Summary
We beschrijven een nieuwe werkwijze voor het isoleren van genomisch DNA uit volbloed voor plasma / serologie. Na het plasma, wordt de verdichte bloed meestal weggegooid. Onze nieuwe methode is een aanzienlijke verbetering ten opzichte van bestaande methoden en maakt DNA en plasma verkrijgbaar vanaf een enkele collectie, zonder daarvoor extra bloed.
Abstract
Laboratoriumonderzoek kan de cellulaire of vloeibare delen van het bloed. Het gebruik van verschillende bloedafnamebuisjes vastgesteld welk deel van het bloed dat kan worden geanalyseerd (volbloed, plasma of serum). Laboratoria betrokken bij het bestuderen van de genetische basis van menselijke aandoeningen afhankelijk anti-gecoaguleerd bloed in EDTA-bevattende vacutainer verzameld als bron van DNA voor genetische / genomische analyse. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek wordt ontstold bloed ook verzameld in heparine bevattende buis (plasma buis). Daarom als DNA en plasma nodig voor gelijktijdige en parallelle analyses van zowel genomische en proteomische gegevens, is het gebruikelijk om bloed te verzamelen in zowel EDTA en heparine buizen. Als bloed in een buis verzameld kunnen worden en dienen als een bron voor zowel plasma als DNA, zou deze werkwijze worden beschouwd als een plaatsing in bestaande methods. Het gebruik van het gecomprimeerde bloed plasma na extractie is een alternatieve bron van genomisch DNA, dus het minimaliseren van de hoeveelheid bloed monsters verwerkt en het aantal benodigde monsters van elke patiënt. Dit zou uiteindelijk bespaart tijd en middelen.
De BD-P100 bloedafnamesysteem voor plasma-eiwit conservering werden geschapen als een verbeterde methode ten opzichte van eerdere plasma of serum collectie buizen 1, om het eiwitgehalte van het bloed te stabiliseren, waardoor een betere eiwit biomarker ontdekking en proteomics experimenten uit menselijk bloed. De BD P100 buisjes bevatten 15,8 ml gesproeidroogde en gevriesdroogde K2EDTA eigen breed spectrum cocktail van proteaseremmers coagulatie te voorkomen en de plasma-eiwitten te stabiliseren. Ze hebben ook een mechanische afscheider, die een fysieke barrière tussen plasma en celpellets na centrifugeren biedt. Enkele werkwijzen zijn ontwikkeld om DNA extraheren uit gestold bloed samples opgevangen in oude plasma buizen 2-4. Uitdagingen deze methoden werden voornamelijk geassocieerd met het type afscheider in de buizen (gel separator) en inclusief moeite terugwinnen van het gestolde bloed, het ongemak te fragmenteren of dispergeren van de klonter en obstructie van de klonter extractie van de gel.
We presenteren de eerste methode die extracten en zuivert genomisch DNA uit bloed getrokken in de nieuwe BD-P100 buizen. Wij vergelijken de kwaliteit van het DNA monster van P100 buizen die uit EDTA-buisjes. Onze benadering is eenvoudig en efficiënt. Het gaat om vier grote stappen als volgt: 1) het gebruik van een plasma BD P100 (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) buis met mechanische afscheider voor bloedafname, 2) de verwijdering van de mechanische afscheider met een combinatie van sucrose en een steriele paperclip metalen haak 3) het scheiden van de buffy coat laag die de witte cellen en 4) het isoleren van het genomische DNA van debuffy coat met een gewone commerciële DNA-extractie kit of een vergelijkbare standaard protocol.
Protocol
1. Monsterneming
- Verzamelen bloedmonsters van mensen met de juiste informed consent. Voor elk individu, trekken 4 à 5 ml bloed in een buisje P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, NY, USA). Ter vergelijking, gelijktijdig afnemen van bloed in een EDTA-buis.
- De BD P100 buisjes bevatten 15,8 ml gesproeidroogde en gevriesdroogde K2EDTA eigen breed spectrum cocktail van proteaseremmers coagulatie te voorkomen en de plasma-eiwitten te stabiliseren. Ze bevatten ook een mechanische afscheider. Na het verzamelen van het bloed, houd beide buizen bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten 's nachts tot de bewerking.
- Centrifugeer de buizen bij BD P100 2500 g gedurende vijftien minuten bij kamertemperatuur. Breng de boven de mechanische afscheider in micro centrifuge buizen ingezameld plasma.
- Bewaar de P100 buizen, met daarin het bloed verdicht onder de afscheider, bij -80 ° C totdat u klaar bent om te beginnen met de DNA-ext zijnraction.
2.1 Van het bloed van P100 buis (P100_DNA)
- De P100 buizen worden opgeslagen bij -80 ° C na extractie plasma. Binnen 3 tot 4 maanden, halen de P100 buis met het verdichte bloed uit de vriezer en ontdooien bij 37 ° C in een waterbad gedurende 5 min (Figuur 1A). Verwijder eventuele resterende plasma dat zit boven de afscheider. Voeg 2 ml van 17% sucrose-oplossing (gradiënt oplossing getest in huis - niet gepubliceerde gegevens) in de P100 buizen boven de separator (Figuur 1B). Centrifugeer de buizen bij kamertemperatuur gedurende 20 min bij 2500 g, een proces duwt de mechanische afscheider naar de top van de buis en levert drie lagen oplossing zoals de bufferlaag (figuur 1C). Handmatig uit te pakken de separator met een steriled verslaafd metalen paperclip (figuur 1D).
- Na het ophalen van de mechanische afscheider van elke buis (figuur 1D), te verwijderen en Discard de bovenste sucrose laag. Breng de middelste laag, die de buffy coat (BC)-laag, in een steriele 15 ml conische buis. Voeg fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) om de bufferlaag volume verhogen tot 3 ml. Extraheer het DNA van de bufferlaag met reagentia van Qiagen Puregene Blood Kit volgens aanbevelingen van de fabrikant, behalve een centrifugeersnelheid van 2500 g (in plaats van 2000 g).
- Te lyseren en verwijder de rode bloedcellen (RBC), voeg 9 ml RBC lysis tot 3 ml buffycoat. Inverteer elke buis meerdere malen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten met af en toe omkeren tijdens incubatie. Spin elk mengsel neer op 2500 g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant. Behandel de overblijvende pellet in elk buisje met 3 ml lysis-oplossing en vortex gedurende 15 seconden. Behandel het lysaat met 1 ml eiwit precipitatieoplossing en vortex gedurende 15 seconden.
- Centrifugeer bij 2500 g gedurende 5 minuten en breng het supernatans in een frisse 15 ml conische buis met3 ml 100% isopropanol. Inverteer de nieuwe buisjes 10 keer en centrifugeer bij 2500 g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml 70% ethanol. Keer de conische buizen een paar keer te verjagen en was de DNA-pellet. Centrifugeer bij 2500 g gedurende 1 minuut. De pellet drogen gedurende 3 minuten (plaats de buis ondersteboven) bij kamertemperatuur en vervolgens opschorten DNA met 250 ml rehydratatie oplossing bij 37 ° C gedurende 10 minuten en overbrengen in een pre-gelabelde 1,7 ml microbuisjes. Bewaar de flesjes bij -80 ° C tot gebruik.
2.2 Van het bloed van EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- De volbloed immunohematology routine testen verzameld in plastic buizen vaccutainer spray gecoat met 10,8 mg K2 EDTA en opgeslagen bij -80 ° C. Omdat de buizen geen mechanische afscheider bevatten, wordt de DNA-extractie niet de stappen omvatten waarbij de mechanische afscheider (2.1.1 en 2.1.2).
- Binnen 3 tot 4 maanden opslag van bloed, de DNA wordt geëxtraheerd met behulp van de KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Het is een automatiseringssysteem DNA extractie gebaseerd op magnetisch techniek en bestaat cellysis / DNA binding, verscheidene wasstappen en DNA elutie.
- De kit gebruikt in de DNA-extractie is de KingFisher Flex 24 Blood DNA kit (Qiagen, Duitsland).
3. DNA Kwantiteit en kwaliteit Assessment
De hoeveelheid, de kwaliteit en integriteit van het genomisch DNA werd bepaald door een combinatie van methode picogreen, spectroscopie en elektroforese omvat.
- De concentratie van het genomische DNA wordt bepaald door kwantificering Nanodrop en picogreen.
- De zuiverheid wordt bepaald uit de 260/280 verhoudingsmeting de Nanodrop spectrofotometer.
- Het monster (500 ng) wordt ook op 1% agarosegel geladen om de integriteit (afbraak) van het DNA te beoordelen.
4. Genotyping Testen en Quality Control
- Vijf P100_DNA en hun bijbehorende EDTA_DNA monsters worden willekeurig geselecteerd voor verdere analyse met behulp van de aangepaste Immunochip (Immuno DNA Analysis BeadChip). Immunochip is een Infinium genotypering chip met daarin 196.524 polymorfismen en is ontworpen voor immunogenetische studies 5.
- Voor elk monster wordt 200 ng DNA geamplificeerd, gefragmenteerd, geprecipiteerd en geresuspendeerd in het geschikte hybridisatiebuffer.
- De gedenatureerde monsters worden gehybridiseerd op Immunochips bij 48 ° C gedurende minimaal 16 uur.
- Na hybridisatie worden de Immunochips verwerkt voor single-base extensie reacties en gekleurd.
- De immunochips worden vervolgens afgebeeld met behulp van Illumina Hiscan Bead-array-lezer en de genormaliseerde kraal intensiteit data wordt in de Illumina GenomeStudio software geladen en omgezet in genotypen. Genotypen worden genoemd met de autocalling algoritme van GenomeStudio. De kwaliteitscontrolevolves uitsluiting van single nucleotide polymorfismen (SNP's) met een oproep van <95%.
- De SNP gesprekstarief wordt gebruikt als een maat voor de efficiëntie immunochip assay. Het wordt berekend als het percentage van het totale aantal assays op de chip (196.524 SNPs gecodeerd op elke chip) voldoende signaalsterkte en kwaliteit te bereiken een geautomatiseerd genotype opdracht ontvangt. Hoge kwaliteit DNA (260/280 verhouding van 1,8 of hoger en afwezigheid van afbraak) zal naar verwachting ten minste dezelfde call rate bereikt de HapMap control DNA in de immunochip assay. Kwaliteitscontrole impliceert uitsluiting van SNPs met een oproep percentage <95% in elke dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA kwaliteitsbeoordeling en meting van de concentratie
De opbrengsten van P100_DNAs waren significant lager dan die van EDTA_DNAs (tabellen 1 en 2). De DNA zuiverheid vertegenwoordigd door de 260/280 verhoudingswaarde gelijk voor zowel P100_DNA en EDTA_DNA sample set (tabellen 1 en 2). De kwaliteit van het DNA globaal eenzelfde elk pakket monster hoewel sommige afbraak wordt gezien in de EDTA_DNA monsters, zoals aangegeven door licht vlek (Figuur 2). De EDTA_DNAs dat meer tekenen van degradatie vertoonde toonde ook verminderde concentratie DNA.
Genotypering
De genotypering call rate voor zowel EDTA_DNAs en P100_DNAs werden vergeleken. Zij leverden vergelijkbare beltarieven en waren beide vergelijkbaar met de interne controle HapMap DNA (Tabel 3).
Figuur 1. Buffycoat isolement.
Tabel 1. DNA-monster opbrengst (PicoGreen) en ratio (nanodrop).
| DNA Yield | DNA Zuiverheid | |||
| Monsters | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1,85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
| p-waarde | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tabel 2. Vergelijking van de opbrengst en zuiverheid (twee-tailed, Paired Sample t-test).
| Genotypering Cell Rate | ||
| Monsters | P100 | EDTA |
| 1 | 97.9 | 97.5 |
| 2 | 97.9 | 97.8 |
| 4 | 97.4 | 97.5 |
| 7 | 97.5 | 98.2 |
| 8 | 97.9 | 98 |
| P waarde | p = 0,67970 | |
Tabel 3. Genotypering call rate (twee-tailed, Paired Sample t-test).
| Monsters | Lagen | Opbrengst (pg) | Verhouding (260/280) |
| Buffycoat | 150 | 1.86 | |
| RBC | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | Buffycoat | 139 | 1.74 |
| RBC | 1.00 | 1.70 | |
| P100_08 | Buffycoat | 118 | 1.87 |
| RBC | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | Buffycoat | 51 | 1.87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
Appendix. Evaluatie van de hoeveelheid DNA in rode bloedcellen (RBC) laag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vele menselijke ziekten hebben genetische oorzaken en onderzoeken de genetische basis van menselijke ziekten vereist een toenemende hoge kwaliteit DNA. De meest voorkomende bron van DNA gebruikt in genetische studies wordt anticoagulated volbloed. Omdat de meeste klinische laboratoria voeren biochemische, serologische, en virale testen als een eerste stap in de fenotypische uitkomst onderzoek, wordt het bloed vaak opgevangen in een plasma buis. Na het verzamelen van het plasma, wordt de verdichte bloed vaak weggegooid. Daarom, wanneer DNA nodig om genetische studies of testen uit te voeren, wordt een extra bloedafname vereist van dezelfde patiënt. De gecompacteerde weggegooid bloed vertegenwoordigt een mogelijke bron van DNA zoals witte bloedcellen bevat. Daarom, met behulp verdichte bloed uit plasma buizen biedt een mogelijkheid om de verzamelde bloedmonster efficiënter te gebruiken, zonder de noodzaak om overtollige bloed te trekken of op te roepen de patiënt voor extra bloed.
Verschillende methoden voor exdarmkanaal DNA van de witte cellen van samengeperste of geronnen bloed zijn gemeld 6-10. De meeste van de problemen van deze werkwijzen werden bij dit ontwerp van de verzamelbuis plasma. Eerder plasma buizen bevatte een separator gemaakt van een gel (gel separator) die, wanneer gecentrifugeerd, vormde een belemmering voor de bloedcellen (opgesloten onder de afscheider) te scheiden van het plasma (boven de afscheider). Om verontreiniging van de bloedcellen met gelmateriaal voorkomen, de separator zich eerst wordt voorzichtig verwijderd uit de buis 11. Dit wordt gevolgd door een fragmentatie van de bloedklonter efficiënte DNA extractie garanderen. De versnippering proces resulteert vaak in een aanzienlijk verlies van bloed en een vermindering DNA opbrengst. Tot monster verlies te minimaliseren en verbeteren van het proces, werd een kleine poriën maas gebruikt om mechanisch verspreid het bloedstolsel in kleine stukjes 12, maar fragmentatie nog steeds beïnvloed DNA opbrengst en kwaliteit en even vormden een gevaar voor de gezondheid van de technicus 13.
De BD-P100 buizen van BD bioscience zijn de nieuwste generatie plasma buizen in multicenter immunologisch onderzoek 14 geëvalueerd. Evenals de vorige plasma buizen Bevat anticoagulantia coagulatie en proteaseremmers voorkomen dat de plasma-eiwitten te stabiliseren. De belangrijkste innovatie van de BD-P100 buis bevindt zich in de mechanische afscheider (geen gel separator) in elke buis. De mechanische afscheider ook een fysieke barrière tussen het plasma en celpellet na centrifugeren, maar anders dan de gel separator, biedt geen gevaar voor besmetting monster door een gel. Het protocol toegepast in deze studie omvat geen fragmentatie, dus er is geen gevaar voor de gezondheid gevaar.
Het DNA werd geëxtraheerd uit de bufferlaag met behulp van een commerciële kit protocol (zie DNA-extractie). De verdichte bloed in het BD P100 buizen waren cryopgereserveerd voor een periode van 3 tot 4 maanden voor DNA extractie. DNA geëxtraheerd van EDTA-buisjes (EDTA_DNA) werden gebruikt als controle bij de beoordeling van de opbrengst en de kwaliteit van hun overeenkomstig P100_DNA. Uit eerdere studies 12,13,15, de opbrengst aan EDTA_DNA monsters waren significant hoger dan die van DNA uit bloed of plasma eerdere buizen. In deze studie, voor dezelfde hoeveelheid volbloed van elke patiënt, de buffy coat van het verdichte bloed leverde minder DNA (Tabel 2, p = 0.00221). Tijdens de DNA-extractie van het bloed in de nieuwe P100 plasma buizen, worden sommige witte bloedcellen uit de buffy kust verloren de rode bloedcellaag (daaronder) maar is onbelangrijk bedrag DNA vergeleken met die van de bufferlaag (zie appendix tabel). De variatie in yield met EDTA_DNAs ook nagebootst met P100_DNA suggereert dat het monster afhankelijk. Monsters met een hoger volume normaliter opbrengst meer DNA en monstersmet een lager volume en / of licht afgebroken DNA zou minder DNA opleveren.
Analyses op agarosegel (figuur 2) is gebleken dat EDTA_DNAs vertonen tekenen van afbraak (uitstrijkje) niet gezien in hun overeenkomstige P100_DNAs. Met name twee EDTA_DNA monsters (EDTA_01053 en EDTA_06030) met het laagste rendement toon meer uitstrijkje dan anderen. In hun studie, Wong et al.. 11 gemeld afgenomen DNA-opbrengst met verhoogde opslagtijd. Aangezien alle bloedmonsters in onze repository werden onderworpen aan dezelfde bewaarcondities en het monster deelverzameling in deze studie werd willekeurig geselecteerd opberglengte en conditie waarschijnlijk alle verschillen zien op de agarosegel tussen P100_DNAs en EDTA_DNAs. Het feit dat slechts EDTA_DNAs toon afbraak kan eventueel bij het ontbreken van protease-remmers in de EDTA-buisjes.
De zuiverheid van de P100_DNAs en EDTA_DNAs waren niet significant verschillend ( De gebruikte monsters werden gerekruteerd voor genetische studies van ontstekingsdarmziekte. Daarom, om de prestaties van het geëxtraheerde DNA monsters te vergelijken, werd het immunochip 5 geselecteerd als genotypering testplatform. De immunochip is gebruikt als fijne genotypering platform immunogenetics 16,17. De genoom-brede aard van de SNP genotypering assays werd gebruikt als een maat voor DNA streng prestaties. De gemiddelde genotypering beltarieven voor alle DNA-test en HapMap controlemonsters, in alle chips, waren 97.76% en 97,4% respectievelijk, toont vergelijkbare uitstekende prestaties van het DNA van beide bloedafnamebuisjes ( Conclusie DNA kan worden geïsoleerd uit het bloed van samengeperste BD P100 buizen genomic testen van hetzelfde bloedmonster opgestelde plasma proteomics studies vergemakkelijkt. Onze resultaten breiden de bruikbaarheid van de P100 buis onderzoek. Het feit dat DNA in het cellulaire gehalte van het bloed in P100 verzameld is bruikbaar voor genomische analyses kunnen helpen vereenvoudigen monster acquisitie voor studies waarin zowel proteomics en genomische analyses zullen worden uitgevoerd. Daarom is minder bloed nodig van elk menselijk subject en een bijbehorende kosten en besparingen inspanning voor de studie sponsors en medewerkers wordt verbeterd. Er zijn verschillende voordelen zien:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A. Promise and pitfalls of the Immunochip. Arthritis Research & Therapy. 13, 101 (2011).
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C. Fine points in mapping autoimmunity. Nature. 43, 1173-1174 (2011).
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
