Summary
אנחנו מתארים שיטה חדשה של בידוד הדנ"א הגנומי מכל הדם שנאסף לפלזמה / סרולוגיה. לאחר איסוף פלזמה, הדם הדחוס בדרך כלל מושלך. השיטה החדשה שלנו מהווה שיפור משמעותי על פני שיטות קיימות והופכת את ה-DNA ופלזמה זמינה מאוסף אחד, מבלי לבקש דם נוסף.
Abstract
ניתן לעשות בדיקות מעבדה במנות הסלולריות או נוזל של הדם. השימוש בצינורות איסוף דם שונים קובע את החלק של הדם שיכול להיות מנותח (כולו דם, פלזמה או סרום). מעבדות העוסקות בחקר הבסיס הגנטי של הפרעות אדם מסתמכות על הדם שנאסף בכל anticoagulated vacutainer המכיל EDTA כמקור של ה-DNA לצורך הניתוח גנטי / הגנומי. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, דם anticoagulated נאסף גם בצינור המכיל הפרין (צינור פלזמה). לכן, כאשר ה-DNA והפלזמה נדרשים לניתוחים בו זמנית ומקבילים של נתונים והן הגנומי proteomic, נהוג לאסוף את הדם בשני צינורות EDTA והפרין. אם דם יכול להיות שנאסף בצינור יחיד וישמש כמקור לפלזמה וגם ה-DNA, שיטה שתיחשב לקידום ספיד קייםods. השימוש בדם הדחוס לאחר מיצוי פלזמה מייצג מקור חלופי להדנ"א הגנומי, וכך לצמצם את כמות דגימות דם מעובדים וצמצום מספר הדגימות הנדרשות מכל מטופל. זה הייתי סופו של דבר לחסוך זמן ומשאבים.
מערכת איסוף דם P100 BD לשימור חלבון פלזמה נוצרו כשיטת משופרת על פני פלזמה קודמת או אוסף סרום 1 צינורות, כדי לייצב את תכולת החלבון של דם, מה שמאפשר גילוי טוב יותר חלבון סמן ביולוגי וניסויים פרוטאומיקה מהדם אנושי. את צינורות BD P100 מכילים 15.8 מ"ל של K2EDTA מיובש ריסוס וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם כוללים גם מפריד מכאני, המספק מכשול פיזי בין פלזמה וכדורי תא לאחר צנטריפוגה. שיטות כמה כבר המציאו כדי לחלץ דנ"א מהדם קרוש samples נאסף בצינורות פלזמה ישנים 2-4. אתגרים מהשיטות הללו היו קשורים בעיקר עם הסוג של מפריד בתוך הצינורות (מפריד ג'ל) וכללו קושי במתאושש דם קרוש, את אי הנוחות של פיצול או פיזור הקריש, וחסימה של החילוץ על ידי קריש ג'ל ההפרדה.
אנו מציגים את השיטה הראשונה שמחלצת ומטהרת את הדנ"א הגנומי מהדם נמשך בצינורות P100 BD החדשים. אנו משווים את איכות דגימת DNA מP100 צינורות שמצינורות EDTA. הגישה שלנו היא פשוט ויעיל. היא כוללת ארבעה שלבים עיקריים כדלקמן: 1) השימוש בפלזמת BD P100 (BD אבחון, ניצוצות, MD, ארצות הברית) צינור עם מפריד מכאני לאיסוף דם, 2) הסרת המפריד מכאני באמצעות שילוב של סוכרוז ו וו סטרילי מהדק מתכתי, 3) ההפרדה של שכבת מעיל באפי המכילות את התאים לבנים ו -4) הבידוד של הדנ"א הגנומי ממעיל באפי באמצעות ערכה מסחרית רגילה DNA מיצוי או פרוטוקול סטנדרטי דומה.
Protocol
1. אוסף דוגמאות
- לאסוף דגימות דם מאנשים עם הסכמה מדעת ראויה. עבור כל אדם, לצייר 4 עד 5 מ"ל של דם לתוך צינור P100 (BD אבחון, פרנקלין לייק, ניו יורק, ארה"ב). לצורך השוואה, בו זמנית לאסוף דם בצינור EDTA.
- את צינורות BD P100 מכילים K2EDTA מיובש תרסיס מ"ל 15.8 וקוקטייל lyophilized קניינית ספקטרום רחב של מעכבי פרוטאז כדי למנוע קרישה ולייצב את חלבוני הפלזמה. הם גם מכילים מפריד מכאני. לאחר איסוף הדם כולו, לשמור על שני הצינורות בטמפרטורת חדר למשך 60 דקות ללילה עד שעיבוד מתרחש.
- צנטריפוגה P100 צינורות BD ב 2500 גרם במשך חמישה עשר דקות בטמפרטורת חדר. העבר את הפלזמה שנאסף מעל למפריד מכאני לצינורות צנטריפוגה מיקרו.
- אחסן את צינורות P100, המכיל הדם נדחס מתחת למפריד, ב -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להתחיל שלוחה DNAraction.
2.1 מ דם של P100 צינור (P100_DNA)
- את צינורות P100 מאוחסנים ב -80 ° C לאחר מיצוי פלזמה. בתוך 3 עד 4 חודשים, לשלוף את צינור P100 המכיל דם הדחוס מהמקפיא ולהפשיר על 37 מעלות באמבט מים במשך 5 דקות (איור 1 א). הסר את כל פלזמה שיורית שיושבת מעל המפריד. הוסף 2 מ"ל של תמיסת סוכרוז 17% (שיפוע פתרון נבדק בבית - נתונים שלא פורסמו) בצינורות P100 מעל המפריד (איור 1). צנטריפוגה צינורות בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות ב 2500 G; תהליך זה דוחף את המפריד מכאני לחלק העליון של הצינור ומניב שלוש שכבות של פתרון כולל מעיל באפי (איור 1 ג). באופן ידני לחלץ את המפריד באמצעות מהדק מתכת מעוקל steriled (1D איור).
- לאחר אחזור המפריד מכאני מכל צינור (איור 1D), להסיר וdiscarד שכבת סוכרוז העליון. העבר את השכבה האמצעית, המייצגת את שכבת מעיל באפי (BC), לתוך צינור סטרילי 15 מיליליטר חרוטי. הוסף פוספט חיץ מלוח (PBS) להגדיל את ההיקף מעיל באפי ל3 מ"ל. לחלץ את ה-DNA מהמעייל באפי באמצעות ריאגנטים מקיט דם Puregene Qiagen לפי המלצת היצרן, למעט מהירות צנטריפוגה של 2,500 גר '(במקום 2,000 גר').
- לlyse ולהסיר את תאי הדם האדומים (RBC), להוסיף 9 מ"ל של RBC לתמוגה 3 מ"ל של מעיל באפי. הפוך כל צינור מספר פעמים ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 10 דקות עם פה והיפוך במהלך דגירה. ספין למטה בכל תערובת 2,500 גרם במשך 5 דקות וזורקים supernatant. פנק את הכדור שנותר בצינור אחד עם 3 מ"ל של תמיסת תמוגה תא ומערבולת במשך 15 שניות. פנק lysate עם 1 מ"ל של פתרון משקעים חלבון ו מערבולת במשך 15 שניות.
- צנטריפוגה ב 2500 גרם במשך 5 דקות ולהעביר את supernatant לתוך צינור 15 מיליליטר חרוטי המכילים טרי3 מ"ל של 100% isopropanol. להפוך את הצינורות החדשים 10 פעמים ו צנטריפוגות ב 2500 גרם במשך 3 דקות. בטל supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של 70% אתנול. הפוך את צינורות החרוטים כמה פעמים כדי לעקור ולשטוף את כדור ה-DNA. צנטריפוגה ב 2500 גרם דקות 1. אפשר לגלולה לייבוש למשך 3 דקות (במקום הצינור הפוך) בטמפרטורת חדר ולאחר מכן להשעות את ה-DNA עם 250 מ"ל של תמיסת התייבשות על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והעברה לmicrotube שכותרתו מראש 1.7 מ"ל. אחסן את הצינורות ב -80 ° C עד שימוש.
2.2 מהדם של EDTA Ttube (EDTA_DNA)
- כל הדם לבדיקה שגרתית immunohematology נאסף בצינורות פלסטיק vaccutainer תרסיס מצופה 10.8 מ"ג של K 2 EDTA ומאוחסן ב -80 ° C. מאחר שהצינורות לא מכילים מפריד מכאני, מיצוי DNA אינו כולל את הפעולות הקשורות להפרדה מכאנית (2.1.1 ו2.1.2).
- בתוך 3 עד 4 חודשים של אחסון דם, DNמופק באמצעות Flex לדג (תרמו פישר סיינטיפיק, Waltham, מסצ'וסטס, ארה"ב). זוהי מערכת מיצוי DNA אוטומציה המבוססת על טכנולוגיית חלקיקים מגנטית והוא מורכב ממספר שלבים, סלולרי תמוגה / ה-DNA מחייבים כביסה וelution ה-DNA.
- ערכת שימוש במיצוי DNA היא Kingfisher להגמיש 24 דנ"א דם הערכה (Qiagen, גרמניה).
3. כמות הדנ"א והערכת איכות
הכמות, האיכות והיושרה של הדנ"א הגנומי הוערכו על ידי שילוב של שיטה הכולל picogreen, ספקטרוסקופיה ואלקטרופורזה.
- הריכוז של הדנ"א הגנומי נקבע על ידי כימות Nanodrop וpicogreen.
- טוהר נקבע ממדידת 260/280 היחס בספקטרופוטומטר Nanodrop.
- המדגם (500 ng) נטען גם על 1% agarose ג'ל כדי להעריך את השלמות (השפלה) של ה-DNA.
4. Genotypinמבחני גרם ובקרת איכות
- חמש P100_DNA ודגימות EDTA_DNA המקבילות שלהם נבחרו באופן אקראי לניתוח נוסף באמצעות Immunochip המותאם אישית (החיסוני דנ"א ניתוח BeadChip). Immunochip הוא שבב המכיל 196,524 genotyping Infinium פולימורפיזם והוא נועד לimmunogenetic לימודים 5.
- עבור כל מדגם, 200 ng של DNA מוגבר, מקוטע, וזרז resuspended במאגר ההכלאה המתאים.
- הדגימות מפוגלים הם הכלאה על Immunochips ב 48 מעלות צלזיוס למשך התקופה מינימאלית של 16 שעות.
- לאחר הכלאה, את Immunochips מעובדים לתגובות מאריכים יחידה בסיס ומוכתם.
- את immunochips לאחר מכן צילמו באמצעות קורא Illumina Hiscan חרוז מערך ואת הנתונים בעוצמה חרוז המנורמלים הוא נטען לתוך תוכנת GenomeStudio Illumina והוסבו לגנוטיפים. גנוטיפים נקראים באמצעות אלגוריתם autocalling של GenomeStudio. בקרת האיכות בvolves הרחקה של פולימורפיזמים נוקלאוטיד בודדים (SNPs) עם שיעור שיחה <95%.
- שיחת שיעור SNP משמש כמדד ליעילות assay immunochip. הוא מחושב כאחוז מהמספר הכולל של מבחני על השבב (196,524 SNPs מקודד על שבב אחד) שישיג עוצמת אות מספקת ואיכות לקבל הקצאת גנוטיפ אוטומטית. ה-DNA באיכות גבוהה (260/280 היחס של 1.8 ומעלה, והעדרו של השפלה) צפויה להשיג לפחות את שיחת שיעור זהה לדנ"א שליטת HapMap נכלל בassay immunochip. בקרת איכות כרוכה בהרחקה של SNPs עם שיעור שיחה <95% בכל קבוצת נתונים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הערכת איכות ה-DNA ומדידת ריכוז
התשואות של P100_DNAs היו נמוכות באופן משמעותי מאלה של EDTA_DNAs (לוחות 1 ו -2). טוהר ה-DNA מיוצג על ידי ערך 260/280 היחס שלה הוא דומה בשני P100_DNA וקבוצת מדגם EDTA_DNA (לוחות 1 ו -2). האיכות של ה-DNA היא אחידה למדי בכל קבוצה של מדגם למרות שחלק השפלה נתפסת בדגימות EDTA_DNA, כפי שצוין על ידי מריחת אור (איור 2). את EDTA_DNAs שהראה סימנים נוספים של השפלה גם הראה ריכוז ה-DNA מופחת.
Genotyping
שיחת שיעור genotyping עבור שני EDTA_DNAs וP100_DNAs הושוו. הם הניבו שיעורי שיחה דומים ושניהם היו דומים לדנ"א שליטת HapMap הפנימי (לוח 3).
איור 1. בידוד מעיל באפי.
טבלת מס '1. תשואת DNA מדגם (PicoGreen) ויחס (NanoDrop).
| תשואת ה-DNA | טוהר ה-DNA | |||
| דוגמאות | P100 | EDTA | P100 | EDTA |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
| ערך p | P = .00221 | P = .09836 | ||
טבלת 2. השוואה של תשואות וטוהר (לדוגמא שני זנב, מותאם מבחן t).
| Genotyping דרג סלולרי | ||
| דוגמאות | P100 | EDTA |
| 1 | 97.9 | 97.5 |
| 2 | 97.9 | 97.8 |
| 4 | 97.4 | 97.5 |
| 7 | 97.5 | 98.2 |
| 8 | 97.9 | 98 |
| ערך P | P = .67970 | |
לוח 3. שיעור שיחת genotyping (לדוגמא שני זנב, מותאם מבחן t).
| דוגמאות | שכבות | תשואה (מיקרוגרם) | יחס (260/280) |
| באפי מעיל | 150 | 1.86 | |
| RBC | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | באפי מעיל | 139 | 1.74 |
| RBC | 1.00 | 1.70 | |
| P100_08 | באפי מעיל | 118 | 1.87 |
| RBC | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | באפי מעיל | 51 | 1.87 |
| RBC | 0.23 | 0.98 |
נספח. הערכה של כמות ה-DNA שנמצאה בתא שכבת דם אדום (RBC).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש מחלות אנושיות רבות גורמים גנטיים ולחקור את הבסיס הגנטי של מחלות אנושית דורשת ה-DNA באיכות גבוהה הולך וגדל. המקור הנפוץ ביותר של ה-DNA משמש במחקרים גנטיים הוא anticoagulated דם כולו. כי רוב המעבדות הקליניות לבצע בדיקה ביוכימית, סרולוגית, ויראלית כצעד ראשון בחקירת תוצאת פנוטיפי, הדם לעתים קרובות נאסף בצינור פלזמה. אחרי האוסף של הפלזמה, הדם הדחוס נמחקת לעתים קרובות. לכן, כאשר יש צורך לבצע מחקרי DNA גנטיים או בדיקה, נדרש להקיז דם נוסף מאותו החולה. הדם הדחוס מושלך מייצג מקור פוטנציאלי של ה-DNA כפי שהוא מכיל תאי דם לבנים. לכן, שימוש בדם מהפלזמה דחוס צינורות מציע הזדמנות להשתמש בדגימת הדם שנאסף בצורה יעילה יותר, ללא הצורך להקיז דם עודף או זוכר את המטופל לדם נוסף.
שיטות שונות כדי לשעברה-DNA בדרכי מתאי דם הלבנים של דחוס או קרוש דווח 6-10. רוב האתגרים של שיטות אלה היו קשורים עם העיצוב של צינור איסוף הפלזמה. צינורות איסוף פלזמה קודמים הכילו מפריד עשוי מג'ל (מפריד ג'ל) אשר, כאשר centrifuged, יצר מחסום כדי להפריד את תאי הדם (לכודים מתחת למפריד) מהפלזמה (הממוקם מעל המפריד). על מנת למנוע זיהום של תאי הדם עם חומר ג'ל, המפריד תחילה יש להסיר בזהירות מהצינור 11. זה ואחריו פיצול של קריש הדם כדי להבטיח מיצוי DNA יעיל. תהליך פיצול לעתים קרובות תוצאות אובדן משמעותי של דגימת דם וירידה בתשואת ה-DNA. כדי להקטין את איבוד מדגם ולשפר את התהליך, רשת קטנה נקבובית שימש מכאני לפיזור קריש הדם לחתיכות קטנות 12, אבל פיצול תשואת DNA עדיין מושפעת ואיכות והדוארven היווה סכנה בריאותית לטכנאי 13.
את צינורות P100 BD מBD Bioscience הם הדור האחרון של צינורות איסוף פלזמה הוערכו במחקר רב מרכזי אימונולוגית 14. כמו צינורות הפלזמה הקודמים, הם מכילים נוגדי קרישה למניעת קרישה ומעכבי פרוטאז לייצב את חלבוני הפלזמה. החידוש הגדול של צינור P100 BD מתגורר במפריד מכאני (לא מפריד ג'ל) בתוך צינור אחד. המפריד מכאני מספק גם מכשול פיזי בין הפלזמה ותא גלולה לאחר צנטריפוגה, אך שלא כמו מפריד ג'ל, לא מציע שום סיכון לזיהום דגימה על ידי ג'ל. הפרוטוקול מיושם במחקר זה אינו כולל פיצול, ולכן אין סיכון סכנה בריאותית.
ה-DNA היה שחולץ מן מעיל באפי, באמצעות פרוטוקול ערכה מסחרי (ראה מיצוי DNA). הדם הדחוס בצינורות P100 BD היה cryopשמורות לתקופה של 3 עד 4 חודשים שקדמה למיצוי DNA. ה-DNA שחולץ מן EDTA צינורות (EDTA_DNA) שמשו כביקורת בהערכת היבול והאיכות של P100_DNA המקביל שלהם. ממחקרים קודמים 12,13,15, התשואות של דגימות EDTA_DNA היו גבוהות יותר באופן משמעותי מזה של ה-DNA מהדם של צינורות פלזמה קודמים. במחקר זה, לאותו הדם כל הסכום שנגבה מכל מטופל, מעיל באפי של הדם הדחוס הניב פחות דנ"א (טבלת 2, P = .00221). במהלך מיצוי DNA מהדם בצינורות הפלזמה P100 החדשים, חלק מתאי דם לבנים מהחוף באפי הם איבד את שכבת תאי הדם האדומה (מתחתיו) אלא מייצג כמות משמעותית של ה-DNA בהשוואה לאלו מהמעייל באפי (ראה נספח טבלה). הווריאציה בתשואה ראתה עם EDTA_DNAs גם חיקתה עם P100_DNA המצביע על כך שזה מדגם תלוי. דוגמאות עם נפח גבוה יותר בדרך כלל יניבו יותר DNA ודגימותעם נפח ו / או ה-DNA מעט מושפל נמוכים יותר תניב פחות ה-DNA.
ניתוח על agarose ג'ל (איור 2) התגלה כי EDTA_DNAs להראות סימנים של השפלה (כתם) לא ראו בP100_DNAs המקבילה שלהם. בפרט, שתי דגימות EDTA_DNA (EDTA_01053 וEDTA_06030) עם התשואה הנמוכה ביותר להראות יותר למרוח יותר מאחרים. במחקר שלהם, וונג ואח'. דיווחו 11 תשואת DNA ירד עם זמן אחסון מוגבר. מכיוון שכל דגימות הדם במאגר שלנו היו נתונים לאותו מצב אחסון וקבוצת משנה המדגם ששמש במחקר זה היה שנבחרה באקראי, אורך אחסון והמצב צפויים בחשבון את ההבדלים ראו על ג'ל agarose בין P100_DNAs וEDTA_DNAs. העובדה ששפלת תכנית EDTA_DNAs רק יכולה להיות קשורה לחוסר מעכבי פרוטאז בצינורות EDTA.
טוהר של P100_DNAs וEDTA_DNAs לא היו שונה משמעותי ( הדגימות בשימוש גויסו למחקרים הגנטיים של מחלות מעי דלקתיות. לכן, כדי להשוות את הביצועים של דגימות DNA שחולצו, immunochip 5 נבחר כפלטפורמת בדיקות genotyping. Immunochip שימש כפלטפורמת genotyping מיפוי קנס על immunogenetics 16,17. טבע הגנום של מבחני genotyping SNP שימש כאמצעי מחמיר של ביצועי ה-DNA. את שיעורי שיחת genotyping הממוצעים עבור כל בדיקת DNA ודגימות בקרת HapMap, על פני כל השבבים, היו 97.76% ו 97.4% בהתאמה, מראים ביצועים מצוינים דומים של DNA משני צינורות איסוף דם ( מסקנה ה-DNA יכול להיות מבודד מהדם הדחוס של צינורות P100 BD, הקלת בדיקות גנטית מאותה דגימת הדם נמשכות ללימודי הפלזמה proteomics. התוצאות שלנו להרחיב את שירות המחקר של צינור P100. העובדה כי ה-DNA בתוכן הסלולרי של דם שנאסף בP100 הוא שמישה עבור ניתוחים הגנומי יכולה לעזור לפשט את רכישת מדגם למחקרים בהם יבוצעו ניתוחים והן proteomic הגנומי. לכן, יש צורך בפחות דם מכל נושא אנושי ועלות כרוכה וחיסכון מאמץ לנותני החסות ואנשי צוות המחקר הוא השתפר. ישנם מספר יתרונות הפגינו:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clinical Chemistry. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clinical Chemistry. 44, 1748-1750 (1998).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Molecular Biotechnology. 46, 258-264 (2010).
- Cortes, A., Brown, M. A.
- Basuni, A. A., Butterworth, L. A., Cooksley, G., Locarnini, S., Carman, W. F. An efficient extraction method from blood clots for studies requiring both host and viral DNA. Journal of Viral Hepatitis. 7, 241-243 (2000).
- Kanai, N., Fujii, T., Saito, K., Tokoyama, T. Rapid and simple method for preparation of genomic DNA from easily obtainable clotted blood. Journal of Clinical Pathology. 47, 1043-1044 (1994).
- Adkins, K. K., Strom, D. A., Jacobson, T. E., Seemann, C. R., O'Brien, D. P., Heath, E. M. Utilizing genomic DNA purified from clotted blood samples for single nucleotide polymorphism genotyping. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 126, 266-270 (2002).
- Siafakas, N., Burnett, L., Bennetts, B., Proos, A. Nonenzymatic extraction of DNA from blood collected into serum separator tubes. Clinical Chemistry. 41, 1045-1046 (1995).
- Everson, R. B., Mass, M. J., Gallagher, J. E., Musser, C., Dalzell, J. Extraction of DNA from cryopreserved clotted human blood. BioTechniques. 15, 18-20 (1993).
- Se Fum Wong, S., Kuei, J. J., Prasad, N., Agonafer, E., Mendoza, G. A., Pemberton, T. J., Patel, P. I. A simple method for DNA isolation from clotted blood extricated rapidly from serum separator tubes. Clin. Chem. 53, 522-524 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H. Simple and rapid method for extraction of DNA from fresh and cryopreserved clotted human blood. Clin. Chem. 42, 647-648 (1996).
- Salazar, L. A., Hirata, M. H., Cavalli, S. A., Machado, M. O., Hirata, R. D. Optimized procedure for DNA isolation from fresh and cryopreserved clotted human blood useful in clinical molecular testing. Clin. Chem. 44, 1748-1750 (1998).
- Matheson, L. A., Duong, T. T., Rosenberg, A. M., Yeung, R. S. Assessment of sample collection and storage methods for multicenter immunologic research in children. Journal of Immunological Methods. 339, 82-89 (2008).
- Xu, R., Ye, P., Luo, L., Wu, H., Dong, J., Deng, X. A simple and efficient method for DNA purification from samples of highly clotted blood. Mol. Biotechnol. 46, 258-264 (2010).
- Polychronakos, C.
- Cooper, J. D., Simmonds, M. J., Walker, N. M., Burren, O., Brand, O. J., Guo, H., Wallace, C., Stevens, H., Coleman, G., Franklyn, J. A., Todd, J. A., Gough, S. C. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease. Human Molecular Genetics. , (2012).
