Summary
Estamos a descrever um novo método de isolamento de DNA genómico a partir de sangue total recolhido de plasma / sorologia. Após a coleta de plasma, o sangue compactado é geralmente descartado. O novo método represente uma melhoria significativa em relação aos métodos existentes e torna o ADN disponível e de plasma a partir de um único conjunto, sem solicitar sangue adicional.
Abstract
Testes de laboratório pode ser feito nas porções celulares ou fluidos do sangue. O uso de diferentes tubos de colheita de sangue determina a porção do sangue que pode ser analisada (sangue completo, plasma ou soro). Os laboratórios que participam no estudo da base genética de doenças humanas dependem de sangue inteiro anti-coagulado recolhido em EDTA vacutainer contendo como fonte de ADN para a análise genética / genómico. Porque a maioria dos laboratórios clínicos realizar testes bioquímicos, sorológicos e virais, como um primeiro passo na investigação fenotípica resultado, o sangue anticoagulado é também recolhida no tubo contendo heparina (tubo de plasma). Portanto, quando o ADN e de plasma são necessários para a análise simultânea e em paralelo de dados, tanto ao genoma e proteoma, é comum recolher o sangue em EDTA e ambos tubos de heparina. Se o sangue pode ser recolhido num tubo e servir como uma fonte de plasma e de DNA, que o método poderia ser considerado como um avanço à metanfetamina existenteods. A utilização do sangue compactados, após extracção de plasma representa uma fonte alternativa de ADN genómico, minimizando assim a quantidade de amostras de sangue e processadas a redução do número de amostras necessário para cada paciente. Este acabaria por economizar tempo e recursos.
O sistema de coleta de sangue P100 BD para a preservação proteínas plasmáticas foram criados como um método melhorado ao longo plasma anterior ou recolha de soro tubos 1, para estabilizar o teor de proteína do sangue, permitindo uma melhor descoberta de biomarcadores de proteínas e proteômica experimentação a partir de sangue humano. Os tubos P100 BD contêm 15,8 ml de K2EDTA seca por pulverização e um vasto espectro de propriedade liofilizado coquetel de inibidores de protease para impedir a coagulação e estabilizar as proteínas do plasma. Eles também incluem um separador mecânico, que proporciona uma barreira física entre o plasma e os sedimentos celulares após centrifugação. Alguns métodos foram desenvolvidos para extrair DNA de sangue coagulado SAmples coletadas em tubos de plasma de idade 2-4. Os desafios de estes métodos foram associados principalmente com o tipo de separador no interior dos tubos (separador de gel) e às dificuldades na recuperação do sangue coagulado, o inconveniente de fragmentação ou de dispersão do coágulo e obstrução do coágulo por extracção do gel de separação.
Nós apresentamos o primeiro método que extrai e purifica o DNA genômico de sangue coletado nos novos tubos BD P100. Comparamos a qualidade da amostra de ADN a partir de P100 tubos para que a partir de tubos com EDTA. Nossa abordagem é simples e eficiente. Ela envolve quatro passos principais como se segue: 1) o uso de um BD P100 plasma (BD Diagnostics, Sparks, MD, USA) com separador mecânico de tubos para colheita de sangue, 2) a remoção do separador mecânico usando uma combinação de sacarose e um clipe estéril gancho metálico, 3) a separação da camada de cobertura amarelada que contém os glóbulos brancos e 4) o isolamento do ADN genómico dobuffy coat usando um kit de extração de DNA comercial regular ou um protocolo padrão similar.
Protocol
1. Coleta de Amostras
- Coletar amostras de sangue de indivíduos com o consentimento informado adequado. Para cada pessoa, desenhar 4 a 5 ml de sangue para um tubo P100 (BD Diagnostics, Franklin Lake, Nova Iorque, EUA). Para fins de comparação, ao mesmo tempo recolher sangue num tubo contendo EDTA.
- Os tubos P100 BD contêm 15,8 ml K2EDTA seca por pulverização e um vasto espectro de propriedade liofilizado coquetel de inibidores de protease para impedir a coagulação e estabilizar as proteínas do plasma. Elas contêm também um separador mecânico. Depois de recolher a amostra de sangue, deve manter os tubos à temperatura ambiente durante 60 min, durante a noite até que o processamento ocorre.
- Centrifugar os tubos P100 BD a 2.500 g durante 15 minutos à temperatura ambiente. Transfira o plasma recolhido acima do separador mecânica em micro tubos de centrífuga.
- Armazenar os P100 tubos contendo o sangue compactado abaixo do separador, a -80 ° C até que esteja pronto para começar o DNA extraction.
2.1 Do sangue de P100 tubo (P100_DNA)
- P100 Os tubos são armazenados a -80 ° C, após a extracção de plasma. Dentro de 3 a 4 meses, recuperar o tubo contendo o sangue P100 compactada do congelador e descongelamento a 37 ° C em banho-maria durante 5 min (Figura 1A). Remova qualquer plasma residual que fica acima do separador. Adicionar 2 ml de solução de sacarose a 17% (solução de gradiente testados em casa - dados não publicados) P100 nos tubos acima do separador (Figura 1B). Centrifugar os tubos à temperatura ambiente durante 20 minutos a 2.500 g, este processo envia o separador mecânico para o topo do tubo e produz três camadas de solução incluindo a crosta inflamatória (Figura 1C). Extrair manualmente o separador usando um steriled clipe de metal em forma de gancho (Figura 1D).
- Depois de recuperar o separador mecânico de cada tubo (Figura 1D), retire e discard a camada superior sacarose. Transferir a camada do meio, representando a camada de revestimento buffy (BC), em um tubo cônico de 15 ml estéril. Adicionar Tampão Fosfato Salino (PBS), para aumentar o volume de creme leucocitário até 3 ml. Extrair o DNA do creme leucocitário utilizando reagentes da Qiagen Puregene Kit sangue conforme a recomendação do fabricante, exceto uma velocidade de centrifugação de 2500 g (em vez de 2.000 g).
- Para lisar e remover os glóbulos vermelhos do sangue (RBC), adicionar 9 ml de lise de RBC a 3 ml de creme leucocitário. Inverter cada tubo várias vezes e incubar à temperatura ambiente durante 10 min, com inversão ocasional durante a incubação. Rodar cada uma das misturas para baixo a 2.500 g durante 5 minutos e descarta-se o sobrenadante. Tratar o sedimento restante em cada tubo com 3 ml de solução de lise celular e de vórtice durante 15 seg. Tratar o lisado com 1 ml de solução de precipitação de proteínas e vortex durante 15 seg.
- Centrifugar a 2500 g durante 5 min, e transferir o sobrenadante para um tubo cónico de 15 mL fresco contendo3 ml de 100% de isopropanol. Inverta os novos tubos de 10 vezes e centrifugar a 2500 g por 3 min. Desprezar o sobrenadante e adicionar 1 ml de etanol 70%. Inverta os tubos cónicos algumas vezes para desalojar e lavar o sedimento de DNA. Centrifugar a 2.500 g por 1 min. Deixar o sedimento secar durante 3 min (o lugar do tubo de cabeça para baixo), à temperatura ambiente e depois suspender o ADN com 250 ml de solução de re-hidratação, a 37 ° C durante 10 minutos e transferir para um pré-rotulados microtubo de 1,7 mL. Armazenar os tubos a -80 ° C até utilização.
2.2 a partir de sangue de EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- A amostra de sangue para testes de rotina imunoematologia é recolhido em tubos de plástico vaccutainer revestidas por pulverização com 10,8 mg de K 2 EDTA e armazenadas a -80 ° C. Como os tubos não contêm um separador mecânico, a extracção de ADN não inclui as etapas que envolvem a separação mecânica (2.1.1 e 2.1.2).
- Dentro de 3 a 4 meses de armazenamento de sangue, o DNUm é extraído usando o KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Trata-se de um sistema de extracção de ADN com base na tecnologia de automação de partículas magnéticas e consiste de lise / ADN de ligação, vários passos de lavagem das células e a eluição do ADN.
- O kit utilizado na extração de DNA é o KingFisher Flex 24 kit DNA Blood (Qiagen, Alemanha).
3. DNA Quantidade e Avaliação da Qualidade
A quantidade, a qualidade e integridade do ADN genómico foram analisadas por uma combinação de método que inclui PicoGreen, espectroscopia e electroforese.
- A concentração do DNA genómico é determinado pela quantificação Nanodrop e PicoGreen.
- A pureza é determinada a partir da medição rácio 260/280 em espectrofotômetro Nanodrop.
- A amostra (500 ng) também é carregado em 1% de gel de agarose para avaliar a integridade (degradação) do DNA.
4. Genotyping Ensaios e Controle de Qualidade
- Cinco P100_DNA e suas amostras EDTA_DNA correspondentes são selecionados aleatoriamente para análise usando o Immunochip personalizado (Immuno DNA Análise BeadChip). Immunochip é um chip de genotipagem Infinium contendo 196.524 polimorfismos e é projetado para estudos de imunogenética 5.
- Para cada amostra, a 200 ng de ADN é amplificado, fragmentada, precipitado e ressuspenso no tampão de hibridação apropriado.
- As amostras desnaturadas são hibridizados em Immunochips a 48 ° C durante um mínimo de 16 horas.
- Após a hibridação, as Immunochips são processados para reacções de extensão de uma única base e coradas.
- Os immunochips são então fotografada usando Ilumina Hiscan leitor matriz talão e os dados de intensidade do grânulo normalizados é carregada no software Ilumina GenomeStudio e convertido em genótipos. Genótipos são chamadas usando o algoritmo de autocalling GenomeStudio. O controle de qualidade emenvolve exclusão de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) com uma taxa de chamada de <95%.
- A taxa de SNP é usado como uma medida da eficiência do ensaio immunochip. É calculada como a percentagem do número total de ensaios no chip (196,524 SNPs codificados em cada chip) que atingir a intensidade de sinal e qualidade suficientes para receber uma atribuição genótipo automatizado. ADN de alta qualidade (260/280 razão de 1,8 ou superior, e ausência de degradação) deverá atingir, pelo menos, a mesma taxa de chamada como o ADN de controlo HapMap incluído no ensaio immunochip. O controle de qualidade envolve a exclusão de SNPs com uma taxa de chamada de <95% em cada conjunto de dados.
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Representative Results
Avaliação da qualidade do DNA e medição da concentração
Os rendimentos de P100_DNAs foram significativamente inferiores aos dos EDTA_DNAs (Tabelas 1 e 2). A pureza do ADN representada pelo seu valor de rácio 260/280 é similar para ambos e conjunto de amostras P100_DNA EDTA_DNA (Tabelas 1 e 2). A qualidade do ADN é bastante uniforme dentro de cada conjunto de amostras, embora alguma degradação é visto nas amostras EDTA_DNA, conforme indicado pela mancha de luz (Figura 2). Os EDTA_DNAs que mostraram mais sinais de degradação também mostrou concentração de DNA reduzida.
Genotipagem
A taxa de genotipagem para ambos EDTA_DNAs e P100_DNAs foram comparados. Eles renderam as taxas de chamadas semelhantes e foram ambos comparável ao DNA controle HapMap interna (Tabela 3).
Figura 1. Buffy isolamento casaco.
Tabela 1. O DNA da amostra (PicoGreen) e razão (NanoDrop).
| Rendimento DNA | Pureza DNA | |||
| Amostras | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1,89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1,74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1,87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1,87 | 1,83 |
| p valor | p = 0,00221 | p = 0,09836 | ||
Tabela 2. Comparação de rendimento e pureza (bicaudal, de amostras pareadas t-test).
| Genotipagem Cell Rate | ||
| Amostras | P100 | EDTA |
| 1 | 97,9 | 97,5 |
| 2 | 97,9 | 97,8 |
| 4 | 97,4 | 97,5 |
| 7 | 97,5 | 98,2 |
| 8 | 97,9 | 98 |
| Valor P | p = 0,67970 | |
Tabela 3. Genotipagem taxa de chamada (bicaudal, de amostras pareadas t-test).
| Amostras | Camadas | Rendimento (mg) | Ratio (260/280) |
| Buffy coat | 150 | 1.86 | |
| RBC | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | Buffy coat | 139 | 1,74 |
| RBC | 1,00 | 1.70 | |
| P100_08 | Buffy coat | 118 | 1,87 |
| RBC | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | Buffy coat | 51 | 1,87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
Apêndice. A avaliação da quantidade de ADN encontrado na camada de células vermelhas do sangue (RBC).
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Discussion
Muitas doenças humanas têm causas genéticas e explorar a base genética da doença humana exige uma crescente DNA de alta qualidade. A fonte mais comum de ADN utilizado em estudos genéticos se sangue total anticoagulado. Porque maioria dos laboratórios clínicos realizar testes bioquímicos, sorológicos e viral como um primeiro passo na investigação da evolução fenotípica, o sangue é muitas vezes coletado em um tubo de plasma. Após a recolha do plasma, o sangue compactado é frequentemente descartados. Portanto, quando o DNA é necessária a realização de estudos genéticos ou de teste, uma coleta de sangue adicional é necessária a partir do mesmo paciente. O sangue compactado descartado representa uma fonte potencial de ADN que contém as células brancas do sangue. Portanto, o uso de sangue compactado a partir de tubos de plasma oferece uma oportunidade de usar a amostra de sangue coletada de forma mais eficiente, sem a necessidade de tirar sangue excedente ou lembrar o paciente de sangue adicional.
Vários métodos para a extrato de ADN as células brancas de sangue coagulado ou compactado foram relatados 6-10. A maioria dos desafios desses métodos foram associados com o desenho do tubo de recolha de plasma. Os tubos para colheita de plasma anteriores continha um separador feito de um gel (gel separador) que, quando centrifugadas, formada uma barreira para separar as células do sangue (preso abaixo do separador) a partir do plasma (localizado acima do separador). Para impedir a contaminação das células do sangue com o material tipo gel, o separador tem de primeiro ser cuidadosamente removido do tubo 11. Isto é seguido por uma fragmentação do coágulo de sangue para garantir a extracção de ADN eficiente. O processo de trituração, muitas vezes resulta numa perda significativa de amostra de sangue e uma redução na produção de ADN. Para minimizar a perda de amostra e melhorar o processo, de uma malha de pequena poro foi utilizada a dispersão mecânica do coágulo de sangue em pequenos pedaços 12, mas ainda afectada rendimento de fragmentação de ADN e de qualidade eeven constituiu um perigo para a saúde com o técnico 13.
Os BD P100 tubos de BD biociência são a última geração de tubos de coleta de plasma avaliadas em estudo multicêntrico investigação imunológica 14. Tal como os anteriores tubos de plasma, que contém anticoagulantes para prevenir os inibidores da protease da coagulação e para estabilizar as proteínas do plasma. A grande inovação do tubo P100 BD reside no separador mecânico (e não um separador de gel) dentro de cada tubo. O separador mecânico também proporciona uma barreira física entre o plasma eo sedimento de células, após a centrifugação, mas ao contrário da separação em gel, não oferece qualquer risco de contaminação da amostra por um gel. O protocolo aplicado neste estudo não inclui a fragmentação e, portanto, não há risco de perigo para a saúde.
O DNA foi extraído a partir de buffy coat, utilizando um protocolo de kit comercial (veja extracção de DNA). O sangue compactado nos tubos BD P100 foram cryopreservada para um período de 3 a 4 meses antes da extracção do ADN. O DNA extraído a partir de tubos com EDTA (EDTA_DNA) foram utilizados como controlo para a avaliação do rendimento e qualidade da sua P100_DNA correspondente. A partir de estudos anteriores, 12,13,15, os rendimentos de amostras EDTA_DNA foram significativamente maiores do que o de DNA a partir de plasma de sangue de tubos anteriores. Neste estudo, para a mesma quantidade total de sangue recolhido de cada paciente, a cobertura amarelada do sangue compactado produziu menos de DNA (Tabela 2, p = 0,00221). Durante a extracção de ADN a partir do sangue nos novos P100 tubos de plasma, alguns glóbulos brancos a partir da costa buffy são perdidos para a camada de células vermelhas do sangue (abaixo), mas representa quantidade insignificante de ADN em comparação com os de buffy coat (ver apêndice tabela). A variação em rendimento visto com EDTA_DNAs também é imitado com o P100_DNA sugerindo que é dependente da amostra. As amostras com maior volume que normalmente produzem mais e as amostras de DNAcom menor volume e / ou DNA pouco degradado renderia menos DNA.
As análises em gel de agarose (Figura 2) revelou que EDTA_DNAs mostrar sinais de degradação (smear), que não se vêem nas suas P100_DNAs correspondentes. Em particular, duas amostras EDTA_DNA (EDTA_01053 e EDTA_06030) com o menor rendimento mostrar mais esfregaço do que outros. Em seu estudo, Wong et al. 11 relataram diminuição da produção de DNA com o aumento do tempo de armazenamento. Uma vez que todas as amostras de sangue em nosso repositório foram sujeitos à mesma condição de armazenamento e no subconjunto amostra utilizada neste estudo foi seleccionada aleatoriamente, duração de armazenamento e condição é improvável que representam as diferenças observadas em gel de agarose e entre P100_DNAs EDTA_DNAs. O facto de apenas EDTA_DNAs mostra degradação pode estar associada à ausência de inibidores da protease dos tubos com EDTA.
A pureza dos P100_DNAs EDTA_DNAs e não foram significativamente diferentes ( As amostras utilizadas foram recrutados para os estudos genéticos de doença inflamatória intestinal. Por conseguinte, para comparar o desempenho das amostras de DNA extraídas, o immunochip 5 foi seleccionado como a plataforma de genotipagem. O immunochip tem sido usado como uma plataforma para a genotipagem de mapeamento fino imunogenética 16,17. A genome-wide natureza dos ensaios de genotipagem foi usado como uma medida rigorosa do desempenho de DNA. As taxas de chamada genotipagem média de todos os teste de DNA e amostras de controle HapMap, em todas as fichas, foram 97,76% e 97,4%, respectivamente, mostrando excelente desempenho comparável do DNA de ambos os tubos de coleta de sangue ( Conclusão O ADN pode ser isolado a partir do sangue do compactado de P100 tubos BD, facilitando testes genómico a partir da mesma amostra de sangue para estudos do proteoma do plasma. Os nossos resultados estendem o utilitário de pesquisa do tubo P100. O fato de que o DNA no conteúdo celular do sangue coletado em P100 é utilizável para análises genômicas pode ajudar a simplificar a aquisição de amostras para estudos em que ambas as análises proteômicas e genômicas serão realizadas. Portanto, é necessário menos sangue de cada sujeito humano e um custo associado e economia de esforço para os patrocinadores do estudo e pessoal é melhorada. Existem várias vantagens demonstradas:
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
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