frühe therapeutische Ziele zu identifizieren7,8,9.
CAVD, das früher als passiver, degenerativer Prozess angesehen wurde, wird heute als aktive progressive Erkrankung anerkannt, die durch einen osteoblastischen Phänotypschalter der Aortenklappen-Interstitialzellen gekennzeichnet ist10. Diese Krankheit beinhaltet eine fortschreitende Mineralisierung, fibrokalzische Veränderungen und eine verminderte Motilität der Aortenklappenblättchen (Sklerose), die letztendlich den Blutfluss behindern, was zu einer Verengung (Stenose) der Aortenklappenöffnung führt11.
Entzündung gilt als ein Schlüsselprozess in der CAVD-Pathophysiologie, ähnlich dem Prozess der vaskulären Atherosklerose. Endothelschäden ermöglichen die Ablagerung und Akkumulation von Lipidspezies, insbesondere von oxidierten Lipoproteinen in der Aortenklappe12. Diese oxidierten Lipoproteine provozieren eine Entzündungsreaktion, da sie zytotoxisch sind, wobei die entzündliche Aktivität zu einer Mineralisierung führt. Die Rolle der angeborenen und adaptiven Immunität bei der CAVD-Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheit wurde kürzlich hervorgehoben13. Die Aktivierung und klonale Expansion spezifischer Untergruppen von Gedächtnis-T-Zellen wurde bei Patienten mit CAVD und mineralisierten Aortenklappenblättchen dokumentiert, so dass angenommen wird, dass entzündliche Prozesse zumindest an der Entstehung von CAVD und vermutlich auch am Krankheitsverlauf beteiligt sind14. Obwohl Antigen-präsentierende Zellen und Makrophagen sowohl in der gesunden als auch in der erkrankten Klappe vorhanden sind, deutet das Vorhandensein von T-Lymphozyten auf eine gealterte und erkrankte Aortenklappe hin. Dieses lymphozytäre Infiltrat zusammen mit einer Zunahme der Neovaskularisation und Metaplasie sind charakteristische histologische Anzeichen von CAVD15.
Wir stellen die Hypothese auf, dass es eine Wechselwirkung zwischen den Aortenklappen-Interstitialzellen und der Aktivierung des Immunsystems gibt, die möglicherweise die Initiierung eines chronischen Entzündungsprozesses in der Aortenklappe auslöst. Das Assaying von T-Zellen aus stenotischem Aortenklappengewebe könnte ein effizienter Weg sein, um ihre Rolle bei der Verkalkungsentwicklung zu klären, da es eine genaue Darstellung der Aortenklappenzellen in vivo liefern kann. In der vorliegenden Arbeit isolieren wir unter Verwendung von Aortenklappengewebe T-Lymphozyten, kultivieren und klonen sie und charakterisieren sie anschließend mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS). Frische Aortenklappenproben wurden von CAVD-Patienten entnommen, die einen chirurgischen Klappenersatz für schwere Aortenstenose erhielten. Nach der chirurgischen Exzision wurde die frische Klappenprobe in kleine Stücke zerlegt und die T-Zellen wurden kultiviert, kloniert und dann mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Färbeverfahren ist einfach und die gefärbten Röhrchen können mit 0,5% Paraformaldehyd fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden. Die aus dem Färbepanel generierten Daten können verwendet werden, um Veränderungen in der T-Lymphozytenverteilung im Laufe der Zeit in Bezug auf die Intervention zu verfolgen, und könnten leicht weiterentwickelt werden, um Aktivierungszustände spezifischer T-Zell-Untergruppen von Interesse zu bewerten.
Die Extraktion von verkalktem Gewebe, die Isolierung von Leukozyten aus verkalktem Gewebe und insbesondere die Verwendung von Durchflusszytometrie an dieser Art von Gewebe kann aufgrund von Problemen wie Autofluoreszenz eine Herausforderung darstellen. Es gibt nur wenige Publikationen mit Protokollen für diesen speziellen Zweck16,17,18. Hierin stellen wir ein Protokoll vor, das speziell für die direkte Isolierung und Kultur von T-Lymphozyten aus menschlichen Aortenklappenproben entwickelt wurde. Klonale Expansion von Lymphozyten ist ein Kennzeichen der adaptiven Immunität. Die Untersuchung dieses Prozesses in vitro liefert aufschlussreiche Informationen über die Heterogenität der Lymphozyten19. Nach einer dreiwöchigen Inkubationszeit sind die T-Zell-Klone bereit für die Explantation, da aus jedem Klon eine ausreichende Menge an T-Zellen gewonnen wurde, um die phänotypische und funktionelle Untersuchung zu ermöglichen. Anschließend wird der Phänotyp von T-Klonen mittels Zytofluorometrie untersucht.
Dieses immunologische Protokoll ist eine Adaption einer Methode, die zuvor von Amedei et al. zur Isolierung und Charakterisierung von T-Zellen aus menschlichem Gewebe entwickelt wurde und speziell für verkalktes menschliches Gewebe entwickelt wurde, wie in CAVD20,21,22. Das Protokoll hier für die Isolierung von PBMCs (periphere mononukleäre Blutzellen) unter Verwendung von bestrahltem Buffy Coat beschreibt einen effektiven Weg, um Feederzellen (FC) zu erhalten, die speziell auf die Klonphase von T-Lymphozyten eingestellt sind, die aus ventilinterstitiellen Zellen isoliert wurden. Die Feederschicht besteht aus im Wachstum gestoppten Zellen, die noch lebensfähig und bioaktiv sind. Die Rolle von Feederzellen ist wichtig, um das In-vitro-Überleben und das Wachstum von T-Lymphozyten zu unterstützen, die aus Ventil-Interstitialzellen isoliert wurden23. Um die Proliferation von Feederzellen in Kultur zu vermeiden, müssen diese Zellen einen Wachstumsstillstand durchlaufen. Dies kann auf zwei Arten erreicht werden: durch physikalische Methoden wie Bestrahlung oder durch die Behandlung mit zytotoxischen Chemikalien wie Mitomycin C (MMC), einem antitumoralen Antibiotikum, das direkt auf die Kulturoberfläche aufgetragen werden kann24. Hier zeigen wir den Stopp des Feederzellwachstums, der durch Zellbestrahlung erreicht wird.
Diese Methode stellt eine effiziente, kostengünstige Möglichkeit dar, T-Zellen aus Aortenklappengewebe zu isolieren und zu charakterisieren, was dazu beiträgt, das Spektrum immunologischer Methoden zur Erforschung der CAVD-Pathophysiologie zu erweitern.
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Protocol
Die Studie wurde gemäß der Satzung der Charité zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis durchgeführt und die gesetzlichen Richtlinien und Bestimmungen zu Datenschutz und Ethik wurden eingehalten. Die Ethikkommission genehmigte alle Menschenversuche und die Privatsphäre und Anonymität der Patienten wurden in Übereinstimmung mit den auf dem Ethikformular angegebenen Regeln gewahrt.
HINWEIS: Für das unten beschriebene Protokoll wurden frische humanstenotische Klappenproben verwendet.
1. Vorbereitung des Reagenzes
- Bereiten Sie das angereicherte RPMI-Komplettmedium vor, indem Sie RPMI 1640 Medium hinzufügen: Nicht-essentielle Aminosäuren; Natriumpyruvat, L-Glutamin, ß-Mercaptoethanol und Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep). Filtern Sie es vor der Verwendung. Bei +4 °C lagern und innerhalb von zwei Monaten verwenden.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium (CCM) für die Klonierungsphase unter Verwendung des angereicherten RPMI 1640-Gesamtmediums vor, das mit wärmeinaktiviertem fetalem Rinderserum (FBS), HB-Basalmedium, 50 E Interleukin 2 (IL-2) und humanem Serum (HS) versetzt wird. Filtern und verwenden Sie es innerhalb des Tages. Nicht lagern.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium für die Nachsaatphase unter Verwendung des angereicherten RPMI 1640-Komplettmediums mit zugesetztem FBS, HB-Basalmedium, 30 E IL-2 und HS vor. Filtern und verwenden Sie es innerhalb des Tages. Nicht lagern.
- Bereiten Sie den Waschpuffer mit 250 ml RPMI und 5 ml Pen/ Streptokokken vor. Bei +4 °C lagern, innerhalb von zwei Monaten verwenden.
2. Isolierung menschlicher T-Lymphozyten und Kultur in T-25-Kolben
- Legen Sie die stenotische Ventilprobe in eine sterile Petrischale, die mit Wash Buffer gefüllt ist, und stellen Sie sicher, dass die gesamte Ventilprobe damit bedeckt ist. 15 Minuten stehen lassen.
- Schneiden Sie die Stenotikklappe mit einem Skalpell in kleine Stücke und lassen Sie sie wieder für 10 Minuten stehen.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 50 E IL-2 vor, wie zuvor beschrieben, und filtern Sie es.
- Fügen Sie das CCM in die T25-Kolben ein, und legen Sie die Ventilstücke mit einer sterilen Kunststoffzange in die Kolben.
- Lagern Sie die Kolben eine Woche lang in vertikaler Position in einem CO2-Inkubator und achten Sie darauf, den Status des Kolbens unter dem Mikroskop zu beobachten. T-Zell-Klone sollten etwa drei Tage nach dem Kulturschritt sichtbar sein; Zur besseren Beobachtung ist es ratsam, die Kolben vor der mikroskopischen Analyse 20 Minuten lang in horizontale Position zu stellen.
ANMERKUNG: Die Menge des Zellkulturmediums hängt von der Menge der vorhandenen Probe und davon ab, wie viele T25-Kolben verwendet werden. In Anbetracht der Tatsache, dass jedes Ventilstück 10 ml CCM in einem Kolben benötigt, sind 25 ml CCM in einem T25-Kolben für 3 Ventilstücke geeignet.
3. Klonphase
HINWEIS: Für die Klonphase von T-Zellen ist es notwendig, mit der Isolierung von Feederzellen aus einem bestrahlten Buffy Coat (BC) nach dem PBMCs-Protokoll zu beginnen.
- Öffnen Sie den BC-Beutel unter der Laminar-Flow-Haube mit dem Beutelspike mit nadelfreiem Ventil und geben Sie 50 ml Blut in einen T150-Kolben. Fügen Sie 70 ml PBS hinzu, um das Blut im Kolben zu verdünnen.
- Nehmen Sie vier konische 50-ml-Röhrchen und geben Sie jeweils 20 ml Dichtegradientenmedium hinein und schichten Sie vorsichtig 30 ml Blut darüber.
- Zentrifuge für 25 min bei 800 x g und 20 °C bei ausgeschalteter Bremse.
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und entsorgen Sie ihn als Abfall. Sammeln Sie den PBMCs-Ring in einem neuen konischen 50-ml-Röhrchen und fügen Sie die PBS-Lösung bis zu einem Volumen von 50 ml hinzu.
- Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 20 °C.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet, indem Sie die PBS-Lösung bis zu einem Volumen von 50 ml hinzufügen. Wiederholen Sie die Zentrifugationsphase für 10 min bei 400 x g und 20 °C.
- Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die FCs in 10 ml Zellkulturmedium.
- Nehmen Sie ein neues Auffangröhrchen und verdünnen Sie die FCs mit PBS 1:10, indem Sie 9,9 ml PBS und 100 μL aus dem Röhrchen mit FCs und Zellkulturmedium hinzufügen. Mit einer Pipette gut ausspülen und 7 μL aus dieser Verdünnung entnehmen und die Zellen unter dem Mikroskop zählen.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium für die Klonierungsphase vor: 70 ml mit 50 E IL-2 und teilen Sie es dann in zwei konische 50-ml-Röhrchen auf, wobei jedes Röhrchen 25 ml Zellkulturmedium enthält, wie unten beschrieben:
- Röhrchen 1: 25 ml CCM + FCs + 0,6% Phytohämagglutinin (PHA)
- Röhre 2: 25 ml CCM + T-Lymphozyten
ANMERKUNG: Das Ziel der PC-Methode ist es, 2 x 106 Zellen für jeden ml zu erhalten, so dass die 25 ml ccm hergestellten CCM (Rohr 1) entsprechend berechnet werden müssen. Die allgemeine Formel lautet: Anzahl der gezählten Zellen x 106: 1 ml = CCM x 106: X
4. T-Lymphozyten-Kultur in Multiwell-Platten
- Sammeln Sie mit der elektronischen Pipette das gesamte Zellkulturmedium in den Kolben und übertragen Sie es in ein 50 ml erisches Rohr. Die leeren Flaschen können weggeworfen werden.
- Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 400 x g und 20 °C.
- Den Überstand entsorgen, das Pellet in 50 ml PBS suspendieren und die Zellen durch Zentrifugation für 10 min bei 400 x g und 20 °C sammeln. Wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml CCM. Nehmen Sie 7 μL aus dieser Verdünnung und zählen Sie die Zellen unter dem Mikroskop.
HINWEIS: Die Anzahl der gezählten Zellen muss für das Volumen der Kammer und für die aufgetragene Verdünnung multipliziert werden. - Verdünnen Sie die gezählten Zellen von 105 bis 103 im Zellkulturmedium und nehmen Sie dann 500 μL von 103 und legen Sie sie in das Röhrchen 2.
- Gießen Sie das 25 ml Zellkulturmedium von Tube 1 in eine 100 mm x 15 mm große Kunststoff-Petrischale.
- Nehmen Sie vier 96-HE-Boden-Multiwellplatten und verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, die in jedem Bohrloch auf 100 μL Seed FCs eingestellt ist.
- Nehmen Sie die Tube 2 und gießen Sie das Zellkulturmedium in eine Petrischale. Mit einer Mehrkanalpipette, die auf 100 μL eingestellt ist, samen T-Zellen in jedem Bohrloch.
- Lagern Sie die Multiwell-Platten eine Woche lang in einem CO2-Inkubator.
5. Erste Nachbearbeitungsphase
- Befolgen Sie mit einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel die PBMCs-Methode, um FCs zu erhalten, wie in der vorherigen Methode beschrieben.
- Bereiten Sie die passende Menge CCM ohne PHA vor und filtern Sie sie.
- Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette 100 μL aus jeder Vertiefung und stellen Sie sicher, dass der Boden des Bohrlochs nicht berührt wird.
- Fügen Sie 100 μL FCs in alle Vertiefungen als Fütterungsschicht hinzu, um Zellkulturnährstoffe bereitzustellen und das Medium zu wechseln.
HINWEIS: Für jedes Multiwell wird empfohlen, 6 ml CCM in Betracht zu ziehen, so dass die empfohlene Menge für 4 Multiwells etwa 30 ml beträgt. PHA (0,4% der gesamten CCM-Menge) muss alle zwei Wochen zum CCM hinzugefügt werden.
6. Zweite Nachschubphase
- Wiederholen Sie die Nachsaatphase nach der oben beschriebenen Passage. 0,4% PHA müssen dem Zellkulturmedium zugesetzt werden.
7. Erste Spaltungsphase von 1 Bohrloch/Probe zu 2 Vertiefungen/Probe
- Überprüfen Sie alle vier Multiwells unter dem Mikroskop und teilen Sie diese Wells mit T-Zell-Klonen (TCCs) auf.
- Befolgen Sie das PBMCs-Protokoll, um Feederzellen aus einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel zu isolieren.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 30 U IL-2 vor. Fügen Sie die FCs hinzu und nehmen Sie eine neue 96-Well-Multiwell-Platte mit U-Boden.
- Spülen Sie mit einer Pipette, die auf 100 μL eingestellt ist, gut in die Vertiefungen der ausgewählten Proben und teilen Sie das in jedem Bohrloch enthaltene Volumen von 200 μl in 2 neue Vertiefungen der neuen Multiwell-Platte auf, um 100 μL Volumen für jedes der neuen 2 Bohrlöcher zu haben.
- Fügen Sie 100 μL FCs in alle neuen Vertiefungen hinzu. Jede Vertiefung muss ein Gesamtvolumen von 200 μL enthalten.
- Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und geben Sie 100 μL in zwei zusätzliche Vertiefungen, die nur FCs enthalten, die als Kontrolle dienen.
HINWEIS: Verwenden Sie Lichtmikroskopie, um alle Multiwell-Platten zu beobachten, um festzustellen, welche Wellen erfolgreich TCC gewachsen sind. Um die Auswahl der Klone zu erleichtern, kann ein Vergleich mit dem Steuerelement (die beiden Vertiefungen enthalten nur FCs) durchgeführt werden, wobei der Klon im Vergleich zum Steuerelement dunkler und größer erscheint. Die zu wählenden Vertiefungen sind diejenigen mit einem großen, klaren, runden Klon mit dicht gepackten Lymphozyten. Wenn nach zwei Wochen Nachfütterung keine TCCs vorhanden sind, wird empfohlen, eine weitere Woche zu warten und eine zusätzliche Nacheeding-Phase durchzuführen.
8. Zweite Spaltungsphase von 2 Bohrlöchern/Probe zu 4 Vertiefungen/Probe
- Stellen Sie die Pipette auf 100 μL, spülen Sie gut in die beiden Vertiefungen jeder Probe und säen Sie zwei neue Vertiefungen von 100 μL für jede Probe.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium mit 30 U IL-2 vor und befolgen Sie die PBMCs-Technik, um die FCs aus dem Buffy-Coat-Beutel zu extrahieren und die FCs in das CCM zu legen.
- Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und säen Sie die FCs in alle Vertiefungen. Lagern Sie die Multiwells für eine Woche in einem CO2-Inkubator.
9. Dritte Spaltungsphase von 4 Bohrungen/Probe zu 8 Vertiefungen/Probe:
- Mit einer Mehrkanalpipette, die auf 100 μL eingestellt ist, spülen Sie gut in alle vier Vertiefungen jeder Probe und säen Sie 100 μL in jede der vier neuen Vertiefungen in einer neuen 96-Well-Platte.
- Bereiten Sie das Zellkulturmedium vor und folgen Sie der PBMCs-Technik, um die FCs aus einem bestrahlten Buffy-Coat-Beutel zu extrahieren.
- Platzieren Sie die FCs im CCM. Stellen Sie die Pipette auf 100 μL und säen Sie die FCs in alle Vertiefungen. Lagern Sie die Multiwells für eine Woche in einem CO2-Inkubator
10. Zytofluorimetrische Analyse
- Nehmen Sie die Multiwellplatte mit der ältesten Datierung aus dem CO2-Inkubator und identifizieren Sie die Sammelröhrchen mit den zu analysierenden Probennummern.
- Mit einer mehrkanaligen Pipette, die auf 200 μL mit 2 Spitzen eingestellt ist, spülen Sie gründlich in zwei Vertiefungen derselben Probe und legen Sie beide in dasselbe Sammelrohr. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Beispiele.
HINWEIS: Die FCs-Proben werden nicht analysiert, da sie nur als Kontrollen dienen.
11. Antikörper-Färbepanel-Vorbereitung für die zytofluorimetrische Analyse
- 1 ml PBS-Lösung für jedes Röhrchen und jede Zentrifuge für 10 min bei 400 x g und 20 °C zugeben.
- Nach der Zentrifugationsphase den Überstand verwerfen.
HINWEIS: Das Antikörper-Färbepanel befindet sich in Tabelle 1. Jede einzelne berechnete Antikörperkonzentration beträgt etwa 2 μL/Probe. Es wird empfohlen, die Antikörperröhrchen vor Gebrauch kurz zu drehen. Um die fluorophorkonjugierten Antikörper vor Licht zu schützen, sollten alle Schritte im Dunkeln durchgeführt werden. - Bereiten Sie die Antikörpermischung in einem 1,5 ml Röhrchen vor und wirbeln Sie sie.
- Fügen Sie die Antikörper in den Proben hinzu und lassen Sie die Proben 15 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubieren.
- In jede Probe 1 ml PBS geben und 10 min bei 400 x g und 20 °C zentrifugieren.
- Entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet mit 500 μL PBS-Lösung.
- Fahren Sie mit der zytofluorimetrischen Analyse fort (FACS-Analyse, Tabelle 1).
HINWEIS: Die gefärbten Proben können mit 0,5% Paraformaldehyd (PFA), verdünnt in PBS-Lösung, fixiert und bis zu 15 Tage später analysiert werden.
ACHTUNG: PFA ist giftig und muss vorsichtig gehandhabt werden.
| Markierung | Fluorophor |
| CD3 | PE/Cy7 |
| CD4 | Alexa Fluor 488 |
| CD8 | Leuchtend violett 510 |
| CD14 | Leuchtend violett 421 |
| CD25 | PE |
| CD45 | Brillantes Violett 711 |
Tabelle 1. Antikörper-Färbepanel zum Nachweis der T-Lymphozyten-Population bei Verkalkungs-Aortenklappenerkrankungen.
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Representative Results
Wir verwendeten eine einfache und kostengünstige Methode, um die Leukozytenpopulation von frischen Aortenklappenproben von menschlichen Patienten mit schwerer Aortenklappenstenose zu charakterisieren (siehe Protokoll). Die Methode zur Isolierung von PBMCs ist ein wichtiger Schritt bei der Gewinnung von Feederzellen, die in jedem Schritt des Experiments (Klonierungs-, Nachfütterungs- und Spaltungsphasen) verwendet werden und den Nachweis und die Charakterisierung infiltrierender Leukozyten in Aortenklappenproben ermöglichen. Die wichtigsten Schritte dieser Methode sind in Abbildung 1 dargestellt.
Abbildung 1. FCs Isolierung von Buffy Coat. (A) Blutschicht über Dichtegradient Medium (B) Ring weißer Blutkörperchen, der nach Zentrifugation gewonnen wurde (C) Weiße Blutkörperchen, die in PBS-Lösung gesammelt und resuspendiert wurden (D) Weiße Blutkörperchen unter Lichtmikroskopie beobachtet Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Nach zwei Wochen Inkubation klonten und züchteten wir erfolgreich eine T-Zell-Population, wie in Abbildung 2 gezeigt.
Abbildung 2. T-Zell-Klon nach zwei Wochen Inkubation, beobachtet mit Lichtmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3 veranschaulicht das Gating-Schema, das für die Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei Patienten mit CAVD verwendet wird. Wie aus dem Ergebnis der FACS-Analyse hervorgeht, gibt es mehr CD4+ T-Zellen (43,032%) als CD8+ T-Zellen (1,079%).
Abbildung 3. Gating-Schema, das für die T-Zell-Subpopulationsanalyse verwendet wird. (A) Es wurde ein Tor angebracht, um die spezifische T-Zell-Population in einer stenotischen Klappe zu identifizieren. (B) CD14-negative Lymphozyten und CD3-positive Lymphozyten. (C) CD3-Lymphozyten sind gated, um CD4+ T-Zellen von CD8+ T-Zellen zu unterscheiden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Um zu zeigen, dass die gleichen T-Zell-Marker sowohl in nativen Ventilproben als auch in geklonten Proben vorhanden sind, führten wir eine FACS-Analyse ohne die Klonierungsphase durch, wie in Abbildung 4 dargestellt.
Abbildung 4. FACS-Analyseergebnisse von zwei Ventilproben. Wir verglichen die T-Zellen, die aus einer nativen Ventilprobe und einer geklonten Probe gewonnen wurden, und bestätigten, dass die T-Zellen, die in der nativen Klappe gefunden wurden, spezifische Marker der T-Zellen im endgültigen geklonten Produkt teilen. (A) FACS-Ergebnisse einer nativen Klappenprobe ohne Klonphase. B) FACS-Ergebnisse der nach der Klonphase analysierten Ventilprobe. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der gesamte Arbeitsablauf ist in Abbildung 5 zusammengefasst, beginnend mit der Dissektion der menschlichen Aortenklappe bis hin zur FACS-Analyse. Alle Schritte sind für die Analyse einer Aortenklappenprobe erforderlich. Phase 1 zeigt die Lymphozytenisolierung aus stenotischem Aortenklappengewebe. Die Ventilproben müssen geschnitten und in eine mit Waschpuffer gefüllte Petrischale gegeben werden. Die Ventilstücke können in einen mit CCM gefüllten T25-Kolben gelegt und eine Woche lang in einem CO2-Inkubator gelagert werden. Phase 2 zeigt die Klonphase, die aus zwei Teilen besteht: 1) FCs Isolierung aus bestrahltem Buffy Coat Bag und 2) T-Zellen Klonierungsphase und gipfelt mit der Zellkultur in einer 96-Wells Multiwell Platte, die in einem CO2-Inkubator für eine Woche gelagert wird. Die Phasen 3 und 4 bestehen aus der Nachfütterungsphase unter Verwendung von FCs aus bestrahltem Buffy-Fell; diese Phase muss für zwei aufeinanderfolgende Wochen wiederholt werden. Die Phasen 4, 5 und 6 zeigen die Spaltungsphase von T-Zell-Klonen; die erste Spaltungsphase ist von 1 Vertiefung/Probe zu zwei Vertiefungen für jede Probe in einer neuen Multiwell-Platte; die zweite Spaltung erfolgt von 2 Vertiefungen / Probe zu 4 Vertiefungen für jede in derselben Multiwell-Platte; Die dritte und letzte Spaltphase reicht von 4 Vertiefungen/Probe bis 8 in einer neuen Multiwell-Platte. Phase 7 ist die letzte Phase, in der die Proben mittels FACS-Analyse analysiert werden.
Abbildung 5. CAVD Experimenteller Arbeitsablauf. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Aus den vorläufigen Ergebnissen (Abbildung 2) können wir schließen, dass Lymphozyten zusammen mit CD45+ Leukozyten in verkalkten Aortenklappen vorhanden sind, was darauf hindeutet, dass die kalzikische Aortenklappenerkrankung mit der Aktivierung des Immunsystems und der Entzündungsaktivität verbunden ist.
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Discussion
Hier stellen wir eine Methode zur Charakterisierung von T-Lymphozyten-Subpopulationen vor, die aus stenotischen Aortenklappenproben isoliert wurden, mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode erfordert die Verwendung von bestrahltem Buffy Coat, um die PBMCs zu isolieren. Die Strahlungsfrequenz, der die Buffy-Coat-Beutel ausgesetzt werden müssen, beträgt 9000 Rad/90 Gray (Gy) und stellt einen entscheidenden Schritt dar, um die Proliferation der Feederzellen zu stoppen. Die Rolle der aus den Buffy-Coat-Beuteln isolierten Zellen besteht darin, nur als Feederzellen zu fungieren und Nährstoffe für die aus den Ventilen isolierten T-Zellen bereitzustellen. Die Verwendung einer unbestrahlten Buffy-Manteltasche würde die Verbreitung von PBMCs in der Kultur fördern, wie in der Vergangenheit festgestellt wurde25. Eine Strahlungsfrequenz unter 90 Gy zeigte pbMCs Proliferation in Kultur, daher empfehlen wir, genau 90 Gy Strahlung zu verwenden. Bemerkenswert ist, dass es ratsam ist, das am selben Tag oder höchstens am nächsten Tag bestrahlte Buffy-Fell zu verwenden und es auf einem Gerät aufzubewahren, das es in ständiger Bewegung hält. Ein weiterer entscheidender Schritt dieser Methode könnte die Lymphozytenklonierungsphase darstellen, die durch Artefakte beeinflusst werden könnte; Um dieses Ereignis zu vermeiden, führen wir das FACS an frischen Aortenklappenproben durch. Die Klonierungsphase von T-Lymphozyten hat den Vorteil, dass eine größere Anzahl von T-Klonen (durchschnittlich 15 T-Zell-Klone für jedes Ventil) erhalten wird, die phänotypisch und funktionell analysiert werden, als die Anzahl, die aus der Analyse einer frischen Probe gewonnen wird. Die Klonierungstechnik wird von dieser Forschungsgruppe seit vielen Jahren angewendet und je nach Art des analysierten Gewebes war das Lymphozytenprofil unterschiedlich21,26,27. Die erste Passage der Methode betrifft die T-Zell-Isolierung von einer stenotischen Aortenklappe. Alle beschriebenen Schritte müssen unter sterilen Bedingungen unter einer Laminar-Flow-Haube durchgeführt werden, und es wird dringend empfohlen, alle Materialien vor dem Gebrauch zu desinfizieren. Die Zeit, die benötigt wurde, um Ergebnisse zu erhalten, betrug 6 Wochen und der Durchschnitt der T-Lymphozytenzellen, die aus der Klonierungsphase gewonnen wurden, betrug 20 x 106 Zellen. Die Überwachungsphase der Multiwellplatten ist sehr wichtig und darf nicht übersehen werden. Eine Änderung der Farbe des Mediums in Gelb könnte eine bakterielle Kontamination darstellen, in diesem Fall müssen alle verwendeten Instrumente sterilisiert und die Multiwell-Platten weggeworfen werden.
Vor der FACS-Analyse ist es wichtig, ein geeignetes Gate zu etablieren, um sicherzustellen, dass es keine spezifische Überlappung zwischen den Antikörperkanälen gibt. Dies ermöglicht die optimale Trennung zwischen positiven und negativen Gattern. Die Verwendung der gleichen Chargen von Antikörpern für alle an der Studie beteiligten Proben wird empfohlen, um ein homogenes Ergebnis zu erzielen. Es ist auch notwendig, die fluorophorkonjugierten Antikörper vor Licht zu schützen und alle Schritte bei ausgeschaltetem Licht durchzuführen.
Diese Methode ist effektiv, um Ergebnisse mit hoher Reproduzierbarkeit zu erzielen und ist nicht teuer. Eine Einschränkung dieser Methode ist die geringe Stichprobengröße aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit der menschlichen Klappenproben sowie das Fehlen einer Kontrollgruppe.
Die vorläufigen Ergebnisse unterstützen die Rolle der adaptiven Immunität als entscheidendes Element bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der kalzifischen Aortenklappenerkrankung. Alle Patienten, die an dieser Studie teilnahmen, hatten die Diagnose einer schweren symptomatischen kalzifischen Aortenstenose mit einem Durchschnittsalter von 70 Jahren, meist männlich. Die Existenz von T-Zell-Populationen in den analysierten Aortenklappen liefert Hinweise auf die Entzündungsaktivität der erkrankten Aortenklappe als Checkpoint der Immunzellaktivierung. Ein Punkt von zukünftigem Interesse könnte sein, die Funktionalität von CAVD-infiltrierenden T-Zellen zu analysieren und die T-Zell-Spezifität zu charakterisieren, wie sie zuvor bei ähnlichen Krankheiten wie Atherosklerose berichtet wurde28,29,30.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Alle für dieses Protokoll verwendeten Mantelbeutel wurden dank der Verfügbarkeit von Dr. Peter Rosenthal, Dr. Dirk Böhmer und dem gesamten Team der Radiologie der Charité Benjamin Franklin bestrahlt. Stipendiatin/Mary Roxana Christopher, diese Arbeit wird durch ein Stipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie (DGK) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL plastic syringes | Fisherbrand | 9000701 | |
| 96- well U- bottom Multiwell plates | Greiner Bio-One | 10638441 | |
| Bag Spike (needle free) | Sigma | P6148 | Dilute to 4% with PBS |
| CD14 Brilliant violet 421 | Biolegend | 560349 | |
| CD25 PE | Biolegend | 302621 | |
| CD3 PE/Cy7 | Biolegend | 300316 | |
| CD4 Alexa Fluor 488 | Biolegend | 317419 | |
| CD45 Brilliant violet 711 | Biolegend | 304137 | |
| CD8 Brilliant violet 510 | Biolegend | 301047 | |
| Eppendorf tube 1.5 mL | Eppendorf | 13094697 | |
| Eppendorf tube 0.5 mL | Thermo Scientific | AB0533 | |
| Falcon 15 mL conical centrifuge tube | Falcon | 10136120 | |
| Falcon 50 mL conical centrifuge tubes | Falcon | 10788561 | |
| Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes | BD | 2300E | |
| Fast read 102 plastic counting chamber | KOVA INTERNATIONAL | 630-1893 | |
| Filters for culture medium 250 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 168-0045 | |
| Filters for culture medium 500 mL | NalgeneThermo Fisher Scientific | 166-0045 | |
| HB 101 Lyophilized Supplement | Irvine Scientific | T151 | |
| HB Basal Medium | Irvine Scientific | T000 | |
| Heat-Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum) | Euroclone | ECS0180L | |
| HS (Human serum) | Sigma Aldrich | H3667 | |
| Human IL-2 IS | Miltenyi Biotec | 130-097-744 | |
| L-Glutamine | Gibco | 11140050 | |
| Lymphoprep | Falcon | 352057 | |
| Non-essential amino acids solution | Sigma | 11082132001 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 10538931 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070063 | 10000 U/mL |
| PHA (phytohemagglutinin) | Stem Cell Technologies | 7811 | |
| Plastic Petri dishes | Thermo Scientific | R80115TS | 10 0mm x 15 mm |
| RPMI 1640 Media | HyClone | 15-040-CV | |
| Sodium pyruvate | Gibco by Life technologies | 11360070 | |
| Syringe Filters 0,45µl | Rotilabo-Spritzenfilter | P667.1 | |
| T-25 Cell culture flasks | InvitrogenThermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| T-75 Cell culture flask | Thermo Fisher Scientific | 10232771 | |
| β- Mercaptoethanol | Gibco | A2916801 |
References
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