Summary
私たちは、血漿/血清学的検査のために採取した全血からゲノムDNAを単離する新たな方法を説明しています。血漿採取した後、圧縮された血液は、通常廃棄されます。当社の新規の方法は、既存の方法に比べて大幅な改善を表し、追加の血液を要求せず、単一のコレクションからのDNAやプラズマを利用できるようになります。
Abstract
臨床検査は、血液の細胞または流体部分に行うことができる。別の採血管を使用することにより分析することができる血液（全血、血漿または血清）の一部を決定する。人間の疾患の遺伝的基礎を研究に携わる研究所は、ゲノム/遺伝子解析のためのDNAの供給源としてEDTA含有バキュテナーに収集凝固処理全血に依存しています。ほとんどの臨床検査室は、表現型のアウトカム調査の最初のステップとして、生化学的、血清学的およびウイルスのテストを実行するため、抗凝固処理血液もヘパリン含有チューブ（プラズマチューブ）に集められる。したがってDNAプラズマがゲノムおよびプロテオミクスデータの両方の同時並列分析のために必要とされる場合には、EDTAおよびヘパリンチューブの両方に血液を採取するのが通例である。血液は単一の管に収集し、血漿とDNAの両方の原因となることができれば、その方法は、既存のメタへ前進であると考えられるODS。プラズマ抽出後の圧縮された血液の使用は、このように処理された血液試料の量を最小化し、各患者から必要なサンプル数を減らすこと、ゲノムDNAの代替供給源を表す。これは、最終的に時間とリソースを節約できるでしょう。
血漿タンパク質保存用BD P100血液採取システムは、ヒト血液から良好なタンパク質バイオマーカーの発見およびプロテオミクス実験を可能にし、血液のタンパク質含有量を安定させるために、前の血漿または血清採血管1よりも改善された方法として作成された。 BD P100管は、15.8、噴霧乾燥K2EDTA mlの凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。また、遠心分離後、血漿および細胞ペレット間の物理的障壁を提供する機械的なセパレータを含む。いくつかの方法は、凝固した血液のsaからDNAを抽出するために考案されているmples古いプラズマチューブ2-4に収集。これらのメソッドからの課題は、主にチューブ（ゲル·セパレータ）の内部セパレータの種類に関連付けられており、凝固した血液の回収が困難である、断片化や血栓を分散させるの不便さ、および分離ゲルによって血栓抽出の閉塞を含まれていた。
私たちは、新しいBD P100チューブに採取した血液からゲノムDNAを抽出し、浄化する最初の方法を提示する。私たちは、P100のチューブからEDTA管からそれにDNAサンプルの品質を比較。我々のアプローチは、シンプルかつ効率的である。 2）機械的なセパレータの除去は、スクロースとの組み合わせを使用して、採血のための機械的なセパレータをプラズマBD P100（BD診断、スパークス、MD、USA）管の1）を使用する：これは、次の4つの主な手順が含まれ無菌クリップ金属フック、3）及び4白血球を含むバフィーコート層の剥離）からのゲノムDNAの単離軟膜は、通常の商業的なDNA抽出キット又は類似の標準プロトコルを使用する。
Protocol
1。試料捕集
- 適切なインフォームドコンセントを持つ個人からの血液サンプルを収集します。個々については、P100チューブ（BD診断、フランクリン湖、NY、USA）への血液4〜を5ml描く。比較のために、同時にEDTAチューブに血液を採取。
- BD P100管は15.8ミリリットル、噴霧乾燥K2EDTAおよび凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。彼らはまた、機械的な区切り文字を含んでいます。処理が発生するまで、全血を採取した後、一晩、60分間室温で両方のチューブを保持する。
- 室温で15分間、2500グラムでBD P100チューブを遠心する。マイクロ遠心チューブにメカニカルセパレーターの上に採取した血漿を転送します。
- -80℃で、セパレーターの下に圧縮血を含む、P100チューブを保管°Cあなたは、DNA内線を開始する準備が整うまでraction。
P100管の血（P100_DNA）から2.1
- P100チューブを-80℃で保存するプラズマ抽出後のC。 3から4ヶ月以内に、5分（ 図1A）のための水浴中で37℃でフリーザーや解凍から圧縮された血液を含むP100チューブを取り出す。セパレーターの上に座って任意の残留プラズマを削除します。セパレーター上記P100チューブ（ 図1B）で- 17％ショ糖溶液（未発表データ社内でテスト勾配溶液）2 mlを加え。 2500グラムで20分間室温で遠心する、このプロセスは、チューブの頂部に機械的なセパレータをプッシュし、軟膜（ 図1C）を含む溶液の三層が得られる。手動steriledフック金属クリップ（ 図1D）を使用して区切り文字を抽出します。
- 各チューブ（ 図1D）から機械的な区切り文字を取得した後、削除してdiscarDトップ蔗糖層。無菌の15ミリリットルコニカルチューブに、バフィーコート（BC）層を表す中間層を、転送します。 3ミリリットルの軟膜の量を増加させるためにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を追加します。メーカーの推奨に従ってキアゲンプロトコールとトラブル血キットの試薬を用いてバフィーコートからDNAを抽出し、2500グラムの遠心速度（代わりに2000グラムの）を除いて。
- 赤血球（RBC）を溶解して除去するために、バフィーコートの3 mlにRBC溶解9mlのを追加します。インキュベーション中時折反転と10分間、各チューブを室温で数回とインキュベートを反転。 5分間2500グラムで、それぞれの混合をスピンダウンし、上清を捨てる。 15秒のために細胞溶解液と渦の3mlで各チューブの残りのペレットを扱う。 15秒のためのタンパク質の沈殿溶液と渦の1mlで溶解液を扱う。
- 5分間2500グラムで遠心し、含有する新鮮な15ミリリットルコニカルチューブに上清を移す100％イソプロパノールを3ml。 3分間2500グラムで新しいチューブを10回と遠心分離機を反転。上清を捨て、70％エタノール1 mlを加える。 DNAペレットを取り除くと洗浄するコニカルチューブを数回反転させる。 1分間2500グラムで遠心。ペレットを室温で3分間（逆さまにチューブを配置）するために乾燥させた後、37℃で補水液250mlでDNAを中断℃で10分間、プレラベル1.7ミリリットルマイクロチューブへの転送のためのC。 -80℃でチューブを保管°Cを使用するまで。
EDTA Ttubeの血（EDTA_DNA）から2.2
- ルーチン免疫血液学試験のための全血をK 2 EDTAの10.8ミリグラムでスプレーコーティングし、-80℃で保存プラスチックvaccutainerチューブに集められ管は機械的な区切りが含まれていないため、DNA抽出は、機械的なセパレーター（2.1.1および2.1.2）を含む手順は含まれていません。
- 血液貯蔵、DNの3から4ヶ月以内カワセミフレックス（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、MA、USA）を使用して抽出される。これは、磁性粒子技術に基づく自動化DNA抽出システムであり、細胞溶解/ DNA結合、数回の洗浄工程およびDNAの溶出で構成されている。
- DNA抽出に使用されるキットはカワセミフレックス24 DNA血液キット（Qiagen、ドイツ）である。
3。 DNA量と品質評価
ゲノムDNAの量、品質および完全性をピコグリーン、分光法及び電気泳動を含む方法の組み合わせにより評価した。
- ゲノムDNAの濃度は、ナノドロップし、ピコグリーン定量化によって決定される。
- 純度は、光度計、分光光度計での吸光度比260/280の測定値から決定される。
- 試料（500ngの）も、DNAの完全性（分解）を評価するために、1％アガロースゲル上にロードされている。
4。 Genotypinグラムアッセイおよび品質管理
- 五P100_DNAとそれに対応するEDTA_DNAサンプルをランダムにカスタムImmunochip（DNA免疫分析ビーズチップ）を使用して、さらなる分析のために選択される。 Immunochipは196524多型を含むのInfiniumジェノタイピングチップで、免疫遺伝学的研究の5のために設計されています。
- 各サンプルについて、200ngのDNAが増幅され、断片化され、沈殿させ、適切なハイブリダイゼーション緩衝液に再懸濁した。
- 変性した試料は、16時間の最低48℃でImmunochipsにハイブリダイズさせる。
- ハイブリダイゼーション後、Immunochipsは、一塩基伸長反応で染色のために処理される。
- immunochipsその後イルミナHiscanビーズアレイリーダーと正規ビーズ強度データはイルミナGenomeStudioソフトウェアにロードされ、遺伝子型に変換され、使用して結像される。遺伝子型はGenomeStudioのautocallingアルゴリズムを使用して呼び出されます。における品質管理コールレート<95％と一塩基多型の除外（のSNP）をvolves。
- SNPコールレートはimmunochipアッセイ効率の尺度として使用される。これは、自動化された遺伝子型の割り当てを受信するのに十分な信号強度及び品質を実現チップ（各チップにエンコードされた196524個のSNP）に関するアッセイの総数の百分率として算出される。高品質のDNAは、（260/280の比が1.8以上、劣化の有無）immunochipアッセイに含まれるハップマップコントロールDNAと少なくとも同じコール·レートを達成するために期待されている。品質管理コールレート<95％の各データセット内でのSNPの排除を伴う。
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Representative Results
DNAの品質評価と濃度測定
P100_DNAsの収率はEDTA_DNAsのもの（ 表1、表2）よりも有意に低かった。その吸光度比260/280の値で表されるDNAの純度はP100_DNAとEDTA_DNAサンプルセット（ 表1および2）の両方に類似している。光スミア（ 図2）によって示されるように、いくつかの劣化が、EDTA_DNA試料中に見られるが、DNAの品質は、サンプルの各セット内でかなり均一である。劣化のより多くの兆しを見せEDTA_DNAsも減少DNA濃度を示した。
遺伝子型決定
EDTA_DNAsとP100_DNAsの両方の遺伝子型コールレートを比較した。彼らは同じような通話料金をもたらし、両内部ハップマップコントロールDNA（ 表3）に匹敵した。
図1。バフィーコート分離。
表1。 DNAサンプルの収率（ピコグリーン）と比（光度）。
| DNA収量 | DNA純度 | |||
| サンプル | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
| P値 | P = 0.00221 | P = 0.09836 | ||
表2。収率および純度の比較（両側、対標本t検定）。
| ジェノセル·レート | ||
| サンプル | P100 | EDTA |
| 1 | 97.9 | 97.5 |
| 2 | 97.9 | 97.8 |
| 4 | 97.4 | 97.5 |
| 7 | 97.5 | 98.2 |
| 8 | 97.9 | 98 |
| P値 | P = 0.67970 | |
表3。ジェノタイピングコールレート（両側、対標本t検定）。
| サンプル | 層 | 収量（μgの） | 比（280分の260） |
| 軟膜 | 150 | 1.86 | |
| RBC | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | 軟膜 | 139 | 1.74 |
| RBC | 1.00 | 1.70 | |
| P100_08 | 軟膜 | 118 | 1.87 |
| RBC | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | 軟膜 | 51 | 1.87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
付録。赤血球（RBC）層で見つかったDNAの量を評価する。
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Discussion
多くの人間の病気は、遺伝的な原因があり、人間の病気の遺伝的基礎を探求することは増加高品質のDNAが求められます。遺伝学的研究に使用されるDNAの最も一般的な原因は、全血を抗凝固される。ほとんどの臨床検査室では、生化学的な血清学、および表現型アウトカム調査の最初のステップのようなウイルスのテストを実行するので、血液がしばしばプラズマチューブに集められる。血漿の採取後、圧縮された血液は、多くの場合、破棄されます。したがって、DNA、遺伝子研究やテストを行うために必要とされる場合、追加の採血は、同じ患者から必要とされる。それは白血球が含まれているとして廃棄圧縮された血液はDNAの潜在的なソースを表す。したがって、プラズマチューブから圧縮された血液を使用すると、余剰の血を引くか、追加の血液のために患者をリコールする必要なく、より効率的に採取した血液サンプルを使用する機会を提供しています。
元に様々な方法圧縮された又は凝固した血液の白血球からのDNA管は6-10報告されている。これらの方法の課題のほとんどは、プラズマ収集管の設計と関連していた。前の血漿採集管が遠心分離、ゲル（ジェルセパレータ）からなるセパレータを含有し、プラズマからの血液細胞（セパレータの下に閉じ込められた）（セパレータ上にある）を分離するためのバリアを形成した。ゲル材料と血液細胞の汚染を防止するために、セパレータは、第注意深く管11から除去しなければならない。これは、効率的なDNA抽出を保証するために、血餅の断片化が続く。細分化プロセスは、多くの場合、血液サンプルの有意な損失およびDNAの収率の低下をもたらす。サンプルのロスを最小限に抑え、プロセスを改善するために、小孔のメッシュが機械的に小片12内に血栓を分散していたが、断片化依然として影響を受けたDNAの収量、品質およびeしたVENは、技術者13に健康被害を構成した。
BDバイオサイエンスからBD P100管は多免疫調査研究14で評価血漿採取管の最新世代である。以前のプラズマチューブと同様に、これらは血漿タンパク質を安定化させる凝固およびプロテアーゼインヒビターを防止するために抗凝固剤を含有する。 BD P100管の主要な技術革新は、各チューブ内の機械的な区切り（しないゲルセパレーター）に常駐します。メカニカルセパレーターも遠心分離後血漿および細胞ペレットの間に物理的な障壁を提供していますが、ゲルの区切りとは異なり、ゲルによる試料汚染の危険性を提供しない。本研究で適用されたプロトコルは、断片化が含まれていないので全く健康被害の危険性はありません。
DNAは、（DNAの抽出を参照）市販のキットプロトコルを使用して、バフィーコートから抽出した。 BD P100チューブ内の圧縮された血液がcryopあったDNA抽出の前に、3〜4ヶ月の期間のために確保。 EDTAチューブ（EDTA_DNA）から抽出したDNAは、対応するP100_DNAの収率および品質の評価における対照として使用した。以前の研究12,13,15から、EDTA_DNAサンプルの収率は、以前のプラズマチューブの血液からDNAのそれより有意に高かった。本研究では、それぞれの患者から採取し、同量の全血のために、圧縮された血液のバフィーコートが少なく、DNAを（ 表2、P = 0.00221）を得た。新しいP100プラズマチューブ内の血液からのDNA抽出時には、バフィー海岸からいくつかの白血球は、赤血球層に失われます（下記参照）が、DNAのわずかな量を表している軟膜（付録を参照してからのものに比べテーブル）。 EDTA_DNAsで見られる収量の変動はまたP100_DNA、それが依存するサンプルであることを示唆して模倣されています。高いボリュームのあるサンプルは、通常以上のDNAとサンプルをもたらすでしょう低くボリュームおよび/または若干劣化DNAと少ないDNAをもたらすでしょう。
アガロースゲル（ 図2）上の分析はEDTA_DNAsはそれらに対応するP100_DNAsでは見られない劣化の兆候を（スミア）を示すことを明らかにした。具体的には、最低の収率で2 EDTA_DNAサンプル（EDTA_01053とEDTA_06030）が他のものよりスミアを示しています。彼らの研究では、Wong ら 11に増加した蓄積時間の減少DNA収量を報告した。我々のリポジトリ内のすべての血液サンプルは、同じ保存条件に供され、本研究で使用したサンプルのサブセットをランダムに選択されたので、記憶領域の長さと条件がP100_DNAsとEDTA_DNAs間のアガロースゲル上で見られる相違を考慮する可能性は低い。唯一EDTA_DNAsショー劣化をEDTAチューブ中のプロテアーゼ阻害剤の不足に関連している可能性があるという事実。
P100_DNAsとEDTA_DNAsの純度は有意差は認められなかった（ 用いた試料は、炎症性腸疾患の遺伝学的研究のために募集された。したがって、抽出されたDNAサンプルの性能を比較するために、immunochip 5はタイピング試験プラットフォームとして選択した。 immunochipは免疫遺伝16,17の罰金マッピングタイピングプラットフォームとして使用されてきた。 SNP遺伝子型決定アッセイのゲノムワイドな性質は、DNA性能の厳格な尺度として用いた。すべてのDNA試験およびハップマップ対照サンプルについての平均タイピングコールレートは、全てのチップを横切って、採血管の両方からのDNAの匹敵する優れた性能を示す、それぞれ97.76パーセントと97.4パーセントであった（ 結論 DNAは、プラズマプロテオミクス研究のために描かれた同じ血液サンプルからゲノムテストを容易にする、BD P100チューブの圧縮された血液から単離することができる。我々の結果は、P100管の調査ユーティリティを拡張します。 P100に採取した血液の細胞内容のDNAはゲノム解析のために使用可能であるという事実は、プロテオミクスとゲノム解析の両方が実行されるには研究のためのサンプル取得を簡素化することができます。したがって、より少ない血液は各被験者から必要とされており、研究のスポンサーとスタッフのために関連するコストと労力の節約を向上させることができる。実証され、いくつかの利点があります：
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A.
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C.
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
