Summary
हम प्लाज्मा / सीरम विज्ञान के लिए एकत्र पूरे रक्त से जीनोमिक डीएनए को अलग करने के लिए एक नई विधि का वर्णन कर रहे हैं. प्लाज्मा संग्रह के बाद, जमा हुआ रक्त आम तौर पर खारिज कर दिया है. हमारे उपन्यास विधि मौजूदा तरीकों पर एक महत्वपूर्ण सुधार का प्रतिनिधित्व करता है और अतिरिक्त रक्त अनुरोध किए बिना, डीएनए और एक संग्रह से उपलब्ध प्लाज्मा बनाता है.
Protocol
1. नमूना संग्रह
- उचित सूचित सहमति के साथ व्यक्तियों से रक्त के नमूने ले लीजिए. प्रत्येक व्यक्ति के लिए, एक P100 के ट्यूब (बी.डी. निदान, फ्रेंकलिन झील, न्यूयॉर्क, संयुक्त राज्य अमरीका) में रक्त के 4 से 5 मिलीलीटर आकर्षित. तुलना प्रयोजनों के लिए, एक साथ एक EDTA के ट्यूब में रक्त इकट्ठा.
- बी.डी. P100 ट्यूबों 15.8 मिलीलीटर स्प्रे सूखे K2EDTA और जमावट को रोकने और प्लाज्मा प्रोटीन को स्थिर करने के लिए protease inhibitors का एक lyophilized मालिकाना व्यापक स्पेक्ट्रम कॉकटेल होते हैं. उन्होंने यह भी एक यांत्रिक विभाजक होते हैं. संसाधन होती है जब तक पूरे रक्त इकट्ठा करने के बाद, रात भर के लिए 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर दोनों ट्यूबों रखना.
- कमरे के तापमान पर पंद्रह मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर बी.डी. P100 ट्यूबों अपकेंद्रित्र. सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों में यांत्रिक विभाजक ऊपर एकत्र प्लाज्मा स्थानांतरण.
- -80 में, विभाजक नीचे जमा हुआ रक्त युक्त, P100 ट्यूबों स्टोर डिग्री सेल्सियस आप डीएनए एक्सटेंशन शुरू करने के लिए तैयार हैं जब तकraction.
P100 के ट्यूब के रक्त (P100_DNA) से 2.1
- P100 ट्यूब -80 में जमा हो जाती है डिग्री सेल्सियस प्लाज्मा निकासी के बाद. 3 से 4 महीने के भीतर, 5 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री पर फ्रीजर और गलन से जमा हुआ रक्त युक्त P100 ट्यूब निकालते हैं. विभाजक ऊपर बैठता है कि किसी भी अवशिष्ट प्लाज्मा निकालें. विभाजक ऊपर P100 के ट्यूब (चित्रा 1 बी) में - 17% sucrose के समाधान (अप्रकाशित डेटा घर में परीक्षण ढाल समाधान) के 2 मिलीलीटर जोड़ें. 2500 ग्राम से कम 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूबों अपकेंद्रित्र, इस प्रक्रिया ट्यूब के शीर्ष पर यांत्रिक विभाजक धक्का और buffy कोट (चित्रा 1C) सहित समाधान की तीन परतों पैदावार. मैन्युअल एक steriled झुका धातु क्लिप (चित्रा -1) का उपयोग विभाजक निकाल सकते हैं.
- प्रत्येक ट्यूब (चित्रा -1) से यांत्रिक विभाजक पुन: प्राप्त करने के बाद, हटाने और discarघ शीर्ष सूक्रोज परत. एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में buffy कोट (ईसा पूर्व) परत का प्रतिनिधित्व मध्यम परत, स्थानांतरण. 3 मिलीलीटर buffy कोट की मात्रा बढ़ाने के लिए फास्फेट बफर खारा (पीबीएस) जोड़ें. निर्माता की सिफारिश के अनुसार क्विएज़न Puregene रक्त किट से अभिकर्मकों का उपयोग buffy कोट से डीएनए निकालने, 2500 जी की एक अपकेन्द्रण गति (बजाय 2,000 ग्राम) को छोड़कर.
- लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) lyse और निकालने के लिए, buffy कोट के 3 मिलीलीटर के लिए आरबीसी सेल के 9 मिलीलीटर जोड़ें. प्रत्येक ट्यूब कई बार पलटना और ऊष्मायन के दौरान सामयिक inverting के साथ 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. 5 मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर प्रत्येक मिश्रण स्पिन और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. 15 सेकंड के लिए सेल समाधान और भंवर के 3 मिलीलीटर के साथ एक ट्यूब में शेष गोली समझो. 1 प्रोटीन तेज़ी समाधान के मिलीग्राम और 15 सेकंड के लिए भंवर साथ lysate समझो.
- 5 मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र और युक्त एक ताजा 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला स्थानांतरण100% isopropanol के 3 मिलीलीटर. 3 मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर नए ट्यूबों 10 बार और अपकेंद्रित्र पलटना. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 70% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें. शंक्वाकार ट्यूबों डीएनए गोली बेदखल और धोने के लिए एक बार कुछ उलटा. 1 मिनट के लिए 2,500 ग्राम पर अपकेंद्रित्र. गोली कमरे के तापमान पर 3 मिनट (उल्टा ट्यूब जगह) के लिए सूखी और फिर 10 मिनट और एक पूर्व लेबल 1.7 मिलीलीटर microtube को हस्तांतरण के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पुनर्जलीकरण समाधान के 250 मिलीलीटर के साथ डीएनए को निलंबित करने की अनुमति दें. -80 में ट्यूब स्टोर डिग्री सेल्सियस उपयोग करें जब तक.
ईडीटीए Ttube के रक्त (EDTA_DNA) से 2.2
- दिनचर्या स्वरोगक्षम एवं रक्त रोगों का अध्ययन परीक्षण के लिए पूरे रक्त कश्मीर 2 EDTA के 10.8 मिलीग्राम के साथ स्प्रे लेपित और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत प्लास्टिक vaccutainer ट्यूबों में एकत्र किया जाता है ट्यूब एक यांत्रिक विभाजक शामिल नहीं है, क्योंकि डीएनए निष्कर्षण यांत्रिक विभाजक (2.1.1 और 2.1.2) को शामिल कदम शामिल नहीं है.
- रक्त भंडारण, डी.एन. के 3 से 4 महीने के भीतरएक किंगफिशर फ्लेक्स (थर्मो फिशर साइंटिफिक, वॉल्थम, एमए, संयुक्त राज्य अमरीका) का उपयोग कर निकाला जाता है. यह चुंबकीय कण प्रौद्योगिकी पर आधारित है और सेल / डीएनए बाध्यकारी, कई धोने कदम और डीएनए क्षालन के होते हैं एक स्वचालन डीएनए निकासी व्यवस्था है.
- डीएनए निष्कर्षण में इस्तेमाल किया किट किंगफिशर फ्लेक्स 24 डीएनए रक्त किट (Qiagen, जर्मनी) है.
3. डीएनए मात्रा और गुणवत्ता मूल्यांकन
जीनोमिक डीएनए की मात्रा, गुणवत्ता और अखंडता PicoGreen, स्पेक्ट्रोस्कोपी और वैद्युतकणसंचलन शामिल है कि विधि का एक संयोजन द्वारा मूल्यांकन किया गया.
- जीनोमिक डीएनए की एकाग्रता Nanodrop और PicoGreen मात्रा का ठहराव के द्वारा निर्धारित किया जाता है.
- पवित्रता Nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 260/280 अनुपात माप से निर्धारित होता है.
- नमूना (500 एनजी) भी डीएनए की अखंडता (गिरावट) का आकलन करने के लिए 1% agarose जेल पर लोड किया जाता है.
4. Genotypinजी Assays और गुणवत्ता नियंत्रण
- पांच P100_DNA और उनके इसी EDTA_DNA नमूने बेतरतीब ढंग से कस्टम Immunochip (इम्यूनो डीएनए विश्लेषण BeadChip) का उपयोग करते हुए आगे के विश्लेषण के लिए चुने गए हैं. Immunochip 196,524 बहुरूपताओं युक्त इंफिनियम जीनोटाइपिंग चिप है और immunogenetic पढ़ाई 5 के लिए बनाया गया है.
- प्रत्येक नमूने के लिए, डीएनए के 200 एनजी, खंडित परिलक्षित उपजी और उचित संकरण बफर में resuspended है.
- विकृत नमूने 16 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 48 डिग्री सेल्सियस पर Immunochips पर संकरित हैं.
- संकरण के बाद, Immunochips एकल आधार विस्तार प्रतिक्रियाओं और दाग के लिए कार्रवाई कर रहे हैं.
- immunochips तो Illumina Hiscan मनका सरणी पाठक और सामान्यीकृत मनका तीव्रता डेटा Illumina GenomeStudio सॉफ्टवेयर में लोड और जीनोटाइप में बदल जाता है का उपयोग imaged कर रहे हैं. जीनोटाइप GenomeStudio की autocalling कलन विधि का उपयोग करने को कहा जाता है. में गुणवत्ता नियंत्रणएक कॉल की दर <95% के साथ एकल nucleotide बहुरूपताओं के बहिष्कार (SNPs) के volves.
- एसएनपी कॉल दर immunochip परख क्षमता का एक उपाय के रूप में प्रयोग किया जाता है. यह एक स्वचालित जीनोटाइप असाइनमेंट प्राप्त करने के लिए पर्याप्त संकेत तीव्रता और गुणवत्ता प्राप्त है कि चिप (196,524 SNPs के प्रत्येक चिप पर इनकोडिंग) पर assays की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में गणना की है. उच्च गुणवत्ता डीएनए (260 / 1.8 की 280 अनुपात या उच्च और गिरावट की अनुपस्थिति) immunochip परख में शामिल HapMap नियंत्रण डीएनए के रूप में कम से कम एक ही कॉल दर हासिल करने की उम्मीद है. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए एक कॉल दर <95% प्रत्येक डेटा सेट में साथ SNPs के बहिष्कार शामिल है.
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Representative Results
डीएनए गुणवत्ता मूल्यांकन और एकाग्रता माप
P100_DNAs की पैदावार EDTA_DNAs (टेबल्स 1 और 2) के उन लोगों की तुलना में काफी कम थे. इसकी 260/280 अनुपात मूल्य के प्रतिनिधित्व वाले डीएनए पवित्रता P100_DNA और EDTA_DNA नमूना सेट (टेबल्स 1 और 2) दोनों के लिए समान है. डीएनए की गुणवत्ता नमूना के प्रत्येक सेट में कुछ गिरावट EDTA_DNA नमूनों में देखा जाता है, के रूप में (चित्रा 2) प्रकाश धब्बा ने संकेत दिया भीतर काफी समान है. गिरावट के अधिक लक्षण दिखाई कि EDTA_DNAs भी कम डीएनए एकाग्रता दिखाया.
जीनोटाइपिंग
EDTA_DNAs और P100_DNAs दोनों के लिए जीनोटाइपिंग कॉल दर की तुलना में थे. वे इसी तरह की कॉल दरों में सामने आए और दोनों आंतरिक HapMap नियंत्रण डीएनए (तालिका 3) के बराबर थे.
चित्रा 1. बफी कोट अलगाव.
तालिका 1. डीएनए नमूना उपज (PicoGreen) और अनुपात (NanoDrop).
| डीएनए यील्ड | डीएनए पवित्रता | |||
| नमूने | P100 | ईडीटीए | P100 | ईडीटीए |
| 1 | 135 | 340 | 1.79 | 1.9 |
| 2 | 119 | 344 | 1.85 | 1.89 |
| 3 | 57 | 129 | 1.88 | 1.88 |
| 4 | 159 | 640 | 1.86 | 1.88 |
| 5 | 140 | 430 | 1.86 | 1.88 |
| 6 | 150 | 673 | 1.86 | 1.9 |
| 7 | 139 | 425 | 1.74 | 1.88 |
| 8 | 118 | 240 | 1.87 | 1.86 |
| 9 | 51 | 86 | 1.87 | 1.83 |
| पी मूल्य | पी = 0.00221 | पी = 0.09836 | ||
तालिका 2. उपज और पवित्रता की तुलना (दो पूंछ, बनती नमूना टी परीक्षण).
| सेल दर जीनोटाइपिंग | ||
| नमूने | P100 | ईडीटीए |
| 1 | 97.9 | 97.5 |
| 2 | 97.9 | 97.8 |
| 4 | 97.4 | 97.5 |
| 7 | 97.5 | 98.2 |
| 8 | 97.9 | 98 |
| पी मूल्य | पी = 0.67970 | |
तालिका 3. जीनोटाइपिंग कॉल दर (दो पूंछ, बनती नमूना टी परीक्षण).
| नमूने | परतें | यील्ड (माइक्रोग्राम) | अनुपात (260/280) |
| बफी कोट | 150 | 1.86 | |
| आरबीसी | 4.13 | 1.73 | |
| P100_07 | बफी कोट | 139 | 1.74 |
| आरबीसी | 1.00 | 1.70 | |
| P100_08 | बफी कोट | 118 | 1.87 |
| आरबीसी | 3.72 | 1.78 | |
| P100_09 | बफी कोट | 51 | 1.87 |
| आरबीसी | 0.23 | 0.98 |
परिशिष्ट. लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) की परत में पाया डीएनए की मात्रा का मूल्यांकन.
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Discussion
कई मानव रोगों के आनुवंशिक कारण हैं और मानव रोग के आनुवंशिक आधार की खोज के एक बढ़ती हुई उच्च गुणवत्ता डीएनए की मांग. आनुवंशिक अध्ययनों में इस्तेमाल किया डीएनए का सबसे सामान्य स्रोत पूरे रक्त anticoagulated है. सबसे नैदानिक प्रयोगशालाओं प्ररूपी परिणाम जांच में पहले कदम के रूप में, जैव रासायनिक serologic, और वायरल परीक्षण करते हैं, क्योंकि रक्त अक्सर एक प्लाज्मा ट्यूब में एकत्र किया जाता है. प्लाज्मा के संग्रह के बाद, जमा हुआ रक्त अक्सर खारिज कर दिया है. इसलिए, डीएनए आनुवंशिक अध्ययन या परीक्षण का संचालन करने की जरूरत है, जब एक अतिरिक्त रक्त ड्रॉ में एक ही रोगी की आवश्यकता नहीं है. यह सफेद रक्त कोशिकाओं के रूप में खारिज कर जमा हुआ रक्त डीएनए का एक संभावित स्रोत का प्रतिनिधित्व करता है. इसलिए, प्लाज्मा ट्यूब से जमा हुआ रक्त का उपयोग अधिशेष रक्त आकर्षित या अतिरिक्त रक्त के लिए रोगी को याद करने की आवश्यकता के बिना, अधिक कुशलता से एकत्र रक्त के नमूने का उपयोग करने के लिए एक अवसर प्रदान करता है.
पूर्व के लिए विभिन्न तरीकोंजमा या पका हुआ खून के सफेद कोशिकाओं से पथ डीएनए 6-10 सूचित किया गया है. इन तरीकों की चुनौतियों से अधिकांश प्लाज्मा संग्रह ट्यूब की डिजाइन के साथ जुड़े थे. इससे पहले प्लाज्मा संग्रह ट्यूबों centrifuged जब, प्लाज्मा (विभाजक के ऊपर स्थित) से रक्त कोशिकाओं (विभाजक नीचे फंस) अलग करने के लिए एक बाधा का गठन किया है, जो एक जेल (जेल विभाजक) से बना एक विभाजक निहित. जेल सामग्री के साथ रक्त कोशिकाओं के प्रदूषण को रोकने के लिए, विभाजक पहले ध्यान से ट्यूब 11 से हटाया जाना चाहिए. यह कुशल डीएनए निष्कर्षण गारंटी करने के लिए रक्त का थक्का का विखंडन के बाद है. विखंडन प्रक्रिया अक्सर रक्त के नमूने का एक महत्वपूर्ण नुकसान और डीएनए उपज में कमी का परिणाम है. नमूना नुकसान को कम करने और प्रक्रिया में सुधार करने के लिए, एक छोटे ताकना जाल यंत्रवत् छोटे टुकड़े 12 में खून का थक्का तितर - बितर करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन विखंडन अभी भी प्रभावित डीएनए उपज और गुणवत्ता और ई थाउपक्रम तकनीशियन 13 से स्वास्थ्य के लिए खतरा गठन किया है.
बी.डी. बायोसाइंस से बी.डी. P100 ट्यूबों multicenter immunologic शोध अध्ययन 14 में मूल्यांकन प्लाज्मा संग्रह ट्यूबों के नवीनतम पीढ़ी के हैं. पिछले प्लाज्मा ट्यूब की तरह, वे प्लाज्मा प्रोटीन को स्थिर करने की जमावट और protease inhibitors रोकने के लिए anticoagulants होते हैं. बी.डी. P100 के ट्यूब के प्रमुख नवाचार प्रत्येक ट्यूब के अंदर यांत्रिक विभाजक (नहीं एक जेल विभाजक) में रहता है. यांत्रिक विभाजक भी centrifugation के बाद प्लाज्मा और सेल गोली के बीच एक शारीरिक बाधा प्रदान करता है, लेकिन जेल विभाजक के विपरीत, एक जेल से नमूना संदूषण का कोई खतरा नहीं प्रदान करता है. इस अध्ययन में लागू किया प्रोटोकॉल एक विखंडन शामिल नहीं है, इसलिए कोई भी स्वास्थ्य के लिए खतरा खतरा नहीं है.
डीएनए (डीएनए निष्कर्षण देखें) एक वाणिज्यिक किट प्रोटोकॉल का उपयोग, buffy कोट से निकाला गया था. बी.डी. P100 के ट्यूबों में जमा हुआ रक्त cryop थेडीएनए निष्कर्षण से पहले 3 से 4 महीने की अवधि के लिए आरक्षित. EDTA ट्यूब (EDTA_DNA) से निकाले डीएनए उनके इसी P100_DNA की उपज और गुणवत्ता के आकलन में एक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. पिछले अध्ययनों 12,13,15 से, EDTA_DNA नमूनों की पैदावार पिछले प्लाज्मा ट्यूब के खून से डीएनए की तुलना में काफी अधिक थे. इस अध्ययन में, प्रत्येक रोगी से एकत्र की एक ही राशि के पूरे रक्त के लिए, जमा हुआ रक्त की buffy कोट कम डीएनए (तालिका 2, पी = 0.00221) झुकेंगे. (देखें परिशिष्ट नई P100 प्लाज्मा नलियों में खून से डीएनए निष्कर्षण के दौरान, buffy तट से कुछ सफेद रक्त कोशिकाओं लाल रक्त कोशिकाओं की परत को खो रहे हैं (नीचे), लेकिन buffy कोट से उन लोगों की तुलना में डीएनए की तुच्छ राशि का प्रतिनिधित्व करता है तालिका). EDTA_DNAs साथ देखा उपज में भिन्नता भी P100_DNA यह निर्भर नमूना है कि सुझाव के साथ मजाक उड़ाया जाता है. अधिक मात्रा से नमूने सामान्य रूप से अधिक डीएनए और नमूने उपज होगाकम मात्रा और / या थोड़ा अपमानित डीएनए के साथ कम डीएनए उपज होगा.
Agarose जेल (चित्रा 2) पर विश्लेषण EDTA_DNAs उनके इसी P100_DNAs में नहीं देखा गिरावट के संकेत (धब्बा) बताते हैं कि पता चला. विशेष रूप से, कम उपज के साथ दो EDTA_DNA नमूने (EDTA_01053 और EDTA_06030) दूसरों की तुलना में अधिक धब्बा दिखा. उनके अध्ययन में, वाँग एट अल. 11 वृद्धि की भंडारण समय के साथ कम डीएनए उपज की सूचना दी. हमारे भंडार में सभी रक्त के नमूनों का ही भंडारण शर्त के अधीन थे और इस अध्ययन में इस्तेमाल नमूना सबसेट बेतरतीब ढंग से चयनित किया गया था, भंडारण लंबाई और हालत P100_DNAs और EDTA_DNAs बीच agarose जेल पर देखा अंतर के लिए खाते की संभावना नहीं है. केवल EDTA_DNAs शो गिरावट EDTA के ट्यूब में प्रोटीज अवरोधकों की कमी से जुड़ा हो सकता है कि इस तथ्य है.
P100_DNAs और EDTA_DNAs की पवित्रता काफी अलग नहीं थे ( इस्तेमाल किया नमूने सूजन आंत्र रोग के आनुवांशिक अध्ययन के लिए भर्ती किया गया. इसलिए, निकाले गए डीएनए नमूनों के प्रदर्शन की तुलना करने के लिए, immunochip 5 जीनोटाइपिंग परीक्षण मंच के रूप में चयनित किया गया था. immunochip immunogenetics 16,17 के लिए एक ठीक मानचित्रण जीनोटाइपिंग मंच के रूप में इस्तेमाल किया गया है. SNP जीनोटाइपिंग assays के जीनोम चौड़ा प्रकृति डीएनए प्रदर्शन के एक कड़े उपाय के रूप में इस्तेमाल किया गया था. सभी डीएनए परीक्षण और HapMap नियंत्रण के नमूने लिए औसत जीनोटाइपिंग कॉल दरों, सभी चिप्स के पार, रक्त संग्रह ट्यूबों दोनों से डीएनए के तुलनीय उत्कृष्ट प्रदर्शन दिखा रहा है, क्रमशः 97.76% और 97.4% थे ( समापन डीएनए प्लाज्मा प्रोटिओमिक्स पढ़ाई के लिए तैयार ही खून का नमूना से जीनोमिक परीक्षण की सुविधा बी.डी. P100 ट्यूब, का जमा हुआ रक्त से अलग किया जा सकता है. हमारे परिणाम P100 के ट्यूब के अनुसंधान उपयोगिता का विस्तार. P100 में एकत्र रक्त के सेलुलर सामग्री में डीएनए जीनोमिक विश्लेषण के लिए प्रयोग करने योग्य तथ्य यह है कि प्रोटिओमिक और जीनोमिक दोनों विश्लेषण प्रदर्शन किया जाएगा, जिसमें पढ़ाई के लिए नमूना अधिग्रहण को आसान बनाने में मदद कर सकते हैं. इसलिए, कम रक्त प्रत्येक मानव विषय से की जरूरत है और अध्ययन प्रायोजकों और कर्मचारियों के लिए एक संबद्ध लागत और प्रयास की बचत में सुधार हुआ है. प्रदर्शन के कई फायदे हैं:
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD P100 tubes | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTA tubes | BD Diagnostics | 367863 | |
| Sucrose | Sigma | S9378 | |
| Paper clip | Office product | ||
| 15 ml tube | Corning | 430052 | |
| Red blood cells (RBC) | Qiagen | 158389 (kit) | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml microtubes | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| Bead array reader | Illumina | NA | |
| GenomeStudio Software | Illumina | N/A |
References
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